Introducción

El frijol ayocote (Phaseolus coccineus L.) en México es utilizado principalmente como alimento e incluso en regiones de España, Holanda y Reino Unido su consumo ha sustituido al frijol (P. vulgaris L.) (^{Rodiño et al., 2006}). De las especies domesticadas del género Phaseolus spp., el frijol ayocote es la segunda especie en importancia económica (^{Al Hassan et al., 2016}). El cultivo tradicional del frijol ayocote ocurre en pequeña escala (^{Schwember et al., 2017}). En Centroamérica, este frijol se cultiva casi exclusivamente en asociación con maíz (Zea mays L.) (^{Vargas-Vázquez et al., 2007}).

Dado que los frijoles son un elemento importante en el auto abasto de poblaciones rurales, la variación en las formas de cultivo, uso y formas de preparación para consumo es amplia. El tizón común es una enfermedad con amplia distribución en México debido entre otras causas al monocultivo y al intercambio continuo y reutilización del grano como semilla, factores que incrementan la acumulación del inóculo primario y la dispersión de la bacteria causal (^{Acosta-Gallegos et al., 2013}). Por su parte, la antracnosis también muestra amplia distribución en nuestro país y puede ser una enfermedad devastadora si se siembran variedades susceptibles y, además, ocurren las condiciones climáticas favorables para su desarrollo (^{Rodríguez-Guerra et al., 2006}).

El frijol ayocote tiene características sobresalientes que pueden aprovecharse en programas de mejoramiento genético del frijol común tales como: sistema radical vigoroso, numerosos nudos florales, pedúnculos largos, además destaca por su resistencia a las enfermedades virales como el virus del mosaico común y el virus del mosaico dorado; las enfermedades bacterianas como el tizón de halo (Pseudomonas syringae Van Mall) y tizón común (Xanthomonas axonopodis pv phaseoli Smith.) (^{Duncan et al., 2006}; ^{Ruiz-Salazar et al., 2016}), así como las enfermedades fungosas como la antracnosis [Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magn) (teleomorfo Glomerella lindemuthiana Shear)] (^{Ruiz-Salazar et al., 2016}), presenta resistencia a factores abióticos como baja temperatura y salinidad (^{Rodiño et al., 2006}; ^{Al Hassan et al. 2016}).

El uso de la resistencia genética simple y/o múltiple a las enfermedades de importancia económica en frijol se soporta con la búsqueda constante de nuevas fuentes de resistencia, su incorporación a los programas de cruzamiento, evaluación y selección de germoplasma segregante en condiciones de campo y/o controladas; y la obtención germoplasma con resistencia a dichos factores adversos, que además muestre rendimientos de grano altos y con estabilidad en el rendimiento y calidad del grano superior (^{Acosta-Gallegos et al., 2007}; ^{Anaya-López et al., 2015a}).

El mejoramiento genético identifica y selecciona genotipos con base en fenotipos y la posterior introgresión de los caracteres deseados para el desarrollo de germoplasma superior. Así se han mejorado prácticamente todos los rasgos agronómicos importantes: rendimiento y calidad del grano; fenología; resistencia a enfermedades, plagas, sequía o salinidad. El proceso puede prolongarse por varios años dependiendo de la genética del rasgo y la respuesta a la selección. La selección asistida por marcadores moleculares (SAMM) podría reducir tiempo y costos del proceso (^{Bernardo, 2008}; ^{Collard y Mackill, 2008}; ^{Xu y Crouch, 2008}).

La SAMM permite identificar con rapidez germoplasma que pueda contribuir al mejoramiento de especies cultivadas de Phaseolus spp. (^{Svetleva et al., 2003}). A diferencia de países como Estados Unidos de América, donde la SAMM apoya y acelera la incorporación de genes en el germoplasma de interés (^{Miklas et al., 2006}), en México, solo se consigna una variedad liberada bajo dicho esquema (‘Dalia’) (^{Acosta-Gallegos et al., 2014}), con resistencia a BCMV y BMCNV (virus del mosaico común del frijol y raíz negra o necrosis). ^{Duncan et al. (2012)} indicó; sin embargo, que utilizar un solo SCAR no es suficiente para proveer suficiente resistencia a un patógeno, sugiriendo dos o más SCARs bajo un esquema de piramidación de genes de resistencia (^{Anaya-López et al., 2015a}, ^b).

El objetivo de esta investigación fue determinar la resistencia o susceptibilidad a dos patógenos importantes de Phaseolus: tizón común [Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith)] y antracnosis [Colletotrichum lindemutianum Sacc. & Magn (anamorfo Glomerella lindemuthiana Shear)] en base a la identificación de secuencias caracterizadas de regiones amplificadas (SCARs).

Materiales y métodos

Extracción de ADN

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional (CBG-IPN) en Reynosa, Tamaulipas donde se analizaron 117 accesiones de P. coccineus L. colectadas en la Subprovincia Carso Huasteco de Puebla, más cinco accesiones empleadas como grupo testigo (Cuadro 1), la extracción del ADN se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de ^{Doyle y Doyle (1987)}.

A partir de las secuencias reportadas por el programa de mejoramiento de frijol (^{BIC, 2010}) se seleccionaron diez marcadores SCAR de los cuales seis detectan secuencias de genes que confieren resistencia a tizón común (SAP6, BAC6, SU91, LG5, R7313 y R4865), y cuatro a la antracnosis (SAS13, SBB14, SAB3 y SH18) en frijol (Cuadro 2). Las amplificaciones se llevaron a cabo mediante un termociclador modelo GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems⁽) de acuerdo con las indicaciones citadas para cada uno de los marcadores SCAR (^{BIC, 2010}).

Resultados y discusión

En este estudio, los SCARs con mayor frecuencia de amplificación fueron SAS13 y SBB14 con 89 y 74%, respectivamente, en el total de las accesiones evaluadas. El germoplasma de Zacapoaxtla y Tlatlauquitepec, presentó las frecuencias de detección de SCARs de resistencia a antracnosis (34 de 38 accesiones en Zacapoaxtla y 17 de 18 en Tlatlauquitepec para SAS13; 30 de 38 y 10 de 18 para SBB14), lo que sugiere que estas accesiones son candidatas para usarse como progenitores en el mejoramiento genético de Phaseolus.

A la fecha no existían reportes de la identificación de germoplasma resistente a la antracnosis en P. coccineus L. mediante la detección de SCARs como SAS13 y SBB14, dado que éstos sólo se han utilizado en P. vulgaris, pero si se habían identificado SCARs de resistencia a tizón común tales como SAP6, BAC6 o SU91 (^{Ruiz-Salazar et al. 2016}). De las 10 secuencias genómicas SCAR probadas, sólo siete amplificaron productos de PCR en el germoplasma de frijol ayocote evaluado.

Los SCARs SAB3, SH18 y R7313 no amplificaron en ninguna accesión. Las secuencias SAS13 y SBB14 fueron seguidas, en cuanto a mayor frecuencia de amplificación por BAC6 (74%) y SU91 (42%), SCARs relacionados con la resistencia al tizón común (Cuadro 3). Las localidades que presentan mayor número de accesiones con SCARs para tizón común corresponden a Zacapoaxtla y Tlatlauquitepec (25 de 38 accesiones y 11 de 18 accesiones para BAC6; para SU91 17 de 38 accesiones y 6 de 18 accesiones, respectivamente) (Cuadro 3). La mayor proporción de marcadores SCAR en germoplasma de Zacapoaxtla y Tlatlauquitepec coincide para el caso de tizón común, aunado a la identificación de SCARs asociados a la resistencia a virosis (virus del mosaico común y del mosaico dorado) y mancha angular (Phaeoisariopsis griseola) (^{Ruiz-Salazar et al. 2016}).

Se detectaron varias accesiones que cuentan con al menos cinco SCARs de resistencia, lo que pone de manifiesto la importancia de estas accesiones para mejoramiento genético en frijol común. Este germoplasma tiene mayor posibilidad de aprovecharse como fuente de resistencia múltiple a enfermedades en Phaseolus (^{Rodríguez-Guerra et al., 2006}).

A pesar de las altas frecuencias de detección de SCARs en ayocotes de localidades específicas del Carso Huasteco de Puebla, debe considerarse que además de la ratificación de la resistencia efectiva en condiciones de campo en ocasiones dicha resistencia puede comportarse inestable, en virtud de la alta especificidad de la interacción entre los genotipos del patógeno y del hospedante (^{Rodríguez-Miranda y Rosas-Sotomayor, 2010}).

Sin embargo, es notable identificar germoplasma que detenta alta frecuencia de SCARs asociados a la resistencia a dos enfermedades importantes en el centro de México, lo que sugiere que ocurren altas presiones de selección por las condiciones ambientales favorables para la mayor incidencia de enfermedades y de inóculo primario y mayor patogenicidad (^{Francisco-Francisco et al., 2013}; ^{Rodríguez-Guerra et al., 2006}) han obligado a los agricultores de la región a seleccionar empíricamente por resistencia a enfermedades y por consiguiente, han conseguido el incremento de la frecuencia de genes de resistencia en las mismas.

México se considera centro de origen y diversidad del frijol y también los patógenos causantes de sus enfermedades exhiben amplia diversidad patogénica, como es el caso de la antracnosis (^{Rodríguez-Guerra et al., 206}) o tizón común (^{Prudencio-Sains et al., 2008}), Desafortunadamente, en el caso de tizón común sólo se asume la existencia de dicha variabilidad, pero no se tiene información actualizada sobre su cantidad y distribución en las regiones frijoleras de México (^{Navarrete y Acosta, 2000}; ^{Prudencio-Sains et al., 2008}).

En el caso de la antracnosis se tiene una perspectiva más completa, pues se consignan más de 100 patotipos en el mundo, con al menos 54 presentes en México (^{Rodríguez-Guerra et al., 2006}). La amplia variabilidad genética de los agentes causales de ambas enfermedades dificulta el desarrollo de variedades resistentes. También, por lo antes indicado es común observar que variedades con resistencia en una región, sean susceptibles en otra (^{Acosta-Gallegos et al., 2013}).

Las fuentes de resistencia genética al tizón común se han identificado en P. vulgaris, P. acutifolius y P. coccineus. Sin embargo, la mayoría de los genes de resistencia se heredan como loci de caracteres cuantitativos (QTL) y por consiguiente, exhiben variación en sus efectos genéticos debido a que están influenciados por el ambiente (^{Kelly et al., 2003}; ^{Miklas et al., 2006}; ^{Duncan et al., 2007}). Para antracnosis, se identificó a un grupo de 21 genotipos con características diversas en cuanto a su base genética, color de grano, hábito de crecimiento y respuesta a diferentes patotipos de antracnosis en México (^{González-Chavira et al., 2004}).

Entre ellos, destacan Pinto Villa y Bayo Mecentral 90, liberados comercialmente con resistencia a la antracnosis y que se han cultivado en diferentes regiones y condiciones en México (^{Rodríguez-Guerra et al., 2006}). La mayoría de los estudios se han enfocado en la identificación de marcadores moleculares ligados a genes con efectos mayores (monogénicos) en antracnosis (^{Miklas, 2002}). Por ejemplo, SCAR SAS 13 para antracnosis está ligado al gen de resistencia Co-4² que se ubica en el grupo de ligamiento 8, mientras que el SU91 es una región genómica QTL asociada con resistencia a tizón común y también se localiza en el grupo de ligamiento 8.

Entonces ambos marcadores podrían ser más efectivos en el mejoramiento al tener mayor probabilidad de co-segregar juntos en poblaciones de frijol segregantes. ^{Emmalea y Kelly (2004)} detectaron resistencia a 33 de 34 patotipos de C. lindemuthianum de nueve países de América con el uso del SCAR SAS13, en virtud de que Co-4² se detectó primero en la variedad diferencial Tu y también, en G-2333. Esta última, también denominada ‘Colorado de Teopisca’ es originaria de Chiapas, México, fue resistente a 380 aislamientos de antracnosis provenientes de once países de Latinoamérica por contar con los genes Co-4², Co-5 y Co-7 (^{Pastor-Corrales et al., 1994}; ^{Vallejo y Kelly, 2009}).

Los SCARs SAP6, SU91 y LG5, a pesar de estar ubicados en grupos de ligamiento distintos, pueden aplicarse en la búsqueda de resistencia al tizón común. ^{Ibarra-Pérez y Kelly (2005)} asociaron SU91 a la resistencia en campo, demostrando las ventajas que podría proveer la SAMM para detectar resistencia a enfermedades en Phaseolus. La SAMM, en el desarrollo de germoplasma mejorado con resistencia a enfermedades, ha tenido éxito porque permite la selección indirecta de características deseables en comparación con las técnicas convencionales.

^{Park y Yu (2004)} identificaron el SCAR SAS13 (ligado al gen Co-4²,0.39 cM) en las líneas de frijol H4514 Navy, H4628 Dark Red Kidney, H4642 Navy y H4836 Dark Red Kidney, obteniendo un incremento en la resistencia antracnosis de 43% (H4642 Navy), en comparación con H4628 (29%), H4514 (7%) y H4836 (7%), que resultaron susceptibles. ^{Mukeshimana y Kelly (2003)} estudiaron germoplasma de frijol común de Ruanda y solo detectaron el SCAR SH18 en la línea RWV167.

Por su parte, ^{Miklas (2002)} registró bajos niveles de resistencia a tizón común en frijol ayocote, pero altos niveles de resistencia en frijol tépary (P. acutifolius A. Gray) con el SCAR R7313, mismo que no amplificó en el germoplasma de este trabajo. Según ^{Márquez et al. (2007)}, dicho SCAR sólo se ha detectado en la línea XAN159 y en frijol Tépary. Dada la importancia económica del tizón común, deben desarrollarse en el corto plazo líneas que presenten espectros amplios de resistencia a dicho patógeno.

Las accesiones con hasta cinco o seis secuencias SCAR incluyen accesiones precoces y tardías a floración y madurez, así como diversos colores de testa, tamaño de vaina y semilla, de manera que no se encontró relación entre mayor presencia de SCARs con alguna característica morfológica en particular del germoplasma de frijol ayocote del Carso Huasteco (^{Prudencio-Sains et al., 2008}; ^{Ruiz-Salazar et al., 2016}). ^{Bitocchi et al. (2017)} sugieren que la domesticación actúa sobre el incremento de la diversidad funcional en loci particulares, los cuales probablemente controlan rasgos relacionados con la expansión y adaptación a nuevas condiciones agroecológicas (Cuadro 4).

En el mediano y largo plazos se vislumbran varias opciones en el mejoramiento genético del frijol en México, asistido por Biotecnología. En principio, debe mantenerse la estrategia de manejar dos o más SCARs a la vez o, mejor aún, enfatizar estrategias de piramidación de genes de resistencia (^{Anaya-López et al., 2015a}, ^b). También, no debe soslayarse que la eficiencia de la SAMM puede afectarse por el grado de dominancia del marcador, el tipo de ligamiento entre marcadores moleculares y rasgos de interés, la necesidad de desarrollar pruebas de progenie para corroborar la resistencia y los cambios en la especificidad de los marcadores (tipos comerciales de grano y/o acervos genéticos, por ejemplo) (^{Bello et al., 2014}).

Finalmente, la biotecnología progresa día a día, se desarrollan nuevas estrategias de marcadores moleculares, que para el caso de México deben evaluarse y validarse. Se trabaja con estrategias de secuenciación de nueva generación que aprovechan diferentes tipos de polimorfismos, la combinación del análisis de segregantes y sus perfiles transcripcionales, el análisis de segregantes ‘in silico’ y la estructuración de plataformas de alto rendimiento para el análisis genómico integral (BeanCAP, Langebio) (^{Bello et al., 2014}; ^{Bolger et al., 2014}; ^{Mukeshimana et al., 2014}; ^{Viteri et al., 2014}; ^{Saburido-Álvarez y Herrera-Estrella, 2015}).

Conclusiones

El germoplasma de frijol ayocote del Carso Huasteco de Puebla analizado con marcadores del tipo SCAR presentó regiones asociadas con genes de resistencia a tizón común (X. axonopodis pv. phaseoli) y a antracnosis (C. lindemuthianum), donde las accesiones de Zacapoaxtla y Tlatlauquitepec son las que cuentan con mayor frecuencia de estos marcadores.