Obtención de plantas

La investigación es continuación del trabajo de ^{Cruz-García et al. (2017)}, que se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales e invernaderos del Instituto Tecnológico del Valle de Oaxaca, ubicado en Nazareno, Xoxocotlán, Oaxaca. Las plantas de A. americana. var. Oaxacensis que se utilizaron, se obtuvieron mediante la formación de brotes a partir de tejido de tallo y su enraizado posterior in vitro; tenían en promedio 6.75 hojas, 5 raíces y su hoja más larga tenía 9.78 cm de longitud y 0.64 cm de ancho. Se trasplantaron a macetas de polietileno con capacidad de 171 cm³, que contenían diferentes sustratos.

Éstos consistieron en mezclas de turba y arena en diferente proporción (33.3-66.6%, 66.6-33.3%, 75-25%) en relación a su volumen. Su aclimatización se realizó en una casa sombra tipo capilla, de 5.5 m de ancho, 12.1 m de longitud, 3.5 m de altura, con estructura metálica, techado de lámina acanalada traslúcida y cubiertas laterales de polietileno traslúcido, con radiación solar disminuida al 40%, temperatura de 14 a 28 °C, humedad relativa alta 80-90%. Las plantas se mantuvieron durante 45 días en estas condiciones, recibiendo una vez por semana 10 mL de la solución universal ^{Steiner (1984)}, diluida al 10% de concentración. Posteriormente, a partir del día 46, las plantas se trasladaron a un segundo invernadero donde fueron expuestas a mayor radiación solar, temperatura entre 15 y 38 °C, y humedad relativa entre 30 y 50%, en estas condiciones estuvieron hasta el día 270, durante este tiempo la aportación de la solución nutritiva se aplicó a nivel de sustrato tres veces por semana, de acuerdo con los tratamientos establecidos.

Diseño experimental y análisis de datos

El experimento, se estableció de acuerdo con un diseño completamente al azar con arreglo factorial 3 x 3, en donde: 1) el factor sustrato se estableció en tres niveles: a) turba+arena en mezcla 33.3+66.6% v/v, turba-arena en mezcla 66.6+33.3% v/v, turba+arena en mezcla 75-25% v/v y, 2) el factor tipo de riego también se estableció en tres niveles (agua y solución nutritiva (SN) ^{Steiner (1984)}, en dilución a 50% y SN a 100%). Por lo que resultaron nueve tratamientos. La SN (1984) a 100% contiene en mg L^-1: 166.01 N, 31.35 P, 277.38 K, 182.06 Ca, 49.08 Mg, 110.898 S, 1.33 Fe, 0.201 Mn, 0.077 B, 0.019 Mo, 0.0375 Zn y 0.00065 Cu.

La unidad experimental fue una planta y se tuvieron 15 repeticiones por tratamiento. El experimento concluyó a los 270 días de aclimatización y en ese momento se seleccionaron seis plantas por cada tratamiento a las que se le determinaron características morfológicas como: número de hojas (NH); longitud (LHM) y ancho (AH) de la hoja mayor, peso fresco foliar (PFF) y peso seco foliar (PSF), volumen (VF) y área foliar (AF), suculencia foliar (SF), diámetro de tallo (DT), número de raíces principales (NRP), longitud de raíz (LR), volumen de raíz (VR), peso fresco de raíz (PFR), peso seco de raíz (PSR), índice estomático y contenido de clorofila. La suculencia foliar (SF), se determinó con la fórmula propuesta por ^{Mantovani (1999)}, SF= (peso fresco máximo-peso seco (g))/área superficial (cm²).

El contenido de clorofila se determinó en hojas adultas y jóvenes a través del método propuesto por ^{Moran (1982)}, utilizando un medidor Minolta SPAD-502. Los valores del SPAD, se convirtieron a µg cm^-2 mediante la fórmula propuesta por ^{Coste et al. (2010)}. Para la determinación de estomas, se utilizaron hojas de la parte media de la roseta, de ellas se eligieron tres secciones: basal, media y apical, tanto de la parte adaxial como abaxial, las muestras obtenidas se observaron en un microscopio compuesto marca Carl Zeiss, a 40x, posteriormente se contabilizaron el total de células y estomas.

Con los datos anteriores se calculó el índice estomático (IE) con la fórmula propuesta por ^{Wilkinson (1979)}. Donde: IE= número de estomas por unidad de área/(número de estomas por unidad de área + número de células epidérmicas por unidad de área) × 100. Los datos obtenidos de cada variable se sometieron a análisis de varianza y la prueba de Tukey para la comparación múltiple de medias con un nivel de significancia α= 0.05. Para la rutina de análisis se usó el paquete estadístico SAS^® (The SAS System for Windows 9.0), se realizó el análisis de varianza correspondiente y la comparación múltiple de medias para establecer que tratamientos provocaron efectos significativos sobre las variables estudiadas.

Características de plantas micropropagadas de Agave americana var. Oaxacensis al finalizar su aclimatización

Los análisis de varianza del efecto del sustrato y la fertilización sobre los indicadores del crecimiento y desarrollo de las plantas (Cuadros 1 y 2), muestran diferencias significativas en el efecto de los tratamientos. Mientras que la comparación múltiple de medias detectó que las diferencias (p< 0.01), provocadas por los niveles del factor sustrato se manifiestan sobre la mayoría de las variables, excepto para la suculencia foliar. Los niveles del factor tipo de riego tuvieron efectos significativos diferentes (p< 0.01) sobre la variable número de hojas (NH), ancho de hoja (AH), peso fresco foliar (PFF), volumen foliar (VF), área foliar (AF), diámetro de tallo (DT) y número de raíces principales (NRP). La interacción sustrato-tipo de riego mostró efectos significativos (p< 0.01) sobre NH, AHM, PFF, VF, AF y NRP. En un estudio anterior ^{Cruz-García et al. (2017)}, reportaron que plantas de la misma especie, poseían hojas delgadas de consistencia herbácea al inicio de su aclimatización y que durante 240 días en esta etapa; ocurrió la senescencia gradual de las hojas provenientes del cultivo in vitro y que estas hojas fueron sustituidas por hojas nuevas que fueron más grandes, de 11.6 a 18.2 cm de longitud, 1.7 a 2.5 cm de ancho, engrosadas, y de consistencia herbácea pero más rígidas.

También señalan que al término de esa etapa 100% de las plantas sobrevivió y que aunque tuvieron menos hojas que al inicio de la aclimatación, fueron más largas y anchas, aunque su tamaño estuvo en relación con la cantidad de nutrimentos que recibieron.

En este caso, cuando transcurrieron nueve meses las plantas más pequeñas fueron las que se establecieron en el sustrato 33.3% de turba v/v +66.6% arena v/v, irrigadas con solo agua o con la SN-50%. Conforme se incrementó la cantidad de turba en el sustrato hasta 66.6% y 75%, las plantas alcanzaron tamaños mayores. Así también, las plantas fertirrigadas hasta SN-100% tendieron a ser más grandes que las plantas irrigadas con solo agua.

Por lo que las plantas que se establecieron en los sustratos con 66% turba y 33.3% arena o 75% turba+25% arena y que se fertirrigaron con la solución nutritiva a 100% de concentración de nutrimentos, desarrollaron 5.6 y 5.5 hojas, la hoja mayor fue de 17.7 y 18.2 cm de longitud, así como 2.5 y 2.4 cm de ancho, 34.9 y 31.8 g de peso fresco foliar, 36.1 y 34.5 cm³ de volumen foliar, 122.7 y 112 cm² de área foliar, 4.06 y 3.61 g de peso seco foliar; el tallo de 2.5 y 2.4 cm de diámetro, 6.5 y 7.3 raíces, de 39.8 y 32.6 cm de longitud; la raíz de 12.5 y 10.8 cm³ de volumen; 10.7 y 9.9 g de peso fresco de raíz, 1.7 y 1.4 g de peso seco de raíz, magnitudes que fueron significativamente (Tukey, p< 0.05) mayores a los valores registrados para las mismas variables en las plantas que se establecieron en sustrato con la mayor proporción de arena (33.3% turba+ 66.6% arena) y que no fueron fertirrigadas (Cuadros 1 y 2).

Diversos autores coinciden en señalar que se logra mejor aclimatación de las plantas obtenidas in vitro cuando se establecen en sustratos que sean una mezcla de materia orgánica y materiales inertes que mejoren la porosidad para aireación y drenaje, en algunos casos también señalan la adición de nutrimentos por otros medios como soluciones nutritivas o fertilizaciones foliares que hacen disponibles los minerales en formas iónicas que la planta puede aprovechar en el corto plazo. Por ejemplo, ^{Vilchez et al. (2007)} encontraron que vitroplantas de sábila (Aloe vera L.) mostraron incrementos en número de hojas y altura cuando se establecieron en el sustrato humus de lombriz, además el crecimiento de las plantas fue más rápido y vigoroso, en comparación con plantas que se establecieron en arena de río.

^{Florio y Mogollón (2011)}, reportaron que grupos de vitroplantas de plátano Musa sp. cv. Roatán que se establecieron en un sustrato compuesto de 85% de turba v/v y 15% de vermiculita v/v, 90% de plantas sobrevivió después de 30 días de aclimatación, y tuvieron 12.24 cm de altura, 13.87 mm de diámetro del brote, 6.38 hojas, 13.65 cm de longitud máxima de raíces, 1.7 y 0.64 g de biomasa fresca; 0.27 y 0.07 g de biomasa seca de los brotes y raíces, magnitudes superiores en comparación con plantas que estuvieron en otros sustratos: 1) aserrín de coco (100%); 2) arena, aserrín de coco y cáscara de arroz (1:2:1 v/v); 3) arena, aserrín de coco y cáscara de arroz y vermicompost (1:5:2:2 v/v). Los sustratos anteriores, ya sea que contengan materia orgánica o solo materiales inertes, deben tener porosidad adecuada para la aireación y drenaje. Así también, el abastecimiento de nutrimentos es benéfico para que las plantas logren mayor crecimiento y rendimiento. ^{Abreu et al. (2007)}, al micropropagar A. fourcroydes trasfirieron las plantas a contenedores de poliespuma de 47 x 69 cm con 247 alvéolos cada uno con 30 cm³ de volumen, con sustrato de pulpa de henequén fermentado y zeolita en diferentes proporciones.

Las plantas se establecieron en un invernadero que permitía el paso de 30% de la luz (≈ 558.74 y 686.55 μmol m^-2 s^-1), éstas condiciones fueron generadas mediante el empleo de capas de malla sarán de color negro. Trascurridos 30 días, las plantas que se establecieron en el sustrato compuesto de 4.46 kg de pulpa de henequén y 5.54 kg de zeolita, 92% de las plantas sobrevivió y tuvieron en promedio 7.64 cm² de área foliar y 59.43 mg de peso seco total.

Por otra parte, ^{Crespo-González et al. (2013)} trabajaron con plantas micropropagadas in vitro de Agave tequilana Weber var. azul con una altura de 15-22 cm y 16 meses de edad, en donde evaluaron la respuesta de las plantas a los tratamientos establecidos a base de formulaciones de los sustratos orgánicos (polvo de coco (PC), turba (T) y composta de bagazo de agave (C), mezclados en una relación de volumen (v/v), considerándose los siguientes: 1) testigo: 80% PC + 10% T + 10% C; 2) 100% PC; 3) 100% T; 4) 70% PC + 30% C; 5) 50% PC + 50% C; 6) 30% PC + 70% C; y 7) 100% C. Además, las plantas de todos los tratamientos durante nueve meses recibieron entre 7 y 14 fertirriegos por mes con quelatos de hierro y manganeso, sulfato de magnesio, nitrato de calcio, y fórmulas N-P-K 18-18-18 (período septiembre-diciembre) y 15-30-15 (período enero-mayo).

Las plantas que estuvieron en sustratos con composta al 30 y 50% desarrollaron la piña con diámetros de 4.7 y 5.07 cm y el tallo de 3.5 y 3.75 cm, tuvieron 15 y 15.3 hojas, la hoja mayor fue de 55.4 y 51.3 cm de longitud, así como 3.6 y 4 cm de ancho, respectivamente, magnitudes que fueron superiores a los 3.63 cm de diámetro de piñas, 2.1 cm de diámetro de tallo, 9.8 hojas, con la hoja mayor de 36.9 cm de longitud y 3 cm de anchura, que tuvieron las plantas en el sustrato de 100% turba. Los autores concluyen que se obtienen plantas de mayor tamaño con los sustratos que contienen mayor cantidad de materia orgánica mezclada con otro material que proporcione buena aireación y filtración.

Índice estomático en hojas adultas y jóvenes de plantas micropropagadas de Agave americana var. Oaxacensis al finalizar su aclimatización

Las plantas micropropagadas que son trasferidas a condición ex vitro forman estructuras vegetativas durante su aclimatización en invernadero, donde la planta desarrolla hojas que muestran características diferentes respecto a las hojas formadas en condición in vitro: cutícula, parénquima empalizada y mesófilo. Entre los cambios observados, se menciona que las hojas nuevas formadas en condiciones de invernadero tienen cantidad diferente de estomas (^{Pospíšilová et al., 1999}).

En la presente investigación se observó que, al inicio de su aclimatización, las hojas de las plantas de A. americana var. Oaxacensis micropropagadas tuvieron un índice estomático con promedio de 4.55% para la sección basal, 7% para la sección media y 7.93% para la sección distal, en cambio en el envés de las hojas se obtuvo un promedio de 4.16, 7.26 y 9.32% para la sección basal, media y distal respectivamente. Al concluir esta etapa, el índice estomático se había incrementado en las distintas secciones de la hoja. En la superficie adaxial (haz) en su sección basal, media y distal, se tuvo en promedio 4.82, 9.06 y 10.67% de índice estomático, respectivamente, mientras que para la superficie abaxial (envés) se obtuvieron promedios de 5.93, 9.24 y 10.86% respectivamente.

De acuerdo con el análisis de varianza, los niveles del factor sustrato tuvieron efectos significativos diferentes (p< 0.01) sobre la variable índice estomático del haz en la sección media y distal de la hoja de tamaño mayor de Agave americana var. Oaxacensis (Cuadro 3). Los niveles del factor tipo de riego mostraron efectos significativos (p< 0.01) diferentes únicamente para las variables índice estomático en envés sección media y distal. La interacción sustrato-tipo de riego tuvo efecto significativo, únicamente para la variable índice estomático en el envés sección distal de la hoja.

En lo que respecta al índice estomático, determinado en las hojas nuevas formadas ex vitro, se observó que la distribución de los estomas es más homogénea que en condiciones in vitro ya que la sección media y apical tanto del haz como del envés presentan valores de índice estomático muy similares (Cuadro 4). Las hojas que las plantas de A. americana var. Oaxacensis formaron in vitro presentaron menor índice estomático, respecto de las hojas nuevas que la planta desarrolló durante su adaptación.

Esta característica podría deberse a que hubo un aumento del tamaño de las células epidérmicas (Figura 1); por lo tanto, en el campo de observación del microscopio se observaron menor cantidad de ellas, con lo cual se vio afectado el denominador de la fórmula para calcular el índice estomático. ^{Stranburger et al. (1986)}, mencionan que el número de células epidérmicas grandes que reduce el denominador de la fórmula de IE por unidad de superficie analizada posiblemente está relacionado con la optimización de la capacidad para el almacenamiento de agua.

Figura 1 Estomas observados en el microscopio en un campo de 40x. (A) estomas presentes en A. americana var. Oaxacensis en cultivo in vitro; y (B) estomas en plantas adaptadas en invernadero.  

Los análisis de varianza mostraron que el factor sustrato, el factor tipo de riego y la interacción sustrato-tipo de riego presentaron efectos significativos sobre IEEM, pero no sobre las variables IEHB, IEHM, IEHD, IEEB y IEED. Lo anterior, denota que los valores de índice estomático determinados en las diferentes secciones de las hojas nuevas de A. americana var. Oaxacensis, no se ve influido ni por el tipo de sustrato ni por el suministro de nutrimentos en el riego (Cuadro 4).

Los resultados del índice estomático mayor en hojas jóvenes de A. americana var. Oaxacensis aclimatadas, coinciden con ^{Bazaldua-Muñoz et al. (2008)}, quienes reportan que plantas de Physalis ixocarpa micropropagadas presentaron un incremento gradual de densidad estomatica tanto del haz como del envés en función del tiempo de aclimatación.

Contenido de clorofila en hojas adultas y jóvenes de plantas micropropagadas de A. americana var. Oaxacensis adaptadas en invernadero

De acuerdo con el análisis de varianza (Cuadro 5) se encontraron diferencias significativas (p≤ 0.001) sobre el contenido de clorofila en hojas adultas y jóvenes de A. americana var. Oaxacensis en respuesta al sustrato en el que se establecieron y al abastecimiento de nutrimentos en el riego, que la interacción sustrato-tipo de riego no tuvo efecto significativo. Las plantas de agave micropropagadas que estuvieron en los sustratos con dos y tres porciones de turba combinados con una de arena y además recibieron solución nutritiva al 100% respectivamente, sus hojas de mayor edad tuvieron de 43.64 y 42.91 µg cm^-2 de clorofila, magnitudes significativamente (Tukey, p< 0.05) mayores a los 23.95 µg cm^-2 que tuvieron las hojas de las plantas que se establecieron en el sustrato con una porción de turba combinado con dos de arena y que no recibieron solución nutritiva adicional (Cuadro 5). Las hojas jóvenes de las plantas de A. americana var. Oaxacensis tuvieron más clorofila que las hojas de mayor edad. El valor más alto de clorofila 75.85 µg cm^-2 se observó en las hojas jóvenes de las plantas que estuvieron en el sustrato con dos porciones de turba combinado con una de arena y que además se fertirrigaron con la solución Steiner al 100%.

El mayor crecimiento de las plantas establecidas en estos sustratos se podría atribuir a la disponibilidad de una mayor cantidad de nutrientes en el sustrato con proporción de turba alta y los aportados por la solución nutritiva. Lo anterior concuerda con ^{Wu et al. (2008)}, quienes reportan que el estado nutricional de las plantas tiene relación positiva con el contenido de clorofila y a su vez con la actividad fotosintética. Mientras que ^{Zarco-Tejada et al. (2004)}, mencionan que en plantas con crecimiento vigoroso generalmente se espera que contengan concentraciones altas de clorofila, en relación con plantas menos vigorosas.