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Introducción
El género Tagetes (Asteraceae) se conforma de aproximadamente 56 especies distribuidas en el continente americano, la mayoría se localiza en México (Soule, 1996). Estas plantas tienen propiedades biológicas contra organismos dañinos a cultivos de importancia: bacterias, hongos, nematodos, insectos y malezas (Serrato y Quijano, 1993). Tales propiedades de Tagetes son por la presencia de metabolitos secundarios como alcoholes, éteres, ésteres, aldehídos, cetonas, flavonoides y tiofenos que actúan como defensas químicas contra plagas y enfermedades (Duke, 2008).
En forma natural, estos compuestos químicos pueden ser liberados por volatilización, exudados radiculares, lixiviación y por descomposición de residuos (Halbrendt, 1996). Mediante manejo de material vegetal se ha logrado obtener sustancias vegetales como polvos, extractos (acuosos o con solventes) y aceites esenciales que se han evaluado por su efecto contra hongos. En el caso de algunas especies de Tagetes, los extractos vegetales presentan efectos antifúngicos; por ejemplo, extractos acuosos, polvos de hojas, flores y raíces de T. erecta tienen efecto fungicida contra Drechslera oryzae, Pyricularia orizae y Uromyces phaseoli (Grainge y Ahmed, 1988) y extractos de hojas y flores de T. patula son fungistáticos en Monilia spp. (Teodorescu et al., 2009); no obstante, son pocos los estudios toxicológicos al respecto, particularmente bioensayos con aceites esenciales (Serrato-Cruz et al., 2007).
Entre algunos hongos fitopatógenos de importancia económica, por el daño que causan a diversos cultivos, se encuentran: Fusarium oxysporum (Ascomiceto), causante de enfermedad en cultivos como sorgo (Sorghum bicolor), maíz (Zea mays) y alfalfa (Medicago sativa) en sus diferentes etapas fenológicas, así como en árboles frutales y forestales (Singh et al., 2007), Penicillium spp. (Ascomiceto) causa pudriciones en postcosecha de granos básicos (Lemmen, 1999); Aspergillus spp. (Ascomiceto) en condiciones de alta humedad en postcosecha produce moho en hortalizas como lechuga, jitomate y acelgas (Raper y Fennell, 1965) y Rhizoctonia solani (Basidiomiceto) provoca la pudrición de semillas en poscosecha de numerosas especies hortícolas (Anderson, 1982).
Como parte del control de estos hongos, se ha recurrido al empleo de sustancias de origen vegetal, entre ellas, los aceites esenciales de cebolla (Allium cepa) o de ajo (Allium sativum) que, evaluados in vitro contra A. niger, F. oxysporum y Penicillium cyclopium no se observó un efecto antifúngico para la primera especie, pero en las demás, se presentó una actividad fungistática (Benkeblia, 2004). Contra los mismos hongos, el aceite esencial de orégano (Origanum syriacum) también produce fuerte acción inhibitoria (Daouk et al., 1995). Hasta ahora no se ha evaluado el efecto del aceite esencial de Tagetes contra estos hongos, aunque se tienen resultados sobre otras especies; por ejemplo, el aceite de T. patula usado contra Botrytis cinerea y Penicillium digitatum en condiciones in vitro inhibe el crecimiento de micelio a dosis de 10 µL mL-1 y 1.25 µL mL-1, respectivamente.
Refiere (Romagnoli et al., 2005), el aceite esencial de hojas de T. erecta en 2 µL mL-1 inhibe completamente el crecimiento de Pythium aphanidermatum (Kishore y Dwivedi, 1991) y los aceites de T. minuta y T. filifolia tienen actividad antifúngica contra Sclerotium cepivorum, Colletotrichum coccodes y Alternaria solani inhibiendo el crecimiento micelial (Zygadlo et al., 1994). Considerando que más de 50% de las especies de Tagetes se distribuyen en México, la realización de estudios sobre posibles actividades biológicas contra organismos patógenos en la agricultura puede resultar valiosos (Serrato-Cruz, 2014).
La especie Tagetes lucida Cav., conocida como ‘pericón’, se encuentra distribuida en los principales sistemas montañosos de México en clima templado y transicional (Turner, 1996), es una planta herbácea, perenne, de hasta 1 m de altura, con fuerte olor a anís al estrujarse (Villarreal, 2003). El extracto metanólico de esta planta inhibe el crecimiento de bacterias como Escherichia coli, Salmonella sp. y Shigella sp., así como en las especies del género Fusarium debido a la acción de los componentes dimetoxi-fenólicos presentes en el extracto, como la escoparona (6,7-dimetoxicoumarina) responsable de presentar una alta inhibición sobre el crecimiento micelial de Fusarium en dosis de hasta 250 µg mL-1 (Céspedes et al., 2006).
Otros estudios, como el de Barajas et al. (2011), muestran la actividad fungitóxica que tiene el aceite de T. lucida contra los hongos Monilina fructicola y Sclerotium rolfsii a concentraciones 0.1 y 2 µL mL-1, reduciendo la producción de esclerocios. En el aceite esencial de T. lucida se ha determinado la presencia de metil eugenol (Bicchi et al., 1997) y de metil chavicol o estragol (Marotti et al., 2004), compuestos a los que se atribuye diferentes características con potencial de ser explotados como insecticidas o bactericidas, y en general, como plaguicidas botánicos (Koul et al., 2008). No obstante, se desconoce sobre la variabilidad del contenido de aceites esenciales de poblaciones de T. lucida de México (Serrato-Cruz et al., 2007) y son escasos los trabajos sobre sus propiedades antifúngicas.
La caracterización del perfil de aceite esencial de poblaciones de T. lucida y su evaluación toxicológica contra hongos fitopatógenos de importancia económica como F. oxysporum, P. janthinellum, A. niger y R. solani es un paso necesario para el aprovechamiento de recursos naturales locales en estrategias de control orgánico para la producción agrícola. En el estado de Hidalgo se distribuyen ocho especies de Tagetes (Villavicencio et al., 2010) y por las características climáticas de la entidad (INEGI, 2007), la presencia de T. lucida es importante (Serrato-Cruz, 2014). En el presente trabajo se determinó el contenido de aceite esencial de T. lucida proveniente de una población de Atotonilco, Hidalgo, México y se evaluó su actividad biológica in vitro contra los hongos antes referidos.
Materiales y métodos
Material vegetal
El 26 de octubre de 2014 se recolectó la parte aérea de plantas de T. lucida (Figura 1) en etapa fenológica de floración terminal en la localidad de Tiltepec (20° 18’ 47” latitud norte y 98° 40’ 58” longitud oeste y 2 000 msnm), perteneciente a la población de Atotonilco el Grande, Hidalgo (Figura 2), de clima predominante templado semifrío C(E)(f) (INEGI, 2007). Las semillas acondicionadas se ingresaron al Banco de Germoplasma Salvador Miranda Colín de la Universidad Autónoma Chapingo con código de accesión ELL-001-2016, también se ingresaron ejemplares herborizados al Herbario CHAP perteneciente a la División de Ciencias Forestales de la UACH (voucher 67732). Los tallos florales se cortaron en trozos de 4 a 5 cm utilizando cuchillo de cocina. Desde la recolecta del material hasta la realización de la destilación transcurrieron alrededor de 2 h.
Extracción, rendimiento de aceite e identificación de compuestos
La extracción del aceite esencial se llevó a cabo mediante hidrodestilación en dos modalidades: a nivel laboratorio en un destilador de cristal modelo italiano de 6 L de capacidad (área de usos múltiples en invernaderos del Instituto de Horticultura, en la Universidad Autónoma Chapingo, UACH) y a nivel piloto mediante destilador de acero inoxidable con capacidad de 50 kg (planta piloto de extracción de aceites esenciales en el Campo Experimental de Fitotecnia de la UACH).
Para realizar la extracción (repetición) a nivel laboratorio, se utilizó 1.5 kg de material vegetal fresco para una destilación realizando cuatro repeticiones, el periodo de la destilación fue de 45 min. Para la extracción a nivel piloto se utilizaron 46 kg de material fresco, el tiempo de hidrodestilación fue de 3 h a partir de la precipitación. Del destilado se obtuvieron dos fases (acuosa y aceitosa), la parte aceitosa fue separada y conservada en frascos ámbar conservados en cuarto oscuro a temperatura de 18 ±2 °C. El rendimiento de aceite esencial se obtuvo referido en biomasa fresca.
Para la identificación de los componentes del aceite esencial, se utilizó el extracto óleo de la destilación a nivel piloto y se analizó mediante cromatografía de gases con detector de masas (Adams, 2001). Cromatógrafo modelo CG 7890A (Agilent Technologies, USA) acoplado a un detector selectivo de masas 5975C Inert MSD con un detector triple eje (Agilent Technologies, USA) con ionización por impacto eléctrico (IE) de 70 eV. Se utilizó una columna HP-5ms® (California, USA), empacada con 5% difenil- 95% dimetilpolisiloxano. Las temperaturas del inyector y del detector se mantuvieron a 250 y 280 °C, respectivamente y se alcanzaron a una velocidad de 10 °C min-1.
La temperatura inicial del horno fue de 70 °C, durante 1 min y posteriormente se programó para alcanzar las temperaturas y la velocidad antes señaladas. La velocidad de flujo del gas acarreador (helio) se mantuvo a 1 mL min-1. Las muestras se diluyeron (1/100) en acetona (v/v) de 1 μL y posteriormente se inyectaron en el equipo en modo “Split” automático mediante un inyector 7683D (Agilent Technologies, USA), se realizaron tres repeticiones. Los datos de abundancia relativa se obtuvieron a partir del porcentaje de área de los picos cromatográficos. Como compuestos mayoritarios se consideraron aquellos con más de 5% de abundancia relativa. El intervalo de masas detectado fue de 35-500 m z-1.
Los compuestos n-alcanos, n-octano (C8 H18) y n-octadecano (C18 H38), se usaron como referencias en el cálculo de los índices de Kovats. La identificación de los componentes se realizó por comparación de los índices de retención relativa, más los espectros de masas comparados con la base de datos NIST 05 del sistema GC-MS (National Institute of Standard and Technology) y con los datos espectrales publicados por la Carol Stream Corp., USA (Adams, 2001).
Evaluación de efectos antifúngicos
Las cepas de los hongos A. niger, R. solani, F. oxysporum y P. janthinellum, provenientes de cultivos del Campo Agrícola Experimental de la UACH, se aislaron e identificaron en el Laboratorio de Micología Agrícola del Departamento de Parasitología de la UACH. Para reproducir cada una de las cepas, a partir del inóculo inicial establecido en caja Petri (100×15 mm) con medio PDA (200 g papa, 20 g dextrosa, 20 g agar), se realizaron cortes de PDA-micelio para transferir a medio de cultivo fresco en cajas Petri del mismo tipo, las cuales se incubaron a 28 °C durante 72 h, posteriormente se transfirieron a cajas Petri con cada uno de los tratamientos, mismos que se bioensayaron en dos experimentos.
Experimento 1. La preparación de las placas de papa dextrosa agar con los tratamientos se hizo de la siguiente manera. El aceite esencial en concentraciones de 1 mL L-1 (0.1%) y 10 mL L-1 (1%) se disolvió por separado en PDA, para disolver el aceite en el medio de cultivo se utilizó Tween® 20 como emulsificante en 1 mL L-1 en todos los tratamientos. El fungicida comercial Benomil® (butilcarbamoil benzimidazol-2-ilcarbamato de metilo) al 1% se utilizó como testigo positivo o referencial además de incluir un testigo absoluto sin aceite esencial.
El experimento constó de 16 tratamientos generados de la combinación de los factores de estudio concentración de aceite (0, 1 y 10 mL), fuente de hongos (cuatro especies) y testigo referencial (para cada uno de los hongos), tratamientos que se distribuyeron siguiendo el diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones. Cada repetición estuvo conformada por cuatro unidades experimentales, cada unidad experimental correspondió a una caja Petri (placa) de 100×15 mm.
De las cajas Petri con el inóculo micelial se hicieron cortes de agar con micelio de 1 cm2 y se trasladaron al centro de la caja Petri que contenía el extracto del PDA y los tratamientos respectivos. Experimento 2. Con las mismas condiciones del primer experimento, se ensayaron concentraciones de 20 mL L-1 (2%) y 30 mL L-1 (3%), y como testigo referencial Benomil (1%). El experimento consistió de 16 tratamientos, cada uno repetido cuatro veces.
En ambos experimentos, las placas o cajas se incubaron a una temperatura de 28 °C y se observó el desarrollo micelial hasta el crecimiento límite del hongo. La actividad del aceite esencial se evaluó considerando la prueba de crecimiento micelial (Ríos et al., 1988); para el registro del crecimiento micelial se midieron dos diámetros que se cruzaron perpendicularmente, sumando y dividiendo en dos para calcular el diámetro medio de crecimiento del área del inóculo inicial a intervalos de 24 h. Con los datos de diámetro de crecimiento se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial con respecto al tratamiento testigo (RRT) mediante la fórmula:
Donde: TCT= tasa de crecimiento en el testigo y TCt= tasa de crecimiento del tratamiento.
El análisis de varianza sobre el diámetro del micelio en los dos experimentos se hizo como un factorial 3×4 utilizando el modelo lineal general y la comparación de medias mediante la prueba de Tukey (p≤ 0.05) con el paquete estadístico SAS versión 9 (SAS Institute, 2004).
Resultados y discusión
Rendimiento de aceite esencial e identificación de compuestos
El rendimiento promedio de aceite esencial a nivel de matraz y a nivel piloto fue de 0.28% con respecto al peso de tejido fresco (Cuadro 1), resultado por debajo de lo reportado para esta especie (0.3 y 0.4%) (Cáceres et al., 1998) y muy inferior comparado contra otras especies como el hinojo (Sellam et al., 2015). Las características del hábitat en el que se desarrolla la población de T. lucida seguramente debe ser importante en la respuesta de productividad natural; al respecto, Haslam (1986) propone que factores como el suelo y el clima son los principales factores que influyen en el rendimiento y calidad del aceite esencial.
Cuadro 1 Biomasa de referencia y rendimiento de aceite esencial de plantas de la población de T. lucida de Atotonilco el Grande, Hidalgo.
| Tipo | Biomasa (kg) peso fresco, PF | Biomasa (kg) peso seco, PS | Aceite esencial extracto (mL) | Rendimiento (%) mL 100 g-1 PF | Rendimiento (%) mL 100 g-1 PS |
| Matraz | 1.4075 | 1.054 | 4.04 | 0.2869 | 0.3832 |
| Piloto | 46 | 35 | 130 | 0.2826 | 0.3714 |
| Pilotoz (1 ha) | 2 000 | 1 513 | 5 600 | 0.28 | 0.3701 |
z= Extrapolación del ensayo piloto a 1 hectárea.
En cuanto a la identificación de compuestos se determinaron nueve, separados en tiempos de retención de 3.9 a 17 min los cuales se presentaron en la secuencia siguiente: β-mirceno (3.93 min), 3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno (4.60 min), 3,7-dimetil-1,6-octadieno-3-ol (5.30 min), estragol (6.67 min), 4-metoxibenzaldehído (7.43 min), 1-metoxi-4-(1-propenil) benceno (7.86 min), 1, 2-dimetoxi-4-(2-propenil) benceno (9.32 min), óxido de cariofileno (11.72 min) y ácido trans-13-octadecanoico (17.09) (Cuadro 2, Figura 3).
Cuadro 2 Composición química del aceite esencial de T. lucida de Atotonilco el Grande, Hidalgo.
| Pico | Compuesto | Tiempo de retención (min) | Área | (%) |
| 1 | β-mirceno | 3.93 | 1 336 863 | 2.32 |
| 2 | 3, 7-dimetil-1, 3, 6-octatrieno | 4.6 | 425 990 | 0.74 |
| 3 | 3, 7-dimetil-1, 6-Octadieno-3-ol | 5.3 | 808 900 | 1.4 |
| 4 | Estragol | 6.67 | 28 073 041 | 48.84 |
| 5 | 4-metoxibenzaldehido | 7.43 | 742 814 | 1.29 |
| 6 | 1-metoxi-4-(1-propenil) benceno (anetol) | 7.86 | 20 569 878 | 35.78 |
| 7 | 1, 2-dimetoxi-4-(2-propenil) benceno | 9.32 | 1 300 116 | 2.26 |
| 8 | Óxido de cariofileno | 11.72 | 836 063 | 1.45 |
| 9 | Ácido trans-13-octadecanoico | 17.09 | 3 384 380 | 5.88 |
Los componentes mayoritarios fueron: estragol (1-alil-4-metoxibenceno) (48%) y anetol (1-metoxi-4-(1-propenil) benceno) (35%) (Picos 2 y 4 del Cuadro 2), los cuales se han registrado con anterioridad para la especie en cuestión (Bicchi et al., 1997; Marotti et al., 2004). Estos compuestos químicos son fenilpropanoides que se distinguen por ser isómeros de posición reportados en otras especies de Tagetes (Serrato et al., 2008), éstos metabolitos secundarios tienen efecto biológico contra diversas especies de insectos y de hongos (Koul et al., 2008; Sellam et al., 2015). Cabe señalar, que el anetol como componente mayoritario combinado con otras moléculas en el aceite esencial de T. filifolia, tiene una mayor actividad biológica que en estado puro (Camarillo et al., 2009), evidencia que sugiere un efecto de sinergismo (Koul et al., 2008). El anetol y el estragol se encuentran en otras especies aromáticas como estragón (Artemisia dracunculus), albahaca (Ocimum basilicum), hinojo (Foeniculum vulgare), anís (Pimpinella anisum) y anís estrella (Illicium verum) (Freire et al., 2005; Rietjens et al., 2005).
Evaluación de la actividad antifúngica
En los dos experimentos, las características morfológicas que presentaron los hongos fueron como sigue. En A. niger, la macromorfología de las colonias mostraba al principio una coloración blanca que se torna amarilla y a partir de las 72 h se va obscureciendo desde color café hasta llegar a negro y con aspecto lanoso; F. oxysporum mostró colonias blancas al inicio y posteriormente se tornaron color púrpura, de aspecto algodonoso y produjeron un pigmento púrpura que se difundió en el medio de cultivo; P. janthinellum presentó colonias de coloración verde grisáceo, de forma plana, aterciopeladas y fasciculadas, conforme crecía, era notoria una notable producción de exudados, probablemente metabolitos secundarios; R. solani desarrolló colonias de color café pardo y planas al inicio de su crecimiento, posteriormente presentó aspecto algodonoso de color blanco, al finalizar su crecimiento, se observó una pigmentación verde oscuro. Las características morfológicas de los hongos coincidieron con lo reportado para estas especies en sus diferentes fases con un crecimiento limitado, pero sin cambios aparentes (Agrios, 1995).
En el experimento 1, el diámetro inicial del micelio en el medio de cultivo con Benomil® se mantuvo sin cambio en los diferentes momentos de registro de esta variable, es decir, no hubo crecimiento significativo al término de la evaluación (1.5 mm, p≤ 0.05) (Cuadro 3), respuesta que coincide con otros resultados como el de Villa et al. (2015) donde se reporta un efecto fungicida del Benomil® (testigo de referencia) con valores superiores al 95% de actividad. Por el contrario, en el testigo absoluto, el crecimiento del micelio tuvo el mayor diámetro (9 mm) (Cuadro 3). La concentración del aceite esencial, la especie fúngica y su interacción influyeron (p≤ 0.05) el crecimiento micelial de los hongos fitopatógenos estudiados (Cuadro 3). Considerando el factor concentración del aceite, el diámetro de la zona de crecimiento de los hongos fue disminuyendo proporcionalmente al aumentar la concentración (Cuadro 3), este efecto se ha observado en trabajos previos de evaluación de extractos de Tagetes en hongos (Céspedes et al., 2006).
Cuadro 3 Efecto antifúngico del aceite esencial de T. lucida sobre el crecimiento micelial de A. niger, F. oxysporum, P. janthinellum y R solani in vitro durante 15 días. Experimento factorial 1.
| Aceite T. lucida (%) y testigo | Diámetro (mm) e inhibición del crecimiento micelial (%) | ||||
| A. niger | F. oxysporum | P. janthinellum | R. solani | Factor aceite (C) | |
| Comparación de promedios de la interacción de factores (HxC) | |||||
| 0 | 9.1 ±0.2 aƵ (0) | 9 ±1.1 a (0) | 9.1 ±0.3 a (0) | 9.1 ±0.5 a (0) | 9 ±0.5 A (0) |
| 0.1 | 7.9 ±0.8 b (13.1) | 6.3 ±1.2 c (30) | 7.8 ±0.9 b (14.2) | 6.8 ±0.6 c (25.2) | 7.2 ±0.9 B (20.6) |
| 1 | 7.1 ±1.1 bc (21.9) | 4.8 ±0.2 cd (46.6) | 7.4 ±0.1 bc (16.6) | 5.5 ±0.7 c (39.5) | 6.2 ±0.6 C (31.1) |
| Factor especie (H) | 8 ±0.4 A (11.6) | 6.7 ±0.8 B (25.5) | 8.1 ±0.5 A (10.2) | 7.1 ±0.6 B (21.5) | |
| Benomil® 1 | 1.5 ±0.5 d (83.5) | 1.4 ±0.6 d (84.4) | 1.5 ±0.8 d (83.5) | 1.5 ±0.3 d (83.5) | 1.5 ±0.5 D (83.7) |
Ƶ= Valores con la misma letra minúscula o mayúscula dentro de la columna o mayúscula dentro de fila son iguales estadísticamente (Tukey, p≤ 0.05).
La tendencia observada en la disminución del crecimiento micelial permite suponer que con mayores concentraciones de aceite se podría lograr la inhibición total de crecimiento y quizá la muerte del hongo, tal consideración motivó plantear el segundo experimento que se comentará más adelante. En cuanto al crecimiento del diámetro del micelio y su relación con las diferentes especies de hongos (Cuadro 3), se encontró que los ascomicetos A. niger y P. janthinellum respondieron de manera similar (8-8.1 mm), con crecimiento mayor (p≤ 0.05) comparado con el del basidiomiceto R. solani y el ascomiceto F. oxysporum, ambos de crecimiento micelial parecido (6.7-7.1 mm); estas diferencias se podrían atribuir a la naturaleza genética de estos organismos.
En cuanto al efecto de interacción, destacó que con 0.1 y 1% de aceite de T. lucida aplicados a las cuatro especies de hongos se logró menor diámetro micelial (p≤ 0.05) con respecto del testigo absoluto (Cuadro 3), confirmando el efecto antifúngico del aceite. También fue notorio que con 0.1% de aceite, el diámetro del micelio de F. oxysporum y de R. solani fue menor (p≤ 0.05) (4.86.8 mm) que el de A. niger y de P. janthinellum (7.4-7.9 mm) (Cuadro 3), respuesta que confirma cierta especificidad entre el tipo de hongo y la naturaleza química del aceite. Al respecto, agentes fungitóxicos en ascomicetos impiden el crecimiento del hongo en condiciones in vitro, afectan su capacidad de esporulación, y la germinación de conidios (Castellanos et al., 2011), en hongos basidiomicetos, el mecanismo de acción antifúngica está dado por compuestos flavonoides de efecto biocida (Céspedes et al., 2006). Finalmente, en cada especie de hongo las dos concentraciones de aceite no influyeron con significancia estadística el diámetro del micelio (Cuadro 3), resultado que tendría implicaciones económicas favorables de aplicar la concentración de 0.1%.
La reducción de la tasa de crecimiento micelial de los cuatro hongos expuestos al aceite de ‘pericón’ de Atotonilco el Grande, desde 23 hasta 46% (Cuadro 3), es indicador de un efecto fungistático de este extracto vegetal que contiene ocho compuestos químicos distintos, con abundancia de estragol y anetol (Cuadro 2). Este efecto fungistático causado por el aceite de T. lucida se había detectado previamente contra Sclerotium rolfsii y Monilinia fructicola, hongos importantes en postcosecha de productos agrícolas (Barajas et al., 2011). Para los ascomicetos (A. niger y P. janthinellum), la tasa de reducción de micelio de 13 a 21%, comparada con la registrada para el basidiomiceto R. solani (25 a 39%) y el ascomiceto F. oxysporum (30 a 46%), es indicadora de que la actividad biológica del aceite de la población Atotonilco en las concentraciones ensayadas no parece tener alcances promisorios contra los ascomicetos en este experimento.
En el experimento 2, el micelio en el medio de cultivo con Benomil® no presentó un incremento significativo (1.5 mm) (p≤ 0.05) al término del experimento (Cuadro 4), mientras que el micelio del testigo absoluto tuvo el mayor diámetro (9 mm, Cuadro 3). El tamaño del micelio de los hongos fitopatógenos, al igual que en el Experimento 1, resultó influido (p≤ 0.05) por la especie fúngica (Cuadro 4): los fitopatógenos no esporulantes (F. oxysporum y R. solani) resultaron menos afectados que los esporulantes (A. niger y P. janthinellum). Por otra parte, no hubo efecto de concentración en el diámetro micelial, aunque éste fue relativamente menor comparado con lo observado en el primer experimento (Cuadro 4).
Cuadro 4 Efecto antifúngico del aceite esencial de T. lucida sobre el crecimiento micelial de A. niger, F. oxysporum, P. janthinellum y R solani in vitro durante 15 días. Experimento factorial 2.
| Aceite T. lucida (%) y testigo | Diámetro (mm) e inhibición del crecimiento micelial (%) | ||||
| A. niger | F. oxysporum | P. janthinellum | R. solani | Factor aceite (C) | |
| Comparación de promedios de la interacción de factores (HxC) | |||||
| 0 | 9 ±0.3 a (0) | 9.1 ±0.4 a (0) | 8.9 ±0.4 a (0) | 9.1 ±0.5 a (0) | 9 ±0.4 A (0) |
| 2 | 6.6 ±0.6 b (26.6) | 4.7 ±0.2 c (48.3) | 6.8 ±0.6 b (23.6) | 3.9 ±0.6 c (57.1) | 5.5 ±0.5 B (38.9) |
| 3 | 6.4 ±0.7 b (28.8) | 4.2 ±0.6 c (53.8) | 6.7 ±0.3 b (24.7) | 2.8 ±0.5 cd (72.5) | 5 ±0.5 B (44.9) |
| Factor especie (H) | 7.3 ±0.5 A (18.4) | 6 ±0.4 B (34) | 7.5 ±0.4 A (16.1) | 5.3 ±0.5 C (43.2) | |
| Benomil® 1** | 1.6 ±0.6 d (82.2) | 1.4 ±0.5 d (84.6) | 1.6 ±0.3 d (82) | 1.5 ±0.1 d (83.5) | 1.5 ±0.4 C (83.7) |
Ƶ= Valores con la misma letra minúscula o mayúscula dentro de la columna o mayúscula dentro de fila son iguales estadísticamente (Tukey, p≤ 0.05).
Considerando el efecto de interacción, se observó que 2 y 3% de aceite de T. lucida presenta menor diámetro y mayor porcentaje de reducción micelial en F. oxysporum (4.7-4.2 mm; 48 y 53%) y en R. solani (3.9-2.8 mm; 57 y 72%), con respecto del testigo absoluto (9.0-9.1 mm) y en comparación con A. niger (6.6-6.4 mm; 26-28%) y P. janthinellum (6.8-6.7; 23-24%) (Cuadro 4). Estos resultados coinciden parcialmente con lo reportado por Castellanos et al. (2011) quienes indican que el micelio de R. solani resulta inhibido por extractos metanólicos de T. lucida en dosis de 240 µg/mL. La poca inhibición de las especies A. niger y P. janthinellum se debe a su actividad esporulante, ya que los conidios pueden ser más resistentes ante algunos agentes antifúngicos (Barajas et al., 2011); por lo tanto, la actividad biológica del aceite de esta población de T. lucida en los ascomicetos estudiados no es promisoria, como se señaló anteriormente.
En general, los fenilpropanoides como el estragol y el anetol que se encuentran en el aceite esencial de la población Atotonilco, son metabolitos secundarios que también están presentes en otras especies vegetales como el hinojo (Foeniculum spp.) o el anís (Pimpinela anisum) cuyo aceite posee actividad fungistática o fungicida (Freire et al., 2005; Rietjens et al., 2005; Sellam et al., 2015). En el caso de la actividad biológica del Benomil®, el mecanismo está dado por la acción inhibitoria de la síntesis de ergosterol, que es un componente estructural de la membrana de los hongos, causando deformaciones y proliferación anormal de tubos germinativos (Púrez et al., 1983).
La aplicación de sustancias sintéticas o naturales contra hongos fitopatógenos debe valorar las implicaciones al ambiente y al humano, así como su viabilidad técnica-económica, en este último sentido, la extrapolación del rendimiento de biomasa y de aceite de la población de T. lucida en condiciones de secano en Atotonilco, Hidalgo, así como el destacado efecto fungistático evaluado contra los hongos F. oxysporum y R. solani, permiten estimar que con un rendimiento de 2 000 kg de biomasa fresca por hectárea obtenido por recolección en las áreas naturales de Atotonilco y con un rendimiento de aceite esencial de 0.28%, se podrían obtener cerca de 5.6 L de aceite esencial (Cuadro 1), con lo cual se podrían formular más de 1000 L de biopesticida al 1% y más de 10 000 L al 0.1%. Por lo tanto, este recurso natural de Atotonilco, Hidalgo puede tener buenas perspectivas en agricultura ecológica contra tales hongos; su evaluación en campo resultará conveniente, a la vez que fomentar el manejo agroecológico de la población de ‘pericón’ para aumentar el número de plantas por unidad de superficie.
Conclusiones
La productividad en aceite esencial de la población natural de T. lucida de Atotonilco, Hidalgo no fue alta y los componentes mayoritarios en el aceite fueron anetol y estragol. Las pruebas de evaluación in vitro contra los hongos fitopatógenos bioensayados evidenciaron un efecto fungistático del aceite, especialmente contra el hongo R. solani en la condición de alta concentración del aceite.
