Fertilizantes fosforados

El cultivo intensivo de plantas implica necesariamente la fertilización con P a niveles que satisfagan los requerimientos específicos de cada etapa fenológica del ciclo productivo. La demanda de fertilizantes fosfatados se ha incrementado en los últimos años y se proyecta que en 2018 alcance los 46.6 millones de toneladas (^{FAO, 2015}). El incremento anual estimado es de 4% en América y 2.4% a nivel mundial, poniendo en riesgo el abasto interno de los mismos (^{FAO, 2015}). Una de las limitaciones de la agricultura moderna es la disponibilidad de roca fosfórica, una fuente no renovable a partir de la cual se producen los fertilizantes fosforados (^{Zapata y Roy, 2007}). Por lo tanto, es necesario considerar su disponibilidad en el contexto de la agricultura presente y futura; además, evaluar nuevas estrategias para satisfacer la demanda creciente y ambientalmente responsable.

El P y su importancia en la planta

El P es asimilado por las plantas como fosfato, siendo el ortofosfato monovalente (H₂PO₄) el que se encuentra en mayor cantidad. Una vez incorporado forma parte de la unión entre nucleósidos y ribonucleósidos, además está presente en fosfolípidos de membranas unido a moléculas de amino colina y fosfatidilcolina. En la célula la mayor parte del P permanece almacenado en su forma inorgánica (Pi), cuya liberación en el medio intracelular puede desencadenar la explosión respiratoria durante la maduración (^{Hawkesford et al., 2012}).

El Pi también puede ser empleado en la síntesis de fósfato de alta energía ((P)-(P)) o en forma de éster (C-(P)), en ambas formas es empleado en procesos metabólicos de biosíntesis y degradación en donde se requiere principalmente ATP (Por ejemplo, biosíntesis y degradación fosforilativa del almidón). En la señalización interviene en reacciones de fosforilación por adenosin difósfato (ADP), adenosin trifósfato (ATP) o guanidin trifosfato (GTP) donde se libera como pirofosfato inorgánico (PPi), que se emplea posteriormente por diversas enzimas (^{Hawkesford et al., 2012}).

La variedad de síntomas que se presentan en una planta deficiente de Pi son diversos debido a su importancia en procesos biológicos vitales (Figura 1). En hojas se manifiestan puntos necróticos y un menor crecimiento de la planta. Algunas especies se tiñen color púrpura (síntesis de antocianinas) en varios órganos y en deficiencia severa las hojas llegan a tornarse azul grisáseas y las nervaduras se obscurecen (^{Berry, 2010}).

Posteriormente las plantas se transfirieron a condiciones nutricionales diferenciales de P [bajo P (-P: 1.2 ppm) y control (P; 9 ppm)].

Figura 1 Plantas de tomate (Solanum lycopersicum cv Micro-tom) 60 días de tratamiento en condiciones de nutrición ideal (control) y deficiente de fósforo (-P). Semillas germinadas de tomate Micro-tom en medio nutritivo Murashige-Skoog (MS) a fotoperiodo de 16 h luz/8 h obscuridad (27 °C y ~70 % HR), después de tres semanas las plántulas se aclimataron en medio hidropónico con nutrición Steiner (testigo) durante tres semanas. 

En maíz (Zea mays) y frijol (Phaseolus vulgaris), los síntomas incluyen un menor peso fresco, una disminución del contenido de P radicular, menor desarrollo en general de la planta y aumento de raíces laterales (^{Ciereszko et al., 1996}; ^{Hernández et al., 2007}; ^{Qui-Lun et al., 2007}) en frijol además se acompaña de un cambio de color en hojas jóvenes (^{Hernández-Domíguez et al., 2012}). No obstante, estas alteraciones fenotípicas ocurren de manera posterior y tardía como consecuencia de una serie de regulaciones génicas y bioquímicas.

A nivel bioquímico se manifiestan cambios en el metabolismo de carbohidratos para una rápida adaptación y recuperación a los niveles de Pi en la planta, entre ellos, la acumulación de azúcares (glucosa y almidón en hojas), sacarosa (en hojas y raíz) y de las enzimas fosfato sintasa, sacarosa sintasa e invertasas (^{Ciereszko y Barbachowska, 2000}).

En maíz (Zea mays) también se presenta un incremento de las enzimas fosfatasa ácida, peroxidasa y superóxido dismutasa, posiblemente como estrategia de regulación del ambiente redox con lo cual contribuye a la adquisición de Pi y adaptación al estrés (^{Qui-Lun et al., 2007}). Durante este adaptativo proceso también se ha observado en plantas de uva (Vitis vinifera) la acumulación de antocianinas, atribuido a la utilización de la fenilalanina en la ruta de síntesis de antocianinas y la reducción de su conversión en la síntesis proteica (^{Yin et al., 2012}).

Estos cambios bioquímicos llegan a repercutir en las características fenotípicas de las plantas. En tomate, las estrategias adaptativas conocidas incluyen una mayor actividad de fosfatasa ácida asociada a un incremento de biomasa en raíz para mejorar la capacidad de liberación de la enzima (^{Goldstein et al., 1988a}), también de enzimas tipo RNAasa, con actividad de fosfotransferasas (^{Nurnberger et al., 1990}), la liberación de ambas enzimas es una estrategia de la planta para asimilar Pi del medio mediante la degradación de sustratos presentes en el área circundante a la rizosfera para su posterior absorción.

Es importante resaltar, que la fosfatasa ácida en tomate tiene dos variantes o isoformas, probablemente como mecanismo de regulación ya que éstas están compuestas de dos subunidades que además de mantener la actividad catalítica de manera independiente, poseen la capacidad de agregación, manteniendo la función dual como fosfatasa ácida y fosfatasa alcalina (^{Goldstein et al., 1988b}).

Otro tipo de modificaciones de adaptación son las de tipo metabólico, mediante las cuales se activan rutas alternativas para mantener activo el ciclo glicolítico.

En Brassica nigra ante una deficiencia de fósforo, decrecen los niveles de Pi (fósfato inorgánico), ATP, ADP, Fru-2,6-P₂ (Fructosa 2,6-bifosfato) y PPi (pirofosfato inorgánico), mientras que la cantidad de aminoácidos libres se incrementa. Además, se incrementa la actividad de las enzimas PFP (PPi: D-fructosa 6-fosfato 1-fosfotransferasa) no fosforilante NAPD-G3PDH, PEP (fosfoenolpiruvato) fosfatasa y PEP (fosfoenolpiruvato) carboxilasa, para crear rutas alternativas al glicólisis (^{Duff et al., 1989}). Estos cambios del metabolismo permiten a la planta adaptarse y sobrevivir a las condiciones de deficiencia de Pi.

Aspectos moleculares de la deficiencia de P

La respuesta molecular a la deficiencia de Pi se presenta a nivel de órganos y organelos de manera diferente. Dentro de los factores fisiológicos resaltan la expresión de transportadores y factores de transcripción (^{Rubio et al., 2001}; ^{Nilsson et al., 2007}), los primeros con la función de activar estrategias de captura y translocación del mineral hacia el interior de la célula, mientras que los segundos activan o reprimen cascadas de señalización y expresión génica.

La respuesta espacio-temporal es determinada por el potencial génico de la planta; en uva se manifiesta en las primeras 24 h y se orienta a la expresión de genes de la síntesis de antocianinas, entre ellos, chalcona sintasa, chalcona isomerasa, flavonona-3-hidroxilasa, dihidroflavonol-4-reductasa, antocianin-sintetasa, UDP-glucosa, UDP-glucosa:flavonoide 3-O glucosiltransferasa (UFGT) y un factor de transcripción VvmybA1 (^{Yin et al., 2012}). Por otro lado, en frijol aproximadamente 13% de los genes expresados corresponden a proteínas transportadoras, aunque también se presentaron cambios en genes relacionados al metabolismo secundario, transducción de señales, defensa de estrés y ciclo celular, entre otros (^{Hernández et al., 2007}).

La respuesta global a una deficiencia de este elemento en otras especies como Arabidopsis thaliana involucra la expresión diferencial de 1835 genes durante las primeras 72 h de exposición al estrés mineral por Pi (^{Wu et al., 2003}). En arroz (Oryza sativa), la deficiencia de Pi también produjo una regulación génica negativa con 12990 genes reprimidos (21% de los genes evaluados), mientras que el total de genes activados fue de8043 (13%) (^{Park et al., 2012}).

Además, las proteínas más producidas por un estrés por deficiencia de P es el transportador de fósforo PHT1;4 y la fosfatasa ácida ACP5 (^{Lan et al., 2012}) lo que corrobora la participación de estas proteínas en el proceso de adaptación de la planta a la deficiencia de P. En arroz (Oryza sativa), 7 días de deficiencia de P modularon la expresión de genes en raíz y tallo, activando la expresión de ~450 genes en raíz y ~250 en tallo. Por otro lado, reprimieron la expresión de ~400 genes en raíz y ~180 en tallo.

Es importante mencionar que durante los 7 días se observó la activación de genes que codifican para factores de transcripción en raíz, mientras que en tallo esto sucede hasta las 24 h posteriores del estímulo. Otro dato de relevancia es que en raíz la expresión de algunos genes miembros de la familia PHT1 constante durante la presencia del estímulo (^{Cai et al., 2012}). Esto indica que el proceso ocurre en una coordinación espacio-temporal ante una deficiencia de Pi, donde el primer evento de absorción desencadena la respuesta más temprana de captura del mineral en raíz y posteriormente la translocación y movilización del Pi que realizan otros miembros de la misma familia de genes.

A nivel proteómico en maíz (Zea mays) se evaluaron los genotipos 99038 (tolerante a bajas concentraciones de P) y Qi-319 (silvestre), observándose la producción 140 proteínas acumuladas diferencialmente ante una deficiencia de Pi, dentro de las más reguladas se encuentran las relacionadas con el metabolismo de carbono y la proliferación celular (^{Li et al., 2008}). Estos procesos son vitales en el desarrollo de la planta y requieren un suministro constante de Pi, donde el proceso de reasimilación de este elemento ante una deficiencia se encuentra ampliamente relacionado con la producción de proteínas transportadoras de Pi de la familia PHT1.

Proteínas PHT1

Las proteínas transportadoras de P de la familia PHT1 son importantes en el proceso de recuperación del homeostasis en las plantas. Estas proteínas son dependientes del factor de transcripción PHR1 (phosphate starvation response) que regula los genes phosphate starvation induced (PSI), por sus siglas en inglés, incluidos los genes de la familia PHT1 (^{Bari et al., 2006}).

Estas proteínas contienen 12 dominios transmembranales con una longitud aproximada de 520 aa (^{Poirier y Bucher, 2002}), presentan una secuencia única conservada GGDYPLSATIxSE entre todos sus miembros (^{Karandashov y Bucher, 2005}) y su regulación transcripcional y postranscripcional es un proceso complejo que involucra a la ubiquinasa PHO2, el microARN miR399 y el factor de transcripción PHR1.

La producción de las proteínas PHT1 es regulada por la ubiquinasa PHO2, la cual en condiciones normales degrada las proteínas PHT1 de manera activa; sin embargo, los transcritos de PHO2 contienen en la región 5’-UTR una secuencia que es reconocida por el miR399 que al interactuar con esta región conduce a la degradación del transcrito, evitando la producción de la proteína, a su vez, miR399 es regulado positivamente por el factor de transcripción PHR1 el cual está relacionado con las deficiencias de Pi (^{Bari et al., 2006}), generando así, un ciclo de regulación dependiente de los niveles de Pi intracelular.

Familia PHT1 en monocotiledóneas

^{Nagy et al. (2006)} evaluaron la expresión de 5 miembros de la familia PHT1 en maíz (Zea mays) en condiciones de deficiencia de Pi. Los genes PHT1, 1 y PHT1, 4 se expresan en todos los órganos de la planta con niveles de expresión más altos en las hojas y la raíz. Mientras que PHT1, 2 se expresa principalmente en raíz, PHT1, 3 en órganos reproductivos en las anteras y PHT1, 6 en raíz (^{Nagy et al., 2006}). En Serratia italica, se observó una sobreexpresión de los genes SiPHT1: 8, SiPHT1: 9 y SiPHT1: 10 en tallo, sin cambio aparente en hojas y raíz, después de 15 días de una deficiencia de P (10 µM); sin embargo, después de 31 días de la deficiencia se observó en hoja una mayor expresión de SiPHT1, 4, SiPHT1, 6, SiPHT1, 11 y SiPHT1, 12 todo lo anterior al compararlas con plantas mantenidas en condiciones control (^{Ceasar et al., 2014}).

Los patrones de expresión de los genes anteriormente mencionados pueden interpretarse como una acción coordinada para evitar redundancia funcional entre las proteínas y actuar de manera coordinada para translocar P desde la raíz hasta diversos órganos de la planta (Cuadro1).

Familia PHT1 en dicotiledóneas

La familia PHT1 se ha identificado en varias especies y en Arabidopsis thaliana se compone de nueve genes con nomenclatura de PHT1, 1 a PHT1, 9 y su expresión es espacio-temporal específica por lo cual su papel fisiológico puede ser de alta regulación (^{Mudge et al., 2002}). En Arabidopsis la represión de los genes PHT1, 1 y PHT1, 4 limita la absorción del mineral; su regulación es a nivel transcripcional y son un mecanismo de adaptación para la producción de proteínas de membrana transportadoras de P (^{Shin et al., 2004}). La distribución tisular del gen PHT1, 4 es variada y su expresión depende de los órganos con disponibilidad de P (^{Misson et al., 2004}).

En tomate, la familia PHT1 está conformada por 8 miembros, LePT1 a LePT8, en este cultivo la presencia de LePT1 se identificó con una inducción temprana por deficiencia de P (en las primeras 24 h) (^{Muchhal y Raghothama, 1999}). ^{Chen et al. (2014)} confirmaron que genes de la familia PHT1 están asociados a la deficiencia de P, LePT1 se expresó en raíz, tallo, hojas jóvenes, flores y frutos en los estados de madurez verde y maduro, pero la mayor expresión ocurrió en raíz. LePT2 solo fue detectado en raíz con una inducción ~15 veces más en plantas con deficiencia de Pi respecto al control, LePT3, LePT5 y LePT7 se expresaron en todos los tejidos, pero sus mayores niveles se observaron en hoja, fruto maduro y raíz, respectivamente. LePT6 se expresó en raíz, tallo y hoja, pero en mayor medida en raíz.

Lo anterior sugiere que el transporte y asimilación de P en tomate y otras especies es un proceso altamente regulado y que existen variantes de espacio y tiempo que lo definen. En otras especies también de monocotiledóneas y dicotiledóneas se han caracterizado otros miembros de la familia PHT1 (Cuadro 1). En el cultivo de soya (Glycine max) se evaluó la expresión de 14 genes PHT1 bajo condiciones bajas de P (5 µM). Los mayores niveles de expresión en raíz los presentaron GmPT1, GmPT2, GmPT3, GmPT4, GmPT7, GmPT8, GmPT9 y GmPT12, en hoja GmPT13, en flor GmPT5 y en tallo GmPT6, GmPT9, GmPT11 y GmPT14; GmPT10 no presentó cambios en su expresión relativa durante la deficiencia de P (^{Wu et al., 2011}).

En el cuadro 1 se observa el avance sobre el conocimiento de las proteínas PHT1 transportadoras de Pi; sin embargo, en cuanto a los avances en el conocimiento de la regulación del metabolismo de P, se han generado algunos modelos funcionales con base en estudios realizados en levaduras mutantes deficientes en asimilación de fósforo; por ejemplo, en las levaduras MB192 (^{Qin et al., 2012}; ^{Leggewie et al., 1997}), PAM2 (^{Nagy et al., 2005}) y EY917 (^{Nagy et al., 2006}) se estudia el potencial del mejoramiento genético de las proteínas de interés en cultivos agrícolas importantes, mediante la evaluación de parámetros como la cinética de transporte de P y su afinidad por este mineral (^{Qin et al., 2012}), esta información permitiría seleccionar genes con características deseables para el mejoramiento mediante ingeniería genética, con el fin de producir material más resistente a la deficiencia mineral, considerando los panoramas previstos ante la escasez prevista en los próximo años de los fertilizantes fosforados.

Uso potencial como herramientas de mejoramiento

La caracterización de las proteínas transportadoras de Pi sienta las bases para futuras aplicaciones. Este conocimiento podría llevar a crear plantas más adaptables a condiciones ambientales adversas como la deficiencia mineral mediante el uso de estrategias moleculares que permitirían obtener plantas más resilientes durante las primeras etapas de desarrollo, así como, a lo largo de su ciclo de vida. Otra alternativa es el uso de técnicas moleculares; por ejemplo, ^{Yan et al. (2014)}, insertaron el gen OsPT6 de arroz en plantas de soya (NY-1001) y obtuvieron plantas más altas, con una mayor cobertura foliar, raíces más largas, un mayor contenido de P, un crecimiento general más vigoroso y un aumento general en la biomasa.

Estos cambios fenotípicos se relacionaron con un incremento de al menos 5 veces en la expresión del gen OsPT6 en las plantas transformadas con respecto al control. Tales características fenotípicas son deseables para un cultivo intensivo debido a que se incrementan rasgos favorables relacionados con la productividad y resistencia a otros tipos de estrés bióticos o abióticos. Además de las secuencias codificantes, también se podrían explorar las regiones promotoras de genes de interés con la finalidad de incrementar la especificidad de la expresión en regiones localizadas de la planta para satisfacer una demanda en particular, por ejemplo, una mayor captación de P en suelos pobres en este elemento o en fructificación.

En Hordeum vulgare se observó que algunas regiones promotoras específicas presentan afinidad por la expresión en raíz, lo cual tiene potencial como herramienta de expresión para usar con genes de transportadores de minerales o codificantes para otras proteínas que sean necesarias en este órgano de la planta (^{Schünmann et al., 2004}).