Etapa 1: selección del medio de cultivo y dinámica de crecimiento de cada grupo bacteriano

Se utilizaron los medios: caldo nutritivo (CN) y caldo Luria-Bertani (LB) para las cuatro cepas de rizobacterias y un medio específico para cada género bacteriano; caldo King B (CK) para Pseudomonas y caldo triptona soya (TBS) para Serratia. Se emplearon frascos de vidrio con capacidad de 250 mL, a los cuales se les colocó un volumen de 150 mL de cada medio. Se tomó una asada de la cepa y se colocó en cada uno de los frascos en condiciones de asepsia en una campana de flujo laminar.

Los frascos fueron incubados en un agitador orbital Thermo Scientific™ MaxQ™ 40000^® a 180 rpm y una temperatura de 28 °C. El crecimiento bacteriano se cuantificó mediante densidad óptica, utilizando un espectrofotómetro marca Bio Tek modelo Synergy 2^® a una longitud de onda de 600 nm. Para esto se tomaron alícuotas de 200 µL por triplicado de cada uno de los cultivos bacterianos, se depositaron en cada uno de los pozos de una microplaca (Costar^® 3596, Corning Incorporated, NY) y se midió su densidad óptica; las muestras se tomaron a las 24, 48 y 72 h de incubación. Se estableció un experimento para cada género de bacterias (Pseudomonas o Serratia), donde se evaluó el crecimiento en tres medios de cultivo, esto en diseño experimental completamente al azar con 9 repeticiones por tratamiento.

Se realizó un análisis estadístico, mediante el paquete SAS para Windows (^{SAS Institute Inc. 2002}), donde la variable de estudio fue la densidad óptica. Se hicieron análisis de varianza y prueba de comparación de medias por Tukey (α= 0.05). Una vez seleccionado el medio de cultivo para cada género bacteriano, el siguiente paso fue conocer la dinámica de crecimiento de cada una de las cuatro cepas de rizobacterias. Para el género Serratia se utilizó el medio TBS y para el género de Pseudonomas el medio LB. La metodología utilizada para esta fase fue similar a la empleada para la selección de los medios de cultivo.

Las cepas se inocularon en los medios y se midió la densidad óptica cada cuatro horas por 48 h y finalmente una última lectura a las 72 h, dando un total de 14 lecturas. El experimento se estableció utilizando un diseño experimental completamente al azar. Los tratamientos fueron las 4 cepas de rizobacterias con 9 repeticiones. Las 2 cepas de Serratia se cultivaron en medio TBS y las 2 cepas de Pseudomonas en medio LB. La variable medida fue la densidad óptica. Los datos obtenidos fueron analizados mediante el paquete estadístico SAS para Windows (^{SAS Institute Inc. 2002}), realizando un análisis de varianza y prueba de Tukey (α= 0.05).

Etapa 2: elaboración de los biofertilizantes y supervivencia de las rizobacterias

La metodología que se empleó para la elaboración de las perlas fue la propuesta por ^{Bashan (1986)}, con algunas modificaciones. Se utilizaron los mismos medios de cultivo señalados arriba para preparar el inóculo de las cepas de rizobacterias. A frascos con 750 mL de caldo se les agregó alginato de sodio al 2% y se esterilizó a 18 lb por 18 min. Se inocularon tres asadas de la cepa bacteriana en los frascos y se incubaron en un agitador orbital Thermo Scientific™ MaxQ™ 40000^® a 180 rpm, a una temperatura de 28 °C por 48 h.

Las perlas fueron elaboradas utilizando una bomba peristáltica (Whatson-Marlow 120U/DV^®), para lo cual un extremo de la manguera de la bomba fue colocada dentro del frasco que contenía el medio de cultivo líquido y bombeado a 72 rpm, el otro extremo de la manguera se colocó encima de un vaso de precipitado de 2 L que contenía 1.5 L de una solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 0.1 M, en agitación constante en una plancha de agitación (Corning PC-420^®) donde se iban depositando las gotas que posteriormente formarían las perlas, para lo cual éstas se dejaron en la solución en agitación por un lapso de tres horas.

Trascurrido ese tiempo las perlas se enjuagaron tres veces con una solución salina (NaCl 0.85%) y se colocaron en un colador para quitar el exceso de humedad. Todo el proceso de la elaboración de las perlas se llevó a cabo en una campana de flujo laminar. Finalmente, las perlas se colocaron en bolsas ziploc estériles y se conservaron en refrigeración a 4 °C. En el caso del biofertilizante de turba, ésta se neutralizó con carbonato de calcio y una pizca de carbón activado con la finalidad de adsorber algún tóxico que pudiera liberarse. La turba se esterilizó en una autoclave a 18 lb, por intervalos de tres horas por tres días.

Trascurrido el tiempo de esterilización se colocó en un horno de secado (FELISA, modelo 242-A^®) a una temperatura de 72 °C por 48 h. Una vez estéril y seca la turba, se colocó 1 kg en una bolsa de plástico desinfectada y se le agregaron aproximadamente 100 mL de inóculo con una concentración de 10⁹ UFC mL^-1. La mezcla se homogenizó perfectamente, sin que se presentara saturación de humedad. Una vez impregnada la turba, se selló la bolsa y se incubó a 28 °C por 15 días (^{Ferrera-Cerrato et al., 1993}).

Trascurrido el tiempo de incubación se colocaron 100 g del biofertilizante en bolsas de polipropileno metálicas y se cerró al vacío con un sellador (Food Saber serie 3800^®) y se conservaron en refrigeración a 4 °C.

Se evaluó la vida de anaquel (supervivencia) de las bacterias en las perlas de alginato y en la turba una vez al mes, por un periodo de cinco meses. Para cuantificar la carga bacteriana se utilizó la técnica de dilución y conteo en placas, en el caso de perlas de alginato se colocó 1 g de éstas en un tubo de dilución que contenía 9 mL (dilución 10^-1) de una solución Buffer de fosfato (solución A (NaH₂PO₄) + solución B (NaPO4) al 0.1 M con pH 6) y se dejó en agitación por 24 h con la finalidad de disolver las perlas completamente.

Con respecto al biofertilizante de turba se pesó 1 g de éste y se colocó en un tubo de dilución que contenía 9 mL de agua destilada estéril (dilución 10^-1), el tubo se agitó por 40 min. En ambos casos, se tomaron 100 µL de la suspensión y se adicionaron a un tubo que contenía 900 µL de agua destilada estéril (dilución 10^-2), el tubo se agitó y a partir de esta dilución se realizaron sucesivas diluciones hasta 10^-9. Se tomó una alícuota de 100 µL de las diluciones 10^-7, 10^-8 y 10^-9 y se colocaron en el centro de las cajas de Petri con agar nutritivo las placas fueron rastrilladas con una varilla de vidrio e incubadas a 28 °C por 48 h. Este procedimiento se realizó por triplicado.

El experimento se estableció utilizando un diseño experimental completamente al azar. Los tratamientos fueron cuatro cepas de rizobacterias (CPAC53, CPPC55, P61 y OLsSf5) con tres repeticiones, tanto para las perlas de alginato como para la formulación de turba, dando un total de 12 unidades experimentales para cada formulación. La variable evaluada fue la supervivencia de las bacterias en las dos formulaciones. El conteo de las UFC fue expresado en unidades logarítmicas. Los datos obtenidos se analizaron mediante el paquete estadístico SAS para Windows (^{SAS Institute Inc. 2002}) y se realizó un análisis de varianza y prueba de Tukey (α= 0.05).

Etapa 3: establecimiento del ensayo en invernadero

Se utilizó un sustrato que contenía agrolita, peat moss y vermiculita en una relación 1:1:1. Se utilizaron contenedores de polipropileno con 30 cavidades. Para el biofertilizante de perlas de alginato los contenedores se cubrieron a la mitad de su capacidad con el sustrato. Se utilizaron 10 g de perlas por cada 100 g de sustrato, lo que correspondió a colocar 0.33 g por cavidad del semillero, después de colocar las perlas los contenedores fueron llenados en su totalidad con sustrato. En el caso del biofertilizante de turba, se mezclaron 10 g de la bioformulación con cada 100 g de sustrato. Las dos formulaciones contenían una concentración de 10⁹ UFC g^-1.

Se emplearon semillas de una variedad criolla de chile Poblano de la región de la Sierra Nevada, específicamente del municipio de San Matías Tlalancaleca, Puebla. Las semillas fueron proporcionadas por el Sr. Leopoldo Ramírez Morales, quien ha practicado un proceso de selección sobre su variedad durante los últimos 20 años. La variedad es representativa de la región dado que el Sr. Ramírez, surte de plántulas a la gran mayoría de los productores de esa área. El ciclo de la variedad desde el almácigo hasta la última cosecha es de aproximadamente siete meses.

Las semillas fueron desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 5 min y enjuagadas con agua destilada estéril cinco veces. Se coloraron dos semillas por cada cavidad del semillero. Las plántulas fueron regadas con agua destilada cada tres días y una vez por semana se aplicó solución nutritiva de Steiner al 10% (Ca (NO₃) 0.106 g, KNO₃ 0.0312, K₂SO₄ 0.0492 g, KH₂PO₄ 0.013 y mix de micronutrientes 0.017 L^-1), a todos los tratamientos incluyendo al testigo.

Después de 60 días las plántulas fueron cosechadas y se evaluaron las variables agronómicas: 1) número de hojas en cada plántula; 2) altura de las plántulas; 3) El área foliar se determinó con un medidor modelo LI-3100C marca Li-cor^®; y 4) biomasa seca, donde el material vegetal se secó en un horno marca FELISA, modelo 242-A^® por 48 h a 70 °C y se pesó en una balanza analítica marca Sartorius, modelo Analytic Ac 2105^®. También se realizó un análisis del contenido de nutrimentos: fósforo (P) y potasio (K) se determinaron utilizando un espectrofotómetro de emisión óptica con plasma de acoplamiento inductivo marca Varian modelo725-ES^® y el contenido de nitrógeno (N) se determinó por digestión húmeda mediante el método de Kjeldahl (^{Bremner, 1996}).

Los tratamientos utilizados fueron 4 cepas de rizobacterias en 2 bioformulaciones (perlas de alginato y turba); se incluyó un testigo sin inoculación, todos los tratamientos tuvieron 15 repeticiones y el diseño experimental usado fue bloques al azar. Los datos obtenidos de todas las variables estudiadas (número de hojas, altura, biomasa, área foliar, N, P, K) fueron analizados mediante el paquete estadístico SAS para Windows (^{SAS Institute Inc. 2002}), realizando un análisis de varianza y prueba de comparación de medias por Tukey (α= 0.05).

Selección del medio de cultivo y dinámica de crecimiento

Con respecto al crecimiento de las rizobacterias en los diferentes medios de cultivo se encontraron diferencias significativas (p≤ 0.01) en ambos géneros bacterianos. Las cepas del género Pseudomonas presentaron el crecimiento más alto en el caldo LB con 1.3 unidades de densidad óptica, mientras que las cepas del género Serratia en caldo TBS con un crecimiento de 1.4 unidades de densidad óptica a las 72 h respectivamente (Figura 1a y 1b).

Figura 1 Selección de medios de cultivo líquido (a y b). Las barras representan el promedio de nueve repeticiones y las letras diferentes indican diferencias significativas. CN= caldo nutritivo; TBS= caldo triptona soya; LB= caldo Luria Bertani y CK= caldo King B; y dinámica de crecimiento de las cepas en los medios seleccionados (c y d). Para ambos métodos se utilizó la técnica de densidad óptica, medida a 600 nm (OD). Tukey (α= 0 .05). 

La dinámica de crecimiento de las dos cepas de Pseudomonas se evaluó en el medio LB, el cual fue el mejor para este género bacteriano. Se observó que el crecimiento se incrementó de un valor de 0.3 unidades a las 4 h hasta un valor de 1 unidad de densidad óptica a las 8 h, este periodo se le conoce como fase exponencial, ya que en éste se alcanza la máxima velocidad de crecimiento. Después de lo anterior, se observó una fase pre-estacionaria entre las 8 y 24 h de cultivo, que es una fase de retardo del crecimiento, alcanzando un valor de 1.5 unidades de densidad óptica.

La fase estacionaria se presentó en el periodo de las 24 a 48 h, en este periodo ya no hubo crecimiento, y después de este tiempo el crecimiento disminuyó (Figura 1c). Para el caso de las cepas del género Serratia el medio de cultivo que se empleó fue el caldo TBS. Se observó una fase de crecimiento exponencial en el periodo de 0 y 8 h con 0.8 unidades de densidad óptica, seguida de la fase pre-estacionaria entre las 8 y 12 h con un valor alcanzado de 1.2 unidades de densidad óptica, mientras que la fase estacionaria se presentó entre las 12 h a las 44 h con un valor promedio de 1.3.

Unidades de densidad óptica en la cepa CPPC55 y de 1.6 unidades de densidad óptica en la cepa CPAC53 y finalmente después de las 48 h se presentó la muerte celular (Figura 1d). Pseudomonas y Serratia son dos géneros de bacterias altamente versátiles en la utilización de sustratos como fuente de carbono y no requieren vitaminas, lo que explica en gran parte su viabilidad en una variedad de medios de cultivo (^{Holt et al., 1994}). El género Serratia no requiere de muchos factores de crecimiento; puede crecer a temperaturas entre 10-36 °C, con pH de 5-9 y en presencia de NaCl (^{Grimont y Grimont, 1978}).

En este trabajo se observó que las cuatro cepas de rizobacterias crecen bien en los tres medios de cultivos empleados, aunque las dos cepas del género Pseudomonas alcanzaron su mayor crecimiento en caldo LB, y las dos cepas del género Serratia en caldo TBS (Figura 1). Esto indica que las rizobacterias utilizadas no son exigentes en sus requerimientos nutricionales, tal como lo señalan los autores antes citados.

El medio TBS se ha usado para la propagación de cepas del género Serratia en varias investigaciones, entre sus componentes se encuentra la peptona de caseína, peptona de soya, NaCl, KH₂PO₄ y glucosa, que favorece el desarrollo de las bacterias. Por ejemplo, ^{Czajkowski et al. (2012)} utilizaron este medio en la propagación de una cepa de Serratia plymuthica para emplearla como controlador de la pudrición blanda en cultivos de papa.

Con respecto a las dos cepas del género Pseudomonas el mayor crecimiento se obtuvo en caldo LB. Este medio está compuesto principalmente de triptona, extracto de levadura y NaCl, es uno de los más usados para el cultivo de especies bacterianas, debido a que es rico en nutrientes y es de fácil elaboración (^{Garboza et al., 2011}). El caldo nutritivo es uno de los medios de cultivo más utilizados para la activación y propagación de diferentes géneros bacterianos. Sin embargo, de los tres medios de cultivo utilizados en este estudio, el caldo nutritivo resultó poco eficiente para el crecimiento de las cepas de los géneros Serratia y Pseudomonas (Figura 1).

La selección de un medio de cultivo debe garantizar incrementos en los rendimientos de los procesos fermentativos de forma rápida y económica (^{Gómez y Batista 2006}). El costo económico de cada uno de los reactivos a utilizar es un punto a considerar. Se pueden reducir costos en la multiplicación de rizobacterias al remplazar insumos grado reactivo del medio de referencia por fuentes nutricionales alternativas como son los residuos agroindustriales (^{Rivera y Botía, 2008}) y extractos vegetales (^{Khalil et al., 2016}), que pueden ayudar a reducir costos.

Supervivencia de las rizobacterias en los biofertilizantes

El tiempo de almacenamiento de las perlas fue por 150 días. Las cuatro cepas presentaron diferencias significativas (p≤ 0.01) en la supervivencia durante el almacenamiento en las dos formulaciones. La carga bacteriana inicial de las cuatro cepas en las perlas de alginato fue de alrededor de 12 Log₁₀ UFC g^-1 y la población de casi todas permaneció casi sin cambios a lo largo de los cinco meses de almacenamiento, excepto la cepa CPAC53 que tuvo una ligera caída con un valor de 11.4 Log₁₀ UFC g^-1.

Con respecto al biofertilizante a base de turba, las dos cepas de Serratia presentaron una carga inicial superior a 12 Log₁₀ UFC g^-1 y las cepas de Pseudomonas tuvieron una carga inicial de alrededor de 11 Log₁₀ UFC g^-1. En esta bioformulación la caída de la población de las cuatro cepas después de cinco meses de almacenamiento fue más alta que en las perlas de alginato, alcanzando valores entre 10.1 a 9 Log₁₀ UFC g^-1, en donde la cepa OLsSf5 fue la que presentó la menor población. En general, la supervivencia fue mayor en perlas de alginato que en turba (Figura 2).

Figura 2 Evaluación de la vida de anaquel de las rizobacterias en los dos biofertilizantes (turba y perlas de alginato) conservadas en refrigeración durante cinco meses. Las barras representan el promedio de 15 repeticiones y las letras diferentes indican diferencia estadística significativa. Tukey (α= 0 .05). 

El alginato es el polímero con mayor potencial para la encapsulación de bacterias debido a que la cadena polimérica de ácidos manurónico y gulurónico se puede unir mediante iones de calcio para formar los geles. Esta conformación determina las propiedades del alginato tales como la solubilidad, la viscosidad y la capacidad de intercambiar iones con metales divalentes (Yabur et al., 2007; ^{De-Bashan y Bashan, 2008}). Las perlas de alginato son de fácil bio-degrabilidad e inocuas; además por sus propiedades permiten una elevada supervivencia y una gradual liberación de bacterias de Azospirillum en el campo (^{Bashan, 1998}; ^{De-Bashan et al., 2007}).

En el presente estudio la mayor supervivencia de las bacterias se logró con las perlas de alginato. Las características propias de las cepas es uno de los atributos que se tienen que considerar para elegir el acarreador ya que no todos los microorganismos son aptos para ser encapsulados. El uso de perlas de alginato húmedas no está reportado en otros estudios, por lo que esta investigación podría abrir la pauta para considerar esta formulación como una buena alternativa en la producción de biofertilizantes utilizando rizobacterias de los géneros Pseudomonas y Serratia.

Aunque Azospirillum es una de las bacterias más estudiadas y usadas en bioformulaciones (^{Fuentes-Ramírez y Caballero-Mellado, 2005}), también hay otras bacterias que se han utilizado. Por ejemplo, ^{Ivanova et al. (2005)} observaron que P. corrugata es más sensible al almacenamiento que Azospirillum, en perlas de alginato su carga bacteriana disminuyó hasta 10³ después de seis meses en almacén. En cambio, Azospirillum mantuvo una carga de hasta 10⁸ UFC. Este mismo comportamiento lo observaron ^{Trivedi et al. (2005)} con la cepa Bacillus subtilis.

La turba es un acarreador ideal, que aporta nutrientes a los microorganismos y posee una gran superficie específica, así como un alto poder de retención de humedad y capacidad de amortiguamiento, lo que proporciona a los microorganismos protección ante condiciones ambientales adversas en campo (^{De-Bashan et al., 2007}). Aparte de la turba, son varios los materiales que se pueden usar como soportes en las formulaciones, entre estos se encuentran: el bagazo, estiércol, compost, polvo de coco, vermicompost, salvado de arroz, perlita, fosfato de roca, carbón, lignita, bentonita, talco y arcillas (^{Albareda et al., 2008}; ^{Ardakani et al., 2010}; ^{Bashan et al., 2014}). De las cuatro cepas de rizobacterias utilizadas en esta investigación, S. plymuthica CPPC55 fue que la que presentó el valor más alto de viabilidad durante el periodo de almacenamiento.

Efecto de los biofertilizantes en plántulas de chile Poblano

Se presentaron diferencias estadísticas significativas (p≤ 0.01) entre las cepas de los dos biofertilizantes para las variables agronómicas evaluadas. Se observó que todos los tratamientos fueron superiores al testigo. Con respecto al área foliar los valores más altos se obtuvieron con las cepas CPAC53 y OLsSf5 en perlas de alginato húmedas con valores entre 18.3 y 18.2 cm², mientras que los valores más bajos se registraron en la cepa de OLsSf5 con 12.8 cm² en turba y el testigo con 12.6 cm². El mayor número de hojas promedio se presentó con la cepa CPAC53 en perlas de alginato y el menor número se obtuvo en el testigo.

El valor más alto de altura de las plántulas se presentó con las cepas CPAC53, CPPC55 y OLsSf5 en perlas de alginato húmedas con un promedio de 13.3 cm, y la más baja fue en el testigo con 10.4 cm. La biomasa seca más alta se presentó con las cepas CPAC53, P61 y OLsSf5 en perlas de alginato húmedas con valores entre 151.3 y 155.3 mg. El testigo tuvo una biomasa seca de sólo 91 mg (Cuadro 1). Con respecto a nutrimentos, el valor más alto de fósforo se presentó con la cepa OLsSf5 en perlas de alginato con 2.4 µg y el más bajo en el testigo con 1.7 µg.

Los valores más altos de potasio se presentaron con las cepas CPAC53 y OLsSf5 en perlas de alginato con promedio de 21 y el más bajo en el testigo con 14.9 µg. Finalmente el valor más alto de nitrógeno se presentó en las plántulas tratadas con la cepa OLsSf5 en perlas de alginato con 9.2 µg y el más bajo con la cepa CPPC 55 en la misma formulación con 7.2 µg, y el testigo con 6.7 µg (Cuadro 1). Las plántulas de chile Poblano presentaron una respuesta similar a la inoculación con las cepas de BPCV en ambas formulaciones, exceptuando la cepa OLsSf5 que presentó su mayor efecto sobre las plántulas cuando se aplicó en perlas de alginato.

En general, se encontró una tendencia de un efecto ligeramente superior sobre las plántulas cuando se utilizó la formulación de perlas de alginato en comparación al uso de turba. En el campo agrícola, los polímeros son ampliamente utilizados con diferentes fines, por ejemplo, para hacer más eficiente la aplicación de plaguicidas en el control de patógenos de los cultivos y como biorremediadores de suelos contaminados (^{Puoci et al., 2008}). En el caso de biofertilizantes en la agricultura el uso de perlas de alginato es una opción para la entrega gradual de los microorganismos en las raíces de las plantas (^{Bashan et al., 2014}).

En nuestro caso se usó la formulación de perlas de alginato en semilleros de chile Poblano, mostrando que es igualmente efectiva que la formulación de turba, con la ventaja que protege a las bacterias y las libera gradualmente. En chile Poblano son pocos los estudios que se tienen sobre la calidad de plántulas. La obtención de plantas sanas y vigorosas en almácigo es vital para que éstas puedan establecerse en campo después del trasplante, lo que puede lograrse con un correcto manejo del sustrato, la fertilización y sanidad de la semilla (^{García et al., 2011}).

La combinación de prácticas de manejo en almácigo y el uso de bioformulaciones conduce al éxito en el establecimiento de las plantas en campo. Sin embargo, el uso de inoculantes no se incluye en las prácticas de manejo de chile Poblano (^{Huerta et al., 2007}). El uso de estos en almácigo puede reducir costos de cultivo, combatir el daño por fitopatógenos y aumentar el vigor de plántulas.

El uso de los biofertilizantes no es actual, pero en el caso del cultivo de chile Poblano no se cuenta con biofertilizantes en el mercado específicos para este cultivo para promover el crecimiento y sanidad.

Las formulaciones de perlas de alginato húmedas y turba utilizadas promovieron significativamente el crecimiento de las plántulas de chile Poblano a nivel de almácigo. Estas formulaciones pueden ser una opción en la producción de plántulas de chile sanas y vigorosas para trasplante. En el caso de las perlas de alginato, estas liberan lentamente a las bacterias en el suelo, lo cual puede brindar una ventaja sobre la turba cuando se aplican a los cultivos.