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Introducción
Un factor importante para la seguridad alimentaria es la adecuada conservación de los recursos genéticos disponibles y la preservación de la diversidad vegetal. La conservación de recursos genéticos puede realizarse por estrategias a corto o largo plazo. Una de estas estrategias a largo plazo es el uso de procedimientos criogénicos, los cuales involucran el almacenamiento de materiales vegetales como lo son maíz (Zea mays) frijol ñame (Sphenostylis stenocarpa), caupí (Vigna unguiculata), maní bambara (Vigna subterranea), soya (Glicine max), palma aceitera (Elaeis guineensis), cacao (Theobroma cacao), coco (Cocos nucifera), aguacate (Persea americana), mango (Mangifera indica) y café (Coffea spp.) entre otras especies (Sánchez-Chiang y Jiménez, 2010).
Este almacenamiento se realiza a temperaturas ultra bajas (-196 °C) utilizando nitrógeno líquido (NL) (Day et al., 2008; Hamilton et al., 2009). A esta temperatura todas las funciones celulares se suspenden y por lo tanto el tejido puede ser almacenado sin cambios o deterioro por largos periodos (Kaczmarczyk et al., 2012). En Solanum tuberosum se han probado exitosamente diversos métodos criogénicos, como encapsulación-deshidratación, vitrificación y D-crioplaca (Hao et al., 2002; Halmagyi et al., 2005; Hirai, 2011; Yamamoto et al., 2015). Wang et al. (2006), propusieron el uso de métodos criogénicos para la conservación a largo plazo de accesiones de papa y para la eliminación de virus.
Sin embargo, la respuesta fisiológica a la criogenia estará en función del genotipo, siendo necesaria la optimización de los métodos para incrementar la sobrevivencia (Rivera et al., 2008). Durante criogenia los tejidos celulares son susceptibles a diversos tipos de estrés como, mecánico, osmótico y temperatura, los cuales conducen a un estrés oxidativo. (Baek y Skinner, 2012). Exposiciones a temperaturas extremas como frio (0-20 °C) o congelamiento (<0 °C) resultan en la disminución de la sobrevivencia (Chinnusamy et al., 2007), produciendo daño oxidativo (Horváth et al., 2007).
La formación de especies reactivas de oxígeno (EROS) en criogenia puede ocurrir durante varios de los pasos involucrados, (Kaczmarczyk et al., 2012). Se ha demostrado que la adición de antioxidantes exógenos como: ácido ascórbico, vitamina E y glutatión en zarzamora y cítricos durante la crioconservación, resultó en una mayor supervivencia (Wang and Deng, 2004; Uchendu et al., 2010). Las plantas poseen sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para resistir el estrés, enzimáticos como catalasa (CAT), peroxidasa (POX), súper óxido dismutasa (SOD) y no enzimáticos como el ácido ascórbico, glutatión y α tocoferol (Gill and Tuteja, 2010).
Se ha reportado que el ácido salicílico participa en la señalización de la actividad antioxidante en papa bajo temperaturas extremas (Mora-Herrera et al., 2005; Aguilar-Camacho et al., 2016). El ácido salicílico (AS) induce un incremento de enzimas antioxidantes durante periodos de pre-aclimatación a bajas temperaturas en plantas tratadas (Sasheva et al., 2010; López-Delgado et al., 2018). Mora-Herrera y López-Delgado (2006), encontraron que el AS induce tolerancia a temperatura de congelación (-6 °C) en papa. El AS también ha sido probado en criogenia en diversas especies, induciendo tolerancia al estrés por congelamiento (Wang and Valkonen, 2009b; Li et al., 2011; Pathirana et al., 2016).
En ejes embrionarios de Persian lilac (Melia azedarach L.) reportaron que el AS incrementó significativamente los porcentajes de viabilidad después de ser sometidos a crioconservación (Bernard et al., 2002). El objetivo de este trabajo fue probar el efecto potencial del AS en el incremento de la supervivencia y respuestas de crecimiento en yemas de papa sometidas a proceso criogénico.
Materiales y métodos
Plantas de Solanum tuberosum L. del clon avanzado 06-27 con tolerancia a tizón tardío del Banco de Germoplasma in vitro del Laboratorio de Fisiología y Biotecnología de papa del INIFAP en Metepec Estado de México, México, fueron seleccionadas con base en su baja tolerancia a criogenia observada en trabajos preliminares del laboratorio. Las plantas fueron incubadas por 28 días en medio de propagación MS (Murashige y Skoog, 1962) bajo tratamiento de AS, 0, 10-6 y 10-5 M (Mora-Herrera et al., 2005; Aguilar-Camacho et al., 2016). Yemas nodales (1-2.5 mm) de dichas microplantas se evaluaron bajo las siguientes condiciones.
efecto de AS en la regeneración de plantas posterior al tratamiento: veinte yemas se subcultivaron a medio MS sin AS y se incubaron por 15 días, para evaluar supervivencia, peso fresco, altura de la planta y longitud de raíz. La supervivencia se evaluó considerando oxidación y turgencia.
criogenia: veinte yemas se subcultivaron a medio MS sin AS y se incubaron por 3 días, para ser sometidas a criogenia. El método criogénico utilizado fue Deshidratación-crioplaca (D-crioplaca) (Yamamoto et al., 2015), modificado por Arizaga et al. (2017) el cual consiste en los siguientes pasos.
un volumen de 2 µL de alginato de sodio (2% p/v alginato de sodio/0.4 M de sacarosa en una solución basal de medio MS), se colocó en cada uno de los 10 pozos de una crioplaca (7 x 37 x 5 mm).
cada una de las yemas fueron transferidas individualmente a cada uno de los pozos de la crioplaca, para posteriormente cubrirlas con la solución de alginato de sodio.
la crioplaca con las yemas se cubrió con una hoja estéril de papel BEMCOT (7 x 30 mm).
se agregó 1 mL de solución de cloruro de calcio (0.1 M de cloruro de calcio/0.4 M de sacarosa en solución basal de MS) hasta cubrir la crioplaca. La polimerización del alginato de sodio/cloruro de calcio se completó después de 15 min a temperatura ambiente, eliminando el exceso de solución de cloruro de calcio.
la crioplaca con las yemas y el papel adherido se transfirieron a una solución de carga (SC) (2 M de glicerol/1 M de sacarosa en solución basal de MS), durante 45 min, se eliminó el exceso de SC.
la crioplaca con las yemas y el papel adherido se transfirieron a una caja petri con 35 g de sílica gel para el proceso de deshidratación, durante 90 min a 24 °C.
después de la deshidratación, las crioplacas se transfirieron a criotubos y se sumergieron directamente en nitrógeno líquido (NL) durante 60 min.
las crioplacas fueron retiradas del NL y se transfirieron a criotubos con 2 mL de solución de sacarosa (1 M en medio basal MS) durante 15 min a temperatura ambiente.
Las yemas unidas al papel Bemcot se retiraron de la crioplaca y se colocaron en cajas petri con medio MS durante 24 h.
posteriormente se eliminó la capsula de alginato de sodio dejando expuesta la yema, la cual se subcultivo a medio MS fresco.
15 días posteriores al subcultivo, se evaluó la supervivencia de las plantas regeneradas, considerando vivas aquellas que reanudaron su crecimiento; así como la formación de callo y longitud de raíz (n= 8-20).
El análisis estadístico se realizó por medio de análisis de varianza (Anova) y prueba de Duncan (Duncan, 1955) en todos los experimentos, mediante el programa Statgraphics Centurion XVI. El nivel de confiabilidad establecido fue de p< 0.05. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Resultados y discusión
Efectos del AS en la regeneración de plantas posterior al tratamiento
Después del tratamiento de AS en las microplantas tratadas con AS 10-6 y 10-5 M, se observaron respuestas fisiológicas como mayor supervivencia, longitud de raíz y altura de la planta. Un incremento significativo en la supervivencia de 2.04 y 1.66 veces respectivamente respecto al testigo (Figura 1).
Variables evaluadas 15 días posteriores al subcultivo. Datos obtenidos de 3 experimentos (n= 20). Datos analizados con Anova y prueba de Duncan (p< 0.05). Letras diferentes indican diferencias significativas respecto al testigo.
Figura 1 Efecto del AS en la supervivencia del clon de papa 06-27 posterior al tratamiento.
Efectos similares en el incremento de supervivencia por AS se han encontrado en diversas especies al utilizarlo en diferentes concentraciones, como en Astragalus adsurgens (1.64 veces) (Luo et al., 2001) y Coffea arabica (1.57 veces) (Quiroz-Figueroa et al., 2001).
Las microplantas pretratadas con AS 10-6 y 10-5M mostraron un incremento significativo en la longitud de raíz de 3.28 y 2.87 veces respectivamente, así como en la altura de la planta de 2.6 y 1.87 veces respecto al testigo (Figuras 2a y 2b).
Variables evaluadas 15 días posteriores al subcultivo, datos obtenidos de 3 experimentos (n= 20) y analizados con Anova y prueba de Duncan (p< 0.05). Letras diferentes indican diferencias significativas respecto al testigo.
Figura 2 Efecto del AS en el crecimiento del clon de papa 06-27 posterior al tratamiento. a) longitud de raíz; b) altura de la planta; y c) peso fresco.
Los resultados obtenidos en esta investigación son de alto interés, debido a que un mayor desarrollo de la raíz es importante para el establecimiento tanto en condiciones in vitro como ex vitro de cualquier especie, debido a que está directamente relacionado con la absorción de nutrientes y a su vez induce incremento en el crecimiento (Ruiz, 2000; Selles et al., 2003; Callejas-Rodríguez et al., 2012).
Lo anterior coincide con lo reportado por Larqué-Saavedra y Martín-Mex (2007), ya que encontraron un incremento de densidad y longitud de raíz de plantas tratadas con AS. De acuerdo a Sakhabutdinova et al. (2003), tratamientos de AS pueden incrementar la división celular en las raíces de las plántulas aumentando su crecimiento general, lo anterior puede estar relacionado con el efecto del AS sobre el incremento de la longitud de raíz observado en este trabajo en microplantas de papa (Figura 2a).
Otros trabajos que concuerdan con los resultados obtenidos en esta investigación correspondientes a los efectos de AS en longitud de raíz y altura de la planta (Figura 2a, 2b ), se han reportado en diferentes cultivos tales como Hibiscus (variedades acetocela y moscheutos) (Sakhanokho and Kelley, 2009), maíz (Gunes et al., 2007), soya (Gutiérrez-Coronado et al., 1998) y trigo (Shakirova et al., 2003). Microplantas pretratadas con AS 10-6 y 10-5 M mostraron un incremento significativo en peso fresco de 2.58 y 1.96 veces respectivamente, en comparación con el testigo (Figura 2c). Páez-García et al. (2015), mencionan que la aplicación de AS induce un incremento de la biomasa debido a un mayor desarrollo en el sistema radical, lo que conlleva a una mejor absorción de agua y nutrientes.
Criogenia
Las microplantas que reanudaron su crecimiento proveniente de los tratamientos de AS 10-6 y 10-5 M mostraron un incremento en la supervivencia a criogenia de 3.21 y 2.17 veces respectivamente, respecto al testigo (Figura 3).
Variables evaluadas 15 días posteriores al subcultivo. Datos obtenidos de 3 experimentos (n= 8-20) y analizados con Anova y prueba de Duncan (p< 0.05). Letras diferentes indican diferencias significativas respecto al testigo.
Figura 3 Efecto del AS en la supervivencia del clon de papa 06-27 después de criogenia.
Dichos resultados contrastan con los valores obtenidos por Rivera et al. (2008), quien obtuvo hasta 52% de sobrevivencia en ausencia de pretratamientos de AS. Los resultados observados pueden relacionarse con una reducción del estrés oxidativo por efecto de AS como ha sido demostrado en papa bajo diferentes tipos de estrés, como mayor supervivencia bajo termoterapia (hasta 2 veces) (Aguilar-Camacho et al., 2016).
Mayor peso de tubérculo en plantas infectadas con fitoplasma (1.88 veces) (Sánchez-Rojo et al., 2011), especialmente mayor supervivencia a temperaturas bajas (1.77-2.35 veces) (Mora-Herrera et al., 2005; López-Delgado et al., 2018). Después del proceso criogénico se observó ausencia de callo en las microplantas provenientes de ambos tratamientos de AS mientras que el testigo presentó un 68% de formación de callo sin la formación de brote de tallo (Figura 4).
Evaluaciones realizadas 15 días posteriores al proceso criogénico. Datos obtenidos de 3 experimentos (n= 8-20). Datos analizados con Anova y prueba de Duncan (p< 0.05). Letras diferentes indican diferencias significativas respecto al testigo.
Figura 4 Efecto del AS en el desarrollo del clon de papa 06-27 después de criogenia. Formación de callo sin desarrollo de brote de tallo.
Durante la regeneración de plantas después de las técnicas criogénicas, es muy deseable una regeneración directa sin la formación de callo, debido que asegura la estabilidad genética de las plantas obtenidas (Reed, 2008). Los resultados en esta investigación demuestran el potencial del AS para incrementar la supervivencia en criogenia en genotipos de papa que presentan baja supervivencia en dichos procesos además de prevenir la formación de callo en la regeneración, ya que se reduce el riesgo de variación somaclonal, favoreciendo la conservación de las características fenotípicas y genotípicas del material vegetal.
Aunado a la ausencia de callo en los explantes regenerados, se obtuvo un incremento significativo en la longitud de raíz en plantas pretratadas con AS 10-6 y 10-5 M de 3.35 y 2.36 veces respectivamente después de criogenia (Figura 5).
Evaluaciones realizadas 15 días posteriores al proceso criogénico, con datos obtenidos de 3 experimentos (n= 8-20) y analizados con Anova y prueba de Duncan (p< 0.05). Letras diferentes indican diferencias significativas respecto al testigo.
Figura 5 Efecto del AS en el desarrollo del clon de papa 06-27 después de criogenia. Formación de raíz.
En comparación con el testigo, el éxito de una óptima regeneración después de la exposición a nitrógeno líquido se basa en un estado fisiológico y morfológico adecuado del explante que fue sometido al método criogénico (Engelmann et al., 2008).
Pretratamientos con AS pueden ser una importante herramienta para una mejor supervivencia a técnicas de criopreservación o crioterapia en papa, en genotipos con baja supervivencia a temperaturas ultra bajas ya que es una molécula señalizadora de inducción de tolerancia al estrés y reguladora del crecimiento en plantas (Horváth, 2007), además que interviene en el desarrollo de raíces en condiciones de estrés por bajas temperaturas (Huang y Villanueva, 1993; Melkonian et al., 2004).
Conclusiones
En esta investigación se observó el efecto del AS como inductor de tolerancia a temperaturas ultra bajas empleadas en procesos criogénicos en plantas de papa que presentan baja supervivencia a criogenia, aumentando los porcentajes de supervivencia.
Aunado a ello también existe un efecto promotor del AS en el desarrollo de los explantes sometidos al proceso criogénico ya que se obtuvo un incremento significativo en el desarrollo de las raíces de dichos explantes después de su regeneración. AS evitó la formación de callo lo cual es un factor importante para mantener la estabilidad genética en cultivos como Solanum tuberosum.
