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El carbonato de calcio (CaCO3) es un compuesto abundante debido a sustancias inorgánicas originadas por organismos vivos, aspecto importante en el desarrollo de nuevos materiales y campo de aplicación (Shu-Chen et al., 2007). Estos presentan tres polimorfos cristalinos anhidros como calcita, aragonita y vaterita ordenados por su estabilidad termodinámica (Payne et al., 2007). De manera que la calcita se encuentra presente tanto en el nopal como en cáscaras de huevos, conchas de moluscos, crustáceos y otros biominerales (Shu-Chen et al., 2007). Los carbonatos poseen un radical discreto que dependen de las condiciones de presión y temperatura para dar origen a minerales de carbonato de calcio monohidratado (Young et al., 2003) o por su forma cubica específicos en especies vegetales (Franceschi y Horner, 1980).
En países en vías de desarrollo como México, el consumo de calcio en productos lácteos es limitado por su alto costo, presentándose como una alternativa el nopal verdura (Heaney, 2001; Fairweather, 2007). Para la absorción del cuerpo, el calcio está disponible en el nopal verdura a menos que presenten grandes concentraciones de ácido oxálico (C2H2O4) o fibra dietética (Kennefick y Cashman, 2000; Heaney, 2001; Charoenkiatkul et al., 2008) ya que limitan su formación al quedar secuestrado como oxalatos, impidiendo su absorción por el metabolismo, además el oxalato de calcio (CaC2O4) esta limitada por el tipo y forma de cristales el cual varía entre 8 y 50% del peso seco del cladodio (Gallaher, 1975; McConn y Nakata, 2004). Asimismo, el consumo de nopalito varía dependiendo del estado de maduración (entre 400 y 500 g) que reporta altos contenidos de calcio libre de oxalato (3.4 g en 100 g) (Rodríguez et al., 2007).
Por otra parte, se ha reportado que el nopal por su fisiología produce cristales de oxalato de calcio (Franceschi y Horner, 1980) clasificados en cuatro tipos por su morfología (Jáuregui et al., 2003) en: rafidios (cristales aciculares en agregados), drusas (agregados cristalinos esféricos), estiloides (cristales aciculares) y prismas. Donde la morfología de los cristales y distribución dentro de los tejidos de la planta son específicos, que puede ser en forma de whewellita (oxalato de calcio monohidratado) o de weddellita (oxalato de calcio dihidratado) (Franceschi y Horner, 1980).
Atendiendo la inquietud de conocer la forma y estructura de diferentes cristales presentes en el nopal Jauregui et al. (2003) utilizaron microscopía electrónica de barrido acoplada a una energía de espectrómetro de rayos X dispersivo (EDS), o con uso de la espectroscopia infrarroja sistemática para caracterizar la naturaleza química y depósitos de cristales (Moje y Baran, 2003), o caracterización de drusas de oxalato de calcio en tejido vegetal (Monje y Baran, 2009) o caracterización de células de inclusión de minerales incluyendo la composición química y su morfología mediante la identificación por difracción de rayos X (XRD) y microscopio petrográfico (Bárcenas et al., 2015).
Sin embargo, estas metodologías de caracterización de oxalatos y carbonatos de calcio requieren instrumentos muy específicos, de manera que se propone implementar procedimientos para el análisis de minerales dentro de las estructuras vegetales y su cuantificación a escala microscópica con micro fotomosaicos en Giga imágenes de secciones delgadas, como alternativa viable de análisis utilizando la microscopia de trasmisión. Esta propuesta metodológica fue empleada para cuantificar e identificar la distribución geoespacial en bacterias y microorganismos dentro de los componentes del suelo (Tarquini y Favalli, 2010; Gutiérrez et al., 2016).
A pesar de esto, la técnica no se ha aplicado en la caracterización de oxalatos y carbonatos de calcio por lo que se puede adaptar a tejidos vegetales, permitiendo que las fotografías secuenciales de los campos continuos puedan ser empleadas para formar imágenes compuestas o micro-fotomosaicos. La captura de imágenes secuenciales es muy precisa, y permite la generación de micromosaicos con alta resolución espectral y espacial (Gutiérrez et al., 2016), de alta precisión (Li et al., 2008).
No obstante, sigue siendo una limitante la cuantificación y distribución espacial de los oxalatos y carbonatos de calcio dentro de las estructuras vegetales, así como la localización de estos, al ser escasa la información de cómo cuantificar y caracterizar estos minerales en nopal verdura. El objetivo del presente trabajo fue describir un procedimiento de análisis de imágenes que se pueda utilizar para caracterizar carbonatos y oxalatos de calcio presentes en el nopal verdura (Opuntia ficus-indica L. Miller.) en imágenes compuestas derivadas de secciones delgadas de tejido vegetal; por lo anterior el supuesto, sugiere que el tamaño, cantidad y forma en los carbonatos de calcio, está relacionado con estrés hídrico, donde los diferentes niveles de deshidratación de cladodios influirán en su presencia o ausencia.
Procedimientos
La presente investigación se realizó en el Campo Experimental Marín en la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León durante los años 2015-2017. Las unidades experimentales se establecieron en contenedores de 36 cm de alto, 28.5 cm de diámetro, bajo condiciones controladas.
El sustrato utilizado reportó constantes diferenciales al estrés hídrico durante el desarrollo de los cladodios. El estrés consistió en disminuir la cantidad de agua disponible a 10% y 30% base al volumen, tomando como referencia la capacidad de campo (CC) y punto de marchitez permanente (PMP) del sustrato. Los momentos de riego se determinaron con base al peso periódico de las macetas hasta alcanzar los niveles de humedad referidos.
Las muestras de tejido vegetal fueron obtenidas de cladodios de 60 días, mediante cortes transversales de 4 cm2 y sometidas a un estado de deshidratación con acetona (CH3CH3) al 100% durante 6 días e impregnadas con resina al 90% y un monómero de estireno (C8H8) al 10%. La impregnación se llevó a cabo en una cámara de vacío durante 45 min a 15 lb de tensión, secado durante 15 días posteriores, una vez seca fueron cortadas colocándose en cubreobjetos fijados con resina apoxica y pulidas hasta 30 µm de espesor.
El análisis micromorfológico inició en capturar microimágenes secuenciales con diferentes fuentes de luz a un objetivo 10x utilizando una cámara digital montada en un microscopio petrográfico (Olimpus BX51), posteriormente fueron creados micro-fotomosaicos de alta resolución espacial. El análisis de imágenes fue empleando ERDAS Imagine 2014v®. La medición de los oxalatos y carbonatos de calcio se logró mediante la conversión de información raster en formato vectorial mediante ArcGIS v.10.1. Los procesos se basaron en la metodología reportada por Gutiérrez et al. (2016).
Discusiones
La captura de fotografías secuenciales con diferentes fases de luz: plana (Figura 1A), polarizada o cruzada (Figura 1B) y compensada (Figura 1C) formaron micro-mosaicos de alta calidad en resolución espacial en el tratamiento 10% y 30% de AD (Figura 2A, B, C).
Figura 1 Tratamiento de 10% AD. Construcción de mosaicos de alta resolución espacial en diferentes fuentes de luz y con diferentes objetivos. A) luz plana; B) luz polarizada o cruzada; y C) luz compensada.
Figura 2 Tratamiento de 30% AD. Construcción de mosaicos de alta resolución espacial en diferentes fuentes de luz y con diferentes objetivos. A) luz plana; B) luz polarizada o cruzada; y C) luz compensada.
La construcción de micro-mosaicos con técnica de giga imágenes permitió observar los cristales de oxalato de calcio (drusas) (Figura 3) y carbonatos (calcitas) con luz polarizada y compensada (Figura 4).
Figura 3 Visualización de cristales de oxalato de calcio con tres fuentes de luz. A) luz plana; B) Luz polarizada o cruzada; y C) luz compensada.
Figura 4 Carbonatos de calcio (calcita) con dos fuentes de luz. A) luz polarizada o cruzada; y B) luz compensada.
Otras ventajas del empleo de esta metodología fue la medición de los minerales, que arrojó como resultado una diferencia significativa entre los oxalatos de calcio de los tratamientos de 10 y 30% de AD (Figura 5) con diámetros de 5.9 y 11.11 µm respectivamente, logrando además la medición de los carbonatos de calcio (Figura 6).
Figura 5 Medición de oxalatos de calcio con un estrés hídrico del 10 y 30% de AD. A) oxalato de calcio del tratamiento de 10% de AD con un diámetro de 5.9 µm; y B) oxalato de calcio del tratamiento 30% de agua disponible con un diámetro de 11.11 µm.
Figura 6 Medición de carbonatos de calcio con estrés hídrico de 10 y 30% de AD. A) carbonato de calcio del tratamiento 10% de AD con una medida de 1.4 µm; B) carbonato de calcio del tratamiento 30% de AD con una medida de 2.2 µm.
Además, fue posible realizar una comparación de tamaños entre los núcleos de oxalato y los carbonatos de calcio de algunas muestras de los tratamientos de 10 y 30% de AD, demostrando así que por cada oxalato se encuentra un carbonato de calcio secuestrado (Figura 7) al comparar las imágenes del oxalato de calcio y carbonatos de calcio en diferentes fuentes de luz con microscopio petrográfico y barrido electrónico (Figura 8 y 9).
Figura 7 Comparación de medidas del núcleo de oxalatos de calcio y carbonatos de calcio. A) tratamiento de 10% de agua disponible, muestra la similitud en tamaño del núcleo del oxalato 1.38 µm y el carbonato 1.4 µm; y B) tratamiento de 30% de agua disponible, muestra la similitud en tamaño del núcleo del oxalato 2.4 µm y el carbonato 2.2 µm.
Figura 8 Comparación de fotografías del oxalato de calcio en diferentes fuentes de luz con microscopio petrográfico y electrónico. A) luz plana; B) luz polarizada o cruzada; C) luz compensada; y D) microscopio de barrido electrónico por McCoonn y Nakata (2004).
Figura 9 Comparación de fotografías del carbonato de calcio en diferentes fuentes de luz con microscopio petrográfico y electrónico. A) luz polarizada o cruzada; B) luz compensada; y C) microscopio de barrido electrónico por McCoonn y Nakata (2004).
También se practicó una comparación de medias de muestras representativas de los tratamientos de 10 y 30% de AD (Cuadro 1) donde el diámetro de los oxalatos fue significativamente mayor que los carbonatos de calcio con un diámetro de 71.39 µm.
Conclusiones
Se determina que el estrés hídrico inhibe y promueve el tamaño, cantidad y forma de los oxalatos y carbonatos de calcio dentro de las estructuras vegetales de nopal verdura. Mientras que la identificación y caracterización en muestras inalteradas en cladodio con diferente estrés fue posible usando técnicas de análisis multiespectral en giga imágenes de micro-fotomosaicos determinando la correlación existente entre los núcleos que por cada oxalato existe un carbonato de calcio indisponible.
