texto em 
Inglês (pdf)
Artigo em XML
Referências do artigo
Tradução automática
Enviar este artigo por email
Citado por SciELO 
Similares em
SciELO 
Permalink
Introducción
La Rosa spp. es uno de los cultivos ornamentales más importantes y la producción bajo invernadero se estima en alrededor de 8 500 ha, con una producción anual de aproximadamente 15 a 18 billones de tallos cortados en el mundo (Blom y Tjusita, 2003). En 2017, en México, se reportaron 1 127.1 ha cultivadas en invernadero y su rendimiento fue de 6 985.98 t ha-1 (SIAP, 2018). Sin embargo, el cultivo es susceptible a diversas enfermedades como el mildiu velloso causado por el oomycete Peronospora sparsa Berkeley (Debener y Byrne, 2014), uno de los principales problemas fitosanitarios de este cultivo a nivel mundial, que ocasiona pérdidas en la producción al disminuir la calidad de los tallos florales y aumentar el costo de producción, especialmente por el incremento en el número de aplicaciones de fungicidas (Ayala et al., 2008; Castillo et al., 2010).
El manejo de Peronospora sparsa se basa fundamentalmente en la aplicación de fungicidas (Aegerter et al., 2002; Quiroga y Arbeláez, 2004) con hasta tres aplicaciones por semana, con un aumento drástico en los costos de producción y los impactos sobre la salud humana y el ambiente, además de originar variantes resistentes del patógeno (Kuck et al., 2011; Rebollar-Alviter et al., 2012). Debido a la presión de los mercados sobre un manejo inocuo de los cultivos menos contaminante y peligroso, es importante encontrar alternativas a los fungicidas para el manejo del mildiu velloso, tales como las sales de ácido fosforoso (fosfitos) que han mostrado potencial para controlar enfermedades causadas por oomycetes, en particular los géneros Peronospora, Plasmopara, Phytophthora y Pythium (Lobato et al., 2010; Silva et al., 2011; Burra et al., 2014; Brunings et al., 2015).
Su modo de acción es complejo; presentan efectos directos sobre los patógenos (King et al., 2010) e indirectos mediante la estimulación de respuestas de defensa del hospedante (Machinandiarena et al., 2012; Burra et al., 2014). Al respecto, Lobato et al. (2010) demostraron que aplicaciones de fosfitos redujeron los síntomas causados por Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, Fusarium solani (Mart.) Sacc. y Rhizoctonia solani Kühn en tubérculos de papa (Solanum tuberosum L.).
Además, de que los fosfitos actúan como un potencial inductor de respuestas metabólicas beneficas en las plantas, se ha confirmado su eficacia sobre la calidad y rendimiento de algunos cultivos (Lovatt y Mikkelsen, 2006; Gómez-Merino y Trejo-Téllez, 2015). Asimismo, aplicaciones de silicio han demostrado ser eficaces en la supresión de enfermedades fungosas; al depositarse en espacios intra e inter celulares, actuando como una barrera física ante la infección de los patógenos (Ma y Takashi, 2002).
También la resistencia mediada por silicio a fitopatógenos se ha demostrado en varios patosistemas tales como pepino-Podosphaera fuliginea (Schltdl.) U. Braun & S. Takam. (Liang et al., 2005), calabacín-P. xanthii (Castagne) U. Braun & Shishkoff (Sawas et al., 2009), trigo-Blumeria graminis (DC.) Speer (Bélanger et al., 2003) y pimiento-Phytophthora capsici (Leonian) (Lee et al., 2004) mediante la inducción y acumulación de metabolitos antifúngicos de bajo peso molecular en respuesta a la infección durante el desarrollo de la enfermedad (Fawe et al., 1998; Fauteux et al., 2005). Asimismo, se ha demostrado que la aplicación de silicio promueve el crecimiento y calidad de las rosas (Hwang et al., 2005; Reezi et al., 2009). El control de oomycetes se ha logrado mediante el tratamiento con quitosano, actuando directamente sobre el patógeno o mediante la estimulación de respuestas de defensas de las plantas (Iriti et al., 2011). Al respecto, se reportó que el tratamiento con quitosano inhibió el crecimiento micelial de P. capsici en pimientos (Xu et al., 2007), mientras que en plántulas de Solanum tuberosum se incrementó la actividad enzimática de la quitinasa en repuesta a la infección por P. infestans (O’Herlihy et al., 2003).
Por su parte, Wojdyla (2004) reportó que la aplicación de quitosano a una concentración de 0.025% en rosal, mostró una efectividad biológica superior a 72% en el control de Peronospora sparsa y fue similar al fungicida. Independientemente de los efectos del quitosano sobre las enfermedades, mejoras significativas en crecimiento y calidad se han reportado en diversos cultivos ornamentales (Wanichpongpan et al., 2000; Ohta et al., 2001; Nge et al., 2006; Ramos-García et al., 2009).
Con base a lo mencionado, los objetivos de este estudio fueron caracterizar morfológica y molecularmente al agente asociado con el mildiu velloso en Rosa spp., evaluar la eficacia de cuatro productos comerciales (Metalaxil, fosfito de potasio, silicio y quitosano) en el manejo del mildiu velloso en condiciones de campo y determinar su efecto en la longitud y diámetro de tallo floral.
Materiales y métodos
Caracterización morfométrica
Se colectaron en invernadero hojas de rosal var. Lupita® (Meilland International) con síntomas y signos del mildiu velloso en el municipio de Tenancingo, México. Estructuras como esporangióforos y esporangios fueron desprendidos de los foliolos y con ellas se realizaron preparaciones semipermanentes con cinta Scotch en glicerol al 50% acidificado con HCl al 12N, en estas se observaron y midieron en el microscopio compuesto (Carl Zeiss® Axiostar plus) las características morfométricas de 30 esporangióforos y 50 esporangios. La identificación del género y especie se realizó de acuerdo a Achard (1997); Horts y Cloyd (2007).
Microscopia electrónica de barrido
Fragmentos de hojas jóvenes (0.5 cm2) de rosal con signos de mildiu velloso se fijaron en glutaraldehído al 3% durante 24 h, posteriormente se lavaron con buffer de fosfato Sorensen’s (0.1 M). Las muestras se deshidrataron mediante la inmersión en etanol a concentraciones graduales (30, 40, 50, 60, 70, 80, 90) por 40 min cada uno y al 100% tres veces por 20 min. Posteriormente se secaron en CO2 en un desecador de punto crítico (Sandri-780A®, EE UU) por 40 min, se montaron en portamuestras de cobre y se recubrieron con oro en una ionizadora (Ion Sputter JFC-1100, JEOL®, Japón) por 1 min. Finalmente, las preparaciones se observaron y fotografiaron en un microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM-6390®, Japón).
Extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó a partir de hojas con signos del mildiu velloso, mediante el reactivo Plant DNAzol Reagent® (InvitrogenTM) de acuerdo al protocolo descrito por el fabricante, con modificaciones para evitar el efecto de fenoles, por lo que se realizaron cinco lavados con 300 µL de etanol al 75%. La integridad de ADN se observó en un gel de agarosa (UltrapureTM) al 1%, las bandas de ADN se visualizaron en un transiluminador (Syngene® GVM20), la calidad y concentración se determinaron en un biofotómetro (Eppendorf® D-5000-3000). El ADN obtenido se resuspendió en 50 µL de agua grado biología molecular y se almacenó a -20 °C para su uso posterior.
PCR y secuenciación de ADN
Para la prueba de PCR se utilizaron los primers específicos PS3 (5’ATTTTGTGCTGGCTGGC3’) y PS1 (5’TGCCACACGACCGAAGC3’) (Aegerter et al., 2002) para amplificar diferencialmente la región ITS1, 5.8S e ITS2 del ADNr del patógeno en estudio. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 20 µL de la mezcla: 2.6 μL de agua estéril desionizada (Gibco®), 10 μL de 2X Phire Plant PCR Buffer (incluye 200 μM de cada dNTPs y 1.5 mM de MgCl2), 2 μL de cada primer PS3 y PS1 (10 ρmol), 2 μL de leche sin grasa estéril (10 mg mL-1), 1 μL de ADN y 0.4 μL de DNA polimerasa (Phire® Hot Start II). La amplificación se realizó en un termociclador (MJ Research Thermal® PTC-100) de acuerdo al procedimiento descrito por Ayala et al. (2008). El producto de la amplificación se verificó mediante electroforesis a 90 V por 30 min en gel de agarosa al 1% y tinción con 1 μL de bromuro de etidio, la visualización se realizó en un transiluminador (Syngene® GVM20). El ADN se purificó con el kit comercial DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research®).
Posteriormente los fragmentos amplificados mediante la PCR fueron secuenciados en ambas direcciones en un analizador genético (Applied Biosystem® ABI Prism 3130XL). La secuencia obtenida fue alineada en la base de datos del NCBI. La secuencia se depositó en la base del GenBank.
Experimentos en invernadero
En plantas de rosal var. Lupita® cultivadas en condiciones de invernadero se realizaron dos ensayos: el primero en la temporada de verano y el segundo en otoño de 2013. Ambos se realizaron bajo un diseño de bloques al azar con cinco tratamientos y cuatro repeticiones. Se utilizaron 20 unidades experimentales, cada unidad experimental consistió en una parcela de 2.7 m de largo por 1 m de ancho con 27 plantas de rosal distribuidas en hilera. Mediante una poda se estimuló la producción de brotes de forma homogénea, sobre los cuales se evaluaron los tratamientos.
Tratamientos
Los tratamientos fueron: fosfito de potasio, silicio, quitosano, el fungicida mefenoxam y un testigo a base de agua destilada (Cuadro 1). Los tratamientos se asignaron al azar a cada unidad experimental, su aplicación inició ocho días después de la poda y posteriormente a intervalos semanales hasta finalizar los ensayos. La aplicación se realizó con una bomba de aspersión motorizada (Maruyama® MS072H) con boquilla de abanico.
Cuadro 1 Descripción de los tratamientos aplicados sobre plantas de rosa var. Lupita® para el manejo de Peronospora sparsa.
| Tratamiento | Nombre comercial | Concentración | *Dosis (mL L-1) |
|---|---|---|---|
| Testigo | Agua destilada | - | - |
| Fosfito de potasio | Nutriphite magnum® | 2% N, 40% P2O5, 16% K2O | 2.5 |
| Silicio | Armurox® | 2% complejo de péptidos con silicio soluble | 2.5 |
| Quitosano | Biorend® | 2.5% poly-d-glucosamina | 3 |
| Mefenoxam | Ridomil Gold® 480 SL | 480 g ia. L-1 | 2 |
*Dosis recomendadas por el fabricante.
Variables evaluadas
Se seleccionaron y etiquetaron 10 tallos al azar por unidad experimental para la evaluación de la incidencia y severidad de la enfermedad, longitud y diámetro de tallos florales.
Evaluación de la incidencia y severidad
Para favorecer el desarrollo natural del mildiu velloso durante los ensayos, se incrementó la humedad relativa (90-100%) mediante un sistema de nebulización. La incidencia y severidad se evaluaron inmediatamente después de la aparición de los primeros síntomas, posteriormente a intervalos semanales. El porcentaje de incidencia se calculó contabilizando el número de tallos con síntomas con relación a los 10 tallos evaluados por unidad experimental. La severidad de la enfermedad se determinó mediante una escala porcentual de acuerdo a Rebollar et al. (2012) con las siguientes clases: 0= (no síntomas), 1= hasta 5%, 2= 5-10%, 3= 10-25%, 4= 25-50%, 5= 50-75% y 6= >75% de área foliar cubierta con lesiones. Los valores se transformaron a porcentaje de severidad mediante la ecuación de Townsend y Heuberger (1943). Los datos de incidencia y severidad se transformaron a área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), aplicando el método de integración trapezoidal (Campbell y Madden, 1990).
Resultados y discusión
Caracterización morfométrica
El patógeno asociado con la enfermedad fue identificado como Peronospora sparsa Berk. con base en la sintomatología mostrada en las hojas, que se caracterizó por el desarrollo de manchas irregulares de color púrpura a café oscuro en el haz de las hojas (Figura 1A y 1B), mientras por el envés se observaron los signos del patógeno (esporangióforos y esporangios), posteriormente se evidenció la abscisión de las hojas. Dichos síntomas concuerdan con los reportados por Horst y Cloyd (2007). Se observaron esporangióforos hialinos emergiendo de los estomas en el envés de las hojas, de 150-240 x 7.5-12 µm, con ramificación dicotómica de 3 a 4 veces con puntas bifurcadas (Figura 1C y D). Los esporangios fueron hialinos, subglobosos a elipsoidales, de 17.5-25 x 12.5-17.5 µm, con pared de textura rugosa y en la base presentó una papila de germinación (Figura 1E y 1F). Características morfométricas que coinciden con los reportes de Achar (1997); Horst y Cloyd (2007); López-Guisa et al. (2013).
Caracterización molecular
Secuenciación del producto de la región ITS del rDNA amplificado por PCR usando los primers PS3 y PS1 (Aegerter et al., 2002) permitió amplificar una secuencia de nucleótidos de 689 pb. Al comparar la secuencia de nucleótidos de este estudio (número de depósito KJ817198), con las depositadas en el GenBank, el análisis BLAST mostró una identidad de 99% con accesiones de Peronospora sparsa sobre Potentilla reptans (DQ874342) en Korea (Choi et al., 2007) y en Rubus sp. (EU369694) de México (Revollar-Alviter et al., 2008) y 98% con secuencias aisladas de Rosa multiflora (AY608610) en Korea, Rubus fruticosus (EU391654) de Dinamarca y en Rosa sp. (AF266783) de Inglaterra (Cooke et al., 2000; Choi et al., 2005; Sundelin et al., 2009).
Evaluación de incidencia y severidad
El ABCPE de la incidencia y severidad mostró diferencias significativas (p˃ 0.05) entre tratamientos (Cuadro 2). El tratamiento con fosfito de potasio a dosis de 2.5 mL L-1 redujo significativamente la incidencia (7.6% en verano y 58% en otoño) y la severidad (50.3% en verano y 84.2% en otoño) de Peronospora sparsa, esto con respecto al testigo. Resultados similares han sido reportados por Chavarro-Carrero et al. (2012), quienes demostraron que aplicaciones periódicas de fosfito de potasio (2.5 mL L-1) sobre rosal var. Bingo White® redujeron la incidencia hasta 35% y la severidad en 6.3% de P. sparsa.
Cuadro 2 Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) para la incidencia y severidad de P. sparsa en el cultivo de rosa var. Lupita®.
| Tratamiento | Incidencia | Severidad | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Verano | Otoño | Verano | Otoño | ||
| Fosfito de potasio | 2 135 A | 1 286.2 A | 1 014.4 A | 258.1 A | |
| Silicio | 2 205 A | 2 660 BC | 1 624.8 B | 542.5 A | |
| Quitosano | 2 187.5 A | 2 817.5 BC | 1 676.5 BC | 1 255.6 B | |
| Mefenoxam | 2 187.5 A | 2 852.5 BC | 1 739.9 BC | 1 255.6 B | |
| Testigo | 2 310 B | 3 062.5 C | 2 039.7 C | 1 631.8 B | |
Medias con una letra en común no son significativamente diferentes, Tukey (p˃ 0.05).
Recientemente, Boyzo-Marín et al. (2015) reportaron que el tratamiento con fosfito de potasio en zarzamora redujo la incidencia de P. sparsa de 0.66 a 13% en comparación con el testigo. El efecto de los fosfitos se debe a que son compuestos que se mueven sistémicamente a través del xilema y el floema (Cooke y Little, 2001), actuando directamente en el desarrollo del patógeno, inhibiendo el crecimiento micelial, provocando la deformación de las hifas y lisis de la pared celular (King et al., 2010), o indirectamente a través de la activación de los mecanismos de defensa de las plantas a través de la vía del ácido salicílico (Massoud et al., 2012).
Los resultados de este estudio también indican que el silicio puede ser una alternativa para el manejo de esta enfermedad, puesto que en el verano hubo una reducción significativa de incidencia (4.5%) y severidad (20.3%), con respecto al testigo. En la temporada de otoño la incidencia disminuyó 13.1%, pero sin diferencia estadística, mientras que en la severidad se observó una reducción significativa de 66.8%, en contraste con el testigo (Cuadro 2). Al respecto, Ratnayake et al. (2016), reportaron que la aplicación de silicato de potasio (200 ppm) en plantas de Momordica charantia L., redujo significativamente la severidad de Pseudoperonospora cubensis (Berk. & M. A. Curtis) Rostovzev, de 37-53%, en comparación con el testigo.
Resultados similares fueron obtenidos por Garibaldi et al. (2012), quienes reportaron que la aplicación de silicato de potasio, redujo la incidencia y la severidad del mildiu velloso causado por Bremia lactucae Regel, en plantas de lechuga (Lactuca sativa L.). El efecto del silicio es atribuido a la creación de barreras físicas (grosor de la cutícula) por la acumulación del mismo en las hojas, lo que impide la penetración de los patógenos y por la estimulación directa de las respuestas en el hospedero (Rodrígues et al., 2005; Ma y Yamaji, Ma 2006; Ratnayake et al., 2016).
Por otra parte, el tratamiento con quitosano únicamente redujo significativamente la incidencia de P. sparsa en la temporada de verano, contrastando con el testigo, mientras que la severidad no se redujo en ninguna de las dos temporadas (Cuadro 2). Los resultados posiblemente se relacionan con la concentración aplicada, el peso molecular, el grado de desacetilación y el tipo de quitosano, tal como lo reportan Bautista-Baños et al. (2006) y Kong et al. (2010).
Similarmente, el fungicida mefenoxam no inhibió de manera absoluta el desarrollo de P. sparsa, puesto que los valores de ABCPE fueron estadísticamente iguales al testigo a excepción de la incidencia observada en la temporada de verano (Cuadro 2). Una tendencia similar fue observada por Quiroga y Arbeláez (2004), quienes reportaron que aplicaciones de mefenoxam al suelo y al follaje no controlaron eficazmente el desarrollo de P. sparsa en el cultivo de rosa en Colombia. La resistencia a mefenoxam también ha sido observada en un aislamiento de Peronospora belbahrii Thines sobre albahaca (Ocimum basilicum L.) en Israel (Cohen et al., 2013).
La pérdida de sensibilidad del patógeno al mefenoxam encontrada en el presente trabajo, puede deberse al desarrollo de resistencia de P. sparsa, lo que sugiere analizar el uso de mefenoxam en la producción de rosa, sobre todo porque este fungicida es ampliamente usado en México para el manejo de este patógeno. Otro factor que pudo influir fue la presión de la enfermedad, tal como lo reportan Walter et al. (2004) quienes demostraron que el metalaxyl no tuvo un efecto considerable para el control de P. sparsa en zarza boysen (Rubus hybrid) cuando se observó presión alta de la enfermedad.
Evaluación de longitud y diámetro de tallo floral
El tratamiento con fosfito de potasio en plantas de rosa var. Lupita® incrementó significativamente la longitud de tallos de 24.8% y 97.5% en la temporada de verano y otoño respectivamente, contrastando con el testigo, que indujo la menor longitud en ambas temporadas (Cuadro 3). Similarmente, las plantas tratadas con fosfito de potasio, mostraron los mayores diámetros de tallo con 7.5 y 6.2 mm en la temporada de verano y otoño respectivamente, y fueron estadísticamente diferentes (p˃ 0.05) con respecto al testigo (Cuadro 3). A pesar, que no existen evidencias que demuestren los efectos positivos del fosfito de potasio en flores y especies ornamentales (Gómez-Merino y Trejo-Téllez, 2015), los resultados de la presente investigación permiten inferir que aplicaciones de fosfito de potasio en plantas de rosal, incrementa la longitud y diámetro de tallos; por lo que se convierte en una alternativa para el manejo integrado de dicho cultivo. Resultados similares han sido reportados en otros cultivos, por ejemplo; Glinicki et al. (2010) reportaron efectos beneficiosos del fosfito de potasio en los parámetros de crecimiento de tres cultivares de fresa; por su parte Tambascio et al. (2014) documentaron que la aplicación de fosfito de potasio en tubérculos (semilla) de Solanum tuberosum L. aceleró la emergencia e incrementó el área foliar y la materia seca.
Cuadro 3 Efecto de los tratamientos en longitud y diámetro de tallos florales de rosa variedad Lupita®.
| Tratamiento | Longitud (cm) | Diámetro (mm) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Verano | Otoño | Verano | Otoño | ||
| Fosfito de potasio | 76.1 A | 39.3 A | 7.5 A | 6.2 A | |
| Silicio | 61.8 B | 22.9 B | 6.8 BC | 4.6 BC | |
| Quitosano | 61.9 B | 21.7 B | 7.1 B | 4.8 B | |
| Mefenoxam | 66.1 B | 23.7 B | 7.4 A | 4.7 BC | |
| Testigo | 61 B | 19.9 B | 6.6 C | 4.4 C | |
Valores con una letra en común no son significativamente diferentes, Tukey (p˃0.05).
Además, en cítricos y aguacate, se ha demostrado que una sola aplicación foliar de fosfitos incrementa la intensidad floral, el rendimiento, el tamaño de fruto, los sólidos solubles totales y la concentración de antocianinas (Lovatt y Mikkelsen, 2006).
Así mismo, se ha demostrado que las aplicaciones de silicio tienen efectos benéficos sobre el crecimiento y calidad de las rosas (Hwang et al., 2005; Reezi et al., 2009). Sin embargo, en nuestros ensayos la aplicación de silicio no mostró diferencias significativas sobre la longitud y diámetro de tallos florales, esto con respecto al testigo (Cuadro 3). Los resultados pudieron estar relacionados con la dosis de aplicación, ya que existen evidencias que demuestran que dosis altas de silicio provocan una reducción en la longitud y diámetro de tallos de rosa (Reezi et al., 2009), en Gerbera jamesonii L. Bolus, disminuye la longitud de tallo y provoca deformación de flores (Kamenidou et al., 2010).
Con respecto al quitosano, se observó un incremento en la longitud de tallo 1.5% en verano y de 9% en otoño, pero sin diferencia significativa con respecto al testigo. Mientras que en el diámetro de tallo se observaron incrementos de 7.6 y 9.1% para el verano y el otoño respectivamente, y fueron estadísticamente diferentes (p˃ 0.05) al compararlos con el testigo (Cuadro 3). Algunos reportes indican que la aplicación de quitosano presenta mejoras significativas sobre el crecimiento y desarrollo en cultivos ornamentales, tales como gerbera (Wanichpongpan et al., 2000), orquídeas (Chandrkrachang, 2002), lisianthus (Ohta et al., 2001), Lilium spp. (Kim et al., 2005) y Gladiola (Ramos-García et al., 2009). Sin embargo, es importante destacar que el éxito del quitosano puede estar asociado con la concentración utilizada, el peso molecular y el grado de desacetilación (Aranaz et al., 2009; Salachna y Zawadzińska, 2014).
Conclusiones
La caracterización morfométrica y molecular confirmaron que Peronospora sparsa Berkeley es el agente asociado con el mildiu velloso del rosal en el municipio de Tenancingo, Estado de México, México. Las aplicaciones con fosfito de potasio y silicio redujeron la incidencia y severidad de P. sparsa, por lo que deben considerarse como alternativas viables para el manejo de la enfermedad. La aplicación semanal de fosfito de potasio (Nutriphite magnum®) tiene efectos positivos sobre la longitud y diámetro de tallo. El fungicida mefenoxam no inhibió de manera absoluta el desarrollo de P. sparsa.
