Para la desinfección del material vegetativo en fresa (Fragaria x annanasa Duch. cv Aromas)

En este caso, para la desinfección de plantas de fresa se seleccionaron brotes apicales que no presentaran síntomas de enfermedad. Se cortaron y almacenaron en agua destilada estéril con 150 mgL^-1 de ácido ascórbico previo a su manejo. Después de 1 h, los brotes se sumergieron en solución acuosa de jabón alcalino al 5% con 2 gotas de Tween-80 durante 15 min, en constante agitación. Después, se enjuagaron bajo el grifo de agua por 20 min. Bajo condiciones de asepsia en campana de flujo laminar se sumergió el material vegetativo en etanol al 70% por 30 s, enjuagando posteriormente en tres ocasiones con agua destilada estéril.

En seguida se sumergieron los explantes en una solución de hipoclorito de sodio comercial y agua destilada en relación 1:6 por 10 min, agitando suavemente, para luego enjuagar nuevamente en tres ocasiones con agua destilada estéril. A continuación, se sumergieron los entrenudos en solución de sales de mercurio, Thimerosal (Sigma Aldrich^®, CAS 54-64-8) al 0.05% por 10 min, enjuagando posteriormente con agua destilada estéril en tres ocasiones.

Para el establecimiento in vitro a partir de brotes apicales de fresa (Fragaria x annanasa Duch. cv Aromas)

Los brotes apicales ya desinfectados fueron sembrados en cuatro diferentes formulaciones de medios de cultivo, tres de ellos con micro y macro elementos, adicionados con orgánicos según la formulación MS modificado (Cuadro 1) (^{Murashige y Skoog, 1962}), suplementados con 1.11 µM de bencil-aminopurina (BAP), 0.87 µM ácido giberélico (GA) y 2.95 µM de ácido indolbutírico (IBA) para el primer tratamiento testigo (TT0); el primer tratamiento (TT1), fue suplementado con 4.44 µM de BAP, 0.29 µM GA y 4.92 µM de IBA; asimismo, el segundo tratamiento (TT2), con 2.22 µM BAP, 0.29 µM GA y 0.49 µM de IBA. Finalmente, otro medio de cultivo formulado con sales y vitaminas MS al 50%, suplementado con 0.44 µM BAP, 0.29 µM GA y 4.92 µM de IBA se identificó como el tercer tratamiento (TT3), utilizando los reguladores de crecimiento sugeridos por diversos autores quienes han reportado éxito en sus formulaciones (^{Boxus, 1974}; de López, 2001; Beltrán, 2002; ^{Caboniet et al., 2008}) (Cuadro 1).

Además, se agregaron a todos los tratamientos 1 g L^-1 de carbón activado, 5 g L^-1 de Phytagel (Sigma^®) y 30 g L^-1 de sacarosa marca Sigma^® CAS 71010-52-1. El pH se ajustó a 5.8 en todos los casos para posteriormente esterilizarse a 1.5 kg cm² de presión a 120 °C por 15 min. Después de sembrar los explantes, éstos se incubaron a una temperatura de 24 ±2°C, con una luminosidad de 86 µmol m^-2 s^-1 suministrada por lámparas LED modelo T8 TecnoLite^® y un fotoperiodo de 16/8 h durante 15 días. Después de ese tiempo, los explantes que mostraron crecimiento fueron transferidos en la misma formulación, por dos semanas más. Después de este lapso de tiempo, las variables evaluadas fueron porcentaje de contaminación, plantas necrosadas y explantes establecidos.

Para la desinfección del material vegetativo a partir de explantes nodales de frambuesa (Rubus idaeus L. cv Heritage)

Para la desinfección de frambuesa se seleccionaron plantas madre sanas. Se seccionaron segmentos de tallo de 30 cm de longitud que contaran con yemas axilares vegetativas. Dichos segmentos se resguardaron y colocaron en bolsas de plástico humedecidas previo a su desinfección. Se seccionaron los explantes dejando una yema vegetativa por sección, y se sumergieron en solución de jabón alcalino al 5% con dos gotas de Tween-80 durante 15 min. Luego, se enjuagaron bajo el grifo de agua por 30 min.

Después se trasladaron a condiciones de asepsia en campana de flujo laminar sumergiendo los explantes en etanol 70% durante 30 s, enjuagando posteriormente en tres ocasiones con agua destilada estéril A continuación se sumergieron en solución de sales de mercurio, Thymerosal (Sigma Aldrich^®) al 0.05% por 15 min, para luego enjuagar tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente se sumergieron los explantes en una solución de hipoclorito de sodio comercial con agua destilada estéril en relación (1:6) por 10 min, agitando suavemente, para inmediatamente enjuagar en tres ocasiones. Finalmente, se sumergieron los explantes en solución de ácido ascórbico (150 mg L^-1) y se almacenaron por 24 h a 4 °C.

Para el establecimiento in vitro del material vegetativo en frambuesa (Rubus idaeus cv Heritage)

Se utilizaron dos técnicas de micropropagación para introducir a condiciones in vitro el material vegetativo de frambuesa, la de segmentos nodales (entrenudos) y la de meristemos axilares.

En el caso de los entrenudos, después de 24 h éstos fueron seccionados en explantes de 2-3 cm y sembrados en cuatro diferentes medios de cultivo. El primer tratamiento (TT1) constó de un medio MS modificado, adicionado con 19.75 µM BAP y 0.04 µM de IBA, de acuerdo a ^{Minas y Neocleus (2007)}. El segundo (TT2) se formuló igual al anterior, pero con la diferencia de que se agregaron 20.2 µM de Tidiazuron (TDZ) en lugar de BAP, ya que esta citocinina ha sido usada ampliamente en la propagación de tejido vegetativo de frambuesa (^{Gajdošová et al., 2006}; ^{Dai et al., 2006}; Cappeletti et al., 2006). El tercero (TT3) se formuló con sales MS y vitaminas LS (^{Linsmaier y Skoog, 1965}), además de 4.4 µM de BAP, 0.29 µM de GA y 0.49 µM de IBA (^{Poothong y Reed, 2015}). Finalmente, el cuarto medio de cultivo (TT4) se formuló de acuerdo a ^{Sigarroa y García (2011)}, el cual constó de un medio MS con vitaminas modificadas más 4.44 µM de BAP y 1.44 µM de GA, como se muestra en el Cuadro 2. En el caso de los meristemos, éstos fueron extraídos con ayuda de pinzas y bisturí estériles y utilizando un microscopio óptico del tipo estereoscopio marca VANGUARD^® a 2x su aumento.

Se retiraron las brácteas de las yemas axilares y se sembró el tejido meristemático en medio de cultivo MS modificado adicionado con 4.44 µM de BAP y 1.44 µM GA (TT1M), de acuerdo a ^{Sigarroa y García (2011)}. Se agregaron en todos los casos 1 g L^-1 de carbón activado, 5 g L^-1 de Phytagel (Sigma^® CAS (71010-52-1) como agente gelificante y 30 g L^-1 de sacarosa, marca SIGMA^® (CAS 57-50-1). El pH del cultivo se ajustó a 5.7 en el caso de los entrenudos y seis para los meristemos (^{Sigarroa y García, 2011}; ^{Poothong y Reed, 2015}) para posteriormente esterilizarse a 1.5 kg cm² de presión a 120 °C por 15 min.

Después de sembrado, se transfirió el material vegetativo a una cámara de transferencia con condiciones controladas de temperatura de 24 ±2 °C en condiciones de total oscuridad. Transcurridos siete días, fueron transferidos a condiciones de luminosidad de 86 µmol m^-2 s^-1 suministrada por lámparas LED modelo T8 TecnoLite^® y un fotoperiodo de 16/8 h. Luego de 21 días, se evaluaron los porcentajes de contaminación, plantas necrosadas y explantes establecidos.

Análisis estadístico

En el caso de la micropropagación de fresa, las variables cualitativas evaluadas fueron el porcentaje de contaminación, que evalúa el éxito del tratamiento de desinfección, el porcentaje de plantas necrosadas, el cual evalúa la formulación del medio de establecimiento y el porcentaje de explantes establecidos (Marulanda et al., 2000; ^{Sigarroa y García, 2011}), las repeticiones fueron 10 unidades para cada uno de los cuatro tratamientos, y éstos se analizaron utilizando un diseño experimental completamente al azar en condiciones homogéneas.

Estas variables se analizaron mediante las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis debido al pequeño numero de repeticiones por tratamiento con el cual no es valida de chi² para prueba de proporciones, se aplicó la prueba de Dunn, para la separación de medias ^{Neave y Worthington (1988)}, utilizando el paquete estadístico Minitab^® versión 17.1.0.

En el caso de la frambuesa, se evaluaron el número de plantas necrosadas, y los explantes establecidos, tanto de los entrenudos. Las repeticiones fueron 65 unidades por tratamiento. Los datos fueron analizados mediante el modelo de regresión logística, utilizando como variable independiente los tratamientos y la respuesta al necrosamiento y establecimiento. Todos los datos se procesaron en el software IBM SPSS Statistics 20.

Necrosis

La mayoría de las plantas producen compuestos fenólicos después de pasar por etapas de estrés, tales como la que produce el contacto con agentes desinfectantes, por lo cual, se debe tener cautela en la concentración de los mismos a la hora de aplicarlos en tejidos vegetales, este procedimiento es imprescindible para poder establecer material vegetativo bajo condiciones in vitro (^{Rostami y Reza, 2012}). Estos compuestos afectan el crecimiento y sobrevivencia de los explantes, oxidando los tejidos y llevando a la necrosis y muerte del mismo.

Para evitar esto, lo recomendable es agregar antioxidantes en el medio, así como aumentar la frecuencia de los subcultivos (^{Swartz y Lindstrom, 1986}). Otras opciones para evitar los procesos de oxidación que conllevan al oscurecimiento de los tejidos y su posterior muerte son el uso de un medio de cultivo líquido, cambio del agente gelificante, uso de carbón activado, adición de ácido ascórbico y de polivinil polipirrolidona; sin embargo, ya que el problema es complejo, se requiere una solución integral que involucre a un mayor número de variables (^{Azofeifa, 2009}; ^{García et al., 2010}).

En la presente investigación se buscó contrarrestar la oxidación de los tejidos mediante la aplicación de carbón activado al medio de cultivo y la colocación de los explantes en condiciones de oscuridad por un lapso de tiempo. El carbón activado se distingue del carbón elemental por su ausencia de impurezas y forma casi grafítica, una fina red de poros, una extraordinariamente grande área superficial y un volumen que le confiere una capacidad de absorción única, ayudando así a disminuir los efectos de la oxidación tisular. De la misma forma, disminuir la intensidad luminosa evita la oxidación y necrosamiento de los tejidos (^{Swartz y Lindstrom, 1986}; ^{Thomas, 2008}). En este ensayo, en el caso de fresa, los tratamientos que presentaron mayor porcentaje de oxidación y posterior necrosis fueron el TT3, con 40% y TT4, 70%; por otro lado, los TT1 y el TT2 solo presentaron 10%; es decir, un porcentaje bajo de tejido necrosado. En el ensayo para frambuesa, el porcentaje de necrosis en general fue alto, con un promedio de 78.1%, a pesar de la adición del carbón activado al medio de cultivo y de haber colocado los explantes bajo condiciones de oscuridad por 7 días.

El tratamiento con el porcentaje de necrosis más bajo fue el TT1, con 27.69% y de acuerdo a la prueba de Mann-Wittney, el TT1 de meristemos mostró una diferencia estadística significativa respecto a los otros tratamientos, con un porcentaje de necrosis alto (Cuadro 3). En esta técnica se cultivan porciones milimétricas de tejidos provenientes de yemas axilares o apicales, cada porción consiste en un fragmento de la región meristemática con o sin primordios foliares, por lo tanto, estos diminutos fragmentos de tejido son más sensibles a la oxidación (^{García et al., 2011}; ^{George et al., 2008}).

Contaminación

El proceso más importante previo al establecimiento del cultivo es la formulación idónea en la aplicación de agentes desinfectantes y antioxidantes, asi como los tiempos en los que se someten los explantes en el proceso de desinfección. Ya que en condiciones in vitro algunos microorganismos como bacterias y hongos encuentran un ambiente óptimo para desarrollarse, una desinfección no exitosa obstaculiza el progreso de la propagación, por ello la aplicación de sustancias y el empleo de técnicas desinfectantes se centran en eliminar a dichos microorganismos no deseados, entre ellos las sales de mercurio en porcentajes del 0.05-0.15%. (Mikropavai-Rošana et al., 2009; ^{Yildiz, 2012}).

Respecto a la evaluación de la variable de contaminación en fresa, cv Aromas, se encontró que el TT2 mostró mayor porcentaje de explantes con presencia de microorganismos (30%), mientras que los TT3 y TT4 solo presentaron 10% de explantes contaminados. En general el protocolo de desinfección presentó valores aceptables en los tratamientos TT3 y TT4, como se aprecia en el Cuadro 3.

Establecimiento

En el caso de fresa, cv Aromas, los cuatro tratamientos fueron estadísticamente diferentes al ser analizados mediante las pruebas de Kruskal-Wallis y Dunn, mediante la comparación de las diferencias entre los tratamientos. El tratamiento que mejor se comportó fue el TT4, con mayor número de explantes establecidos con éxito (70%). En la Figura 1 y Figura 2, se ilustra, que efectivamente el tratamiento formulado según ^{Caboni et al. (2008)}, al utilizar la combinación de BAP+GA+IBA, se potencializa de una manera mas eficiente la actividad hormonal obteniéndose una respuesta vegetativa mas eficiente que en los otros casos, con un porcentaje de 70% de explantes establecidos.

Figura 1 Comparativo de la respuesta en establecimiento, contaminación y necrosamiento a las diferentes formulaciones o tratamientos evaluados en fresa, cv Aromas. Se aprecia que en el tratamiento TT4, la diferencia es menor. Se utilizaron pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis para la separación de medias y la prueba de Dunn de comparaciones múltiples, del paquete estadístico SPSS^® versión 20. 

Figura 2 Material vegetativo de fresa cv Aromas; a) explantes de brotes apicales de fresa; b) explantes establecidos en medio de cultivo; c) explante en medio de cultivo con carbón activado. 

Frambuesa

En el caso de frambuesa, cv Heritage, las pruebas de Kruskal-Wallis y Dunn (referencia), para analizar las diferencias estadísticas en la utilización de meristemos contra entrenudos, se encontró que fue mejor el tejido internodal para establecerse, no así en el caso de los meristemos, siendo que, en ese tejido, aun cuando fue el que presentó el menor porcentaje de contaminación (1.54%), tuvo un porcentaje muy bajo de establecimiento con respecto al tejido intermodal. En la Figura 3 se aprecia la marcada diferencia entre tratamientos utilizando esquejes contra células meristemales.

Figura 3 Diferencia estadística en el establecimiento de entrenudos y meristemos expresado en porcentaje, frambuesa cv Heritage. Utilizando pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis y la prueba de Mann-Whitney de dos proporciones del paquete estadístico Minitab^® versión 17.1.0 

En el caso de la respuesta a los tratamientos mediante formulaciones distintas reportadas, se encontró que el análisis de regresión logística, en respuesta a los tratamientos, para el caso de la formulación del TT4 (4.44µM de BAP + 1.44µM de GA) (^{Anderson, 1980}; ^{Sigarroa, 2011}) fue el mejor a la respuesta de establecimiento con respecto a los demás tratamientos, ya que tuvo mucho menor necrosamiento. Se ha reportado que la micropropagación por medio de meristemos permite no solo la obtención de plantas de alta calidad y mayor uniformidad, sino también la propagación de clones específicos libres de patógenos, logrando reducir la contaminación endógena hasta un nivel mínimo sin necesidad de aplicar protocolos de desinfección más agresivos (^{Sigarroa y García, 2011}). Pero también la respuesta vegetativa a las formulaciones nutritivas, determinan el éxito, en la pronta respuesta al medio de cultivo (^{Sincha et al., 1987}; ^{Reed, 1990}; ^{Reed et al., 2013}).

Aun cuando se ha reportado que para frambuesa, el medio formulado con sales MS, expresan pobre crecimiento y problemas de desarrollo in vitro^{Greenwayet et al. (2012)}, en este caso la Figura 4 muestra los resultados estadísticos de los rangos entre las diferencias de las formulaciones o tratamientos evaluados, siendo efectivamente el TT4 que tuvo diferencia estadística significativa, al utilizarse entrenudos com material vegetativo para establecimiento y a la combinación de hormonas 4.4 µM de BAP + 1.44 de GA (^{Sigarroa y García, 2011}).

Figura 4 Efecto de la formulación en expantes contaminados, necrosados y establecidos de frambuesa cv Heritage por tratamientos evaluados. Analizados mediante el modelo de regresión logística, utilizando como variables independientes el efecto de los tratamientos, al necrosamiento por establecimiento, obteniendo Χ². Realizado en el paquete estadístico IBM SPSS Statistics 20.  

En frambuesa solo en dos tratamientos se pudo observar el establecimiento de los explantes. El TT4 de entrenudos presentó el porcentaje más alto de éxito, alcanzando 56.92% de explantes establecidos (Figura 5). Con la prueba de dos proporciones, se encontró que existen diferencias estadísticamente significativas entre dicho tratamiento y los explantes de la técnica de meristemos.

Figura 5 Material vegetativo de frambuesa cv Heritage; a) tejido meristemático observado en microscopio estereoscopio a 2x; b) entrenudo de frambuesa, desinfectado y listo para plantarse; c) explante a partir de tejido meristemático en pleno crecimiento; d) explante en crecimiento a partir de segmento nodal.