La estevia (Stevia rebaudiana Bertoni) es originaria del noroeste semi-árido paraguayo, de sus hojas se extraen compuestos glucósidos, aproximadamente 300 veces más dulces que el azúcar de caña. A la estevia también se le atribuyen propiedades antibióticas y anti fúngicas (^{Arturo et al., 2009}). Algunos de los efectos que produce la ingestión estevia en los humanos son: efecto hipotensivo e hipoglucémico, además de presentar acción antiinflamatoria y antimicrobiana (^{Marcavillaca, 2016}).

Entre los principales países productores de estevia se encuentran Japón, China, Corea, Taiwán, Tailandia, Indonesia, Laos, Malasia y Filipinas; dichos países representan 95% de la producción mundial (^{Herrera-Cedano et al., 2012}). En América, es cultivada principalmente en Paraguay, Brasil, Argentina, Colombia, Perú y México. La superficie cultivada total en México es de 58 ha, distribuidas en los estados de Sinaloa, Nayarit, Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero, Oaxaca y Chiapas (^{SIAP, 2015}).

Existen diversos hongos fitopatógenos que se han reportado induciendo enfermedades en plantas de estevia, en donde la susceptibilidad a estos, se incrementa ante niveles excesivos de agua (^{Álvarez, 2005}), tal es el caso de hongos como Alternaria alternata, Alternaria steviae, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium rolfsii, Septoria steviae, Uromyces sp., Verticillium dahliae (^{Farr y Rossman, 2017}), Rhizoctonia sp., Colletotrichum sp., Pestalotia sp., Ascochyta sp., Phomopsis sp., Curvularia sp., Drechslera sp., Cercosporella sp., Thielaviopsis sp. (^{Arturo et al., 2009}), Macrophomina phaseolina y Fusarium semitectum (^{Hilal y Baiuomy, 2000}). Con respecto a enfermedades bacterianas, únicamente se ha registrado a Pseudomonas cichorii causando mancha foliar (^{Strayer et al., 2012}). Mientras que, Tomato spotted wilt virus (^{Chatzivassiliou et al., 2007}) y Cucumber mosaic virus (^{Chatzivassiliou et al., 2016}) son los virus registrados induciendo enfermedades en estevia.

La marchitez de la estevia se ha reportado previamente en Brasil (^{Mendes et al., 1998}), Egipto (^{Hilal y Baiuomy, 2000}), Venezuela (^{Arturo et al., 2009}; ^{Salazar et al., 2015}) e India (^{Hegde y Chavan, 2009}). Esta enfermedad se ha asociado principalmente a Fusarium oxysporum, aunque, otras especies como F. solani (^{Hegde y Chavan, 2009}) y F. semitectum (^{Hilal y Baiuomy, 2000}) también pueden estar asociadas.

El objetivo de este estudio fue identificar al agente causal de los síntomas de pudrición de raíz, necrosis basal en tallo, y marchitez de plantas de estevia en Martínez de la Torre, Veracruz, mediante la combinación de caracterización morfológica, análisis de secuencias de la región ribosomal de ADN del espaciador interno transcrito (ITS) y de la secuencia parcial del gen factor de elongación 1-alpha (EF1-α), además de pruebas de patogenicidad.

Durante 2015, se realizaron muestreos dirigidos en una plantación de estevia localizada en Martínez de la Torre, Veracruz, México. Se recolectaron 20 plantas con síntomas de pudrición de raíces, necrosis basal en tallo, clorosis foliar y marchitez. La incidencia de la enfermedad en campo se estimó en 25%.

Para el aislamiento, las raíces de las muestras vegetales se lavaron con agua para retirar residuos de suelo y se cortaron en segmentos de 5 mm a partir de la zona de avance de la pudrición de raíz y de la necrosis basal del tallo. Posteriormente, los segmentos se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 2 min, se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se secaron en papel absorbente estéril. De cada planta recolectada se sembraron cinco segmentos desinfestados en cajas de Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA). Las cajas se incubaron a temperatura de 25 °C y en oscuridad continua. Las colonias fúngicas desarrolladas se transfirieron a cajas con medio PDA fresco. Los aislados fúngicos se purificaron a través de la técnica de cultivos monospóricos y se almacenaron a -80 °C en tubos criogénicos conteniendo glicerol al 15%.

A partir de los aislados de hongos obtenidos se realizaron preparaciones temporales en lactofenol y en glicerina, con la finalidad de observar y caracterizar las principales estructuras reproductivas en microscopía de luz. La identificación a nivel de género se realizó con las claves taxonómicas de ^{Barnett y Hunter (2006)}, mientras que la identificación a nivel de especie se llevó a cabo usando las descripciones reportadas por ^{Leslie y Summerell (2006)}.

Se realizaron pruebas de patogenicidad en 10 plantas de estevia, utilizando un aislado representativo del hongo. El aislado fúngico se incrementó en cajas Petri conteniendo medio de cultivo PDA. A partir de los conidios desarrollados en medio de cultivo, se obtuvo una suspensión de conidios ajustada a una concentración de 1 x 10⁶ esporas ml^-1. Las raíces de 10 plantas se sumergieron en la suspensión de esporas durante 30 min, posteriormente las plantas se sembraron en vasos de unicel conteniendo suelo estéril y se colocaron en un invernadero a 25 ºC. Diez plantas cuyas raíces se sumergieron únicamente en agua destilada estéril, sirvieron como control. Las plantas se observaron cada 24 h y se registró el avance de los síntomas. La prueba de patogenicidad completa se realizó dos veces.

La extracción de ADN genómico de un aislado representativo del hongo identificado morfológicamente, se realizó mediante la maceración de 100 mg de micelio obtenido a partir de una colonia con 7 días de crecimiento. Posteriormente, se siguió el protocolo indicado en el kit de extracción Plant DNeasy Mini Kit (Qiagen^®, EE. UU). La calidad del DNA se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 1% con buffer de corrida TBE 0.5 X con el uso de 5 µl del DNA y llevada a 90 volts. El gel se analizó en un transiluminador Gel-Doc mod 2000 (Biorad^®, EE. UU).

Para la amplificación por PCR se utilizaron los iniciadores ITS5/ITS4 (^{White et al., 1990}) y EF2/EF1 (^{O’Donnell et al., 1998}). La mezcla de reacción se preparó a un volumen final de 25 µl, buffer de PCR 1x, 2.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 0.4 µM de cada primer, 1U DNA polimerasa (Promega^®, EE. UU) y 100 ng de DNA. La PCR se llevó a cabo en un termociclador C1000 (Biorad^®, EE. UU), con una desnaturalización inicial de 94 ºC por 2 min, 35 ciclos de 94 ºC por 30 s, 55 ºC por 30 s, 72 ºC por 1 min; y una extensión final de 72 ºC por 10 min. La temperatura de alineamiento fue 55 y 54 °C para ITS5/ITS4 y EF1/EF2, respectivamente. Los productos amplificados se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% con buffer de corrida TBE 0.5 X con el uso de 5 µl del producto de PCR, para llevar a electroforesis a 80 volts. El gel se analizó en un transiluminador Gel-Doc mod 2000 (Biorad^®, EE. UU).

Los fragmentos amplificados con los iniciadores ITS5/ITS4 y EF1/EF2 se purificaron mediante el protocolo de DNA clean & concentrator (Zymo Research^®, EE. UU). En un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml se agregaron 5 volúmenes del buffer DNA Binding y se mezcló por inversión. La mezcla se transfirió en una columna Zymo-Spin en un tubo de colección de 2 ml. Se centrifugó durante 30 s a 8 000 rpm, y se descartó el sobrenadante. Se agregaron 200 µl de buffer DNA Wash dentro de la columna y centrifugó 30 s durante 8 000 rpm. Se descartó el sobrenadante y se cambió a un tubo nuevo de 2 ml. Se agregó 60 µl buffer de DNA Elution directamente en la columna y se incubó durante 1 min. Se transfirió la columna a un tubo nuevo de 1.5 ml y se diluyó el DNA. Los fragmentos de DNA purificados se enviaron a secuenciar a la empresa Macrogen (dna.macrogen.com). Las secuencias obtenidas se compararon en la base de datos en NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con la herramienta BLASTn.

A partir de las muestras de tejido vegetal infectado que se sembraron en cajas Petri con medio de cultivo PDA, se obtuvo 92% de colonias pertenecientes al género Fusarium.

El hongo obtenido se desarrolló bien en medio de cultivo PDA formando macroconidios, microconidios y clamidosporas. La colonia desarrollada en medio PDA fue de color crema con ligera pigmentación violeta y con crecimiento algodonoso. Los microconidios fueron hialinos, de forma oval a elipsoidal, de 5.1-9.8 × 2.3-2.9 (m. Los macroconidios fueron hialinos, de 20.2-30.2 × 2.5-4.7 (m, de forma alargada y curveada, con la célula apical ligeramente aguda, la célula basal con forma de pie y presentando de 3 a 5 septos. Se observaron clamidosporas individuales y en par, distribuidas de manera terminal e intercalar en las hifas. Todas las características coincidieron con las reportadas por ^{Leslie y Summerell (2006)} para la especie Fusarium oxysporum.

Ocho días después de la inoculación (ddi), se observó que el aislado inoculado de Fusarium oxysporum causó pudrición de raíz, necrosis basal del tallo y marchitez en todas las plantas inoculadas con la suspensión de esporas. Doce ddi, las plantas inoculadas murieron debido a la completa obstrucción de los haces vasculares. Mientras que, las plantas de estevia que se usaron como control, permanecieron asintomáticas y libres de la enfermedad. A partir de los tejidos infectados de las plantas sintomáticas, se re-aislaron colonias de Fusarium que presentaron las mismas características morfológicas de los aislados obtenidos de las plantas de estevia en campos de cultivo.

Los resultados de las pruebas de patogenicidad de este estudio coinciden con los síntomas registrados en plantas de estevia por ^{Salazar et al. (2015)}: sin embargo, los tiempos de desarrollo de síntomas y muerte de plantas fueron diferentes, aun cuando la concentración de esporas usadas para la inoculación fue la misma. Lo anterior pudo deberse a diversos factores como condiciones de invernadero o virulencia del aislado.

El análisis con la herramienta BLASTn de la secuencia ITS obtenida en este estudio, mostró 99 % de identidad con la secuencia de F. oxysporum depositada en el GenBank con número de acceso KJ439169. Mientras que, la secuencia EF1-α presentó 100% de identidad con diversas secuencias de EF1-α de F. oxysporum (números de acceso del GenBank KY508354, KU507197, KU507192, KU507184 y KU507180). Lo anterior confirmó los resultados de la identificación morfológica llevados a cabo en este estudio.

En general, los resultados de esta investigación coincidieron con los reportados por ^{Arturo et al. (2009)} y ^{Salazar et al. (2015)}, quienes determinaron mediante identificación morfológica y pruebas de patogenicidad, que Fusarium sp. y F. oxysporum son los causantes del síntoma de marchitez en plantas de estevia producidas en Maracay y en Aragua, Venezuela, respectivamente. Por otra parte, ^{Hilal y Baiuomy (2000)} registraron a F. oxysporum causando marchitez de plantas de estevia en Egipto; sin embargo, su estudio carece de pruebas de patogenicidad y análisis molecular. Otras especies de Fusarium que se han reportado causando pudrición de raíces de estevia son F. solani en Egipto (^{Hilal y Baiuomy, 2000}) e India (^{Hegde y Chavan, 2009}), además de F. semitectum en Egipto (^{Hilal y Baiuomy, 2000}).

Con respecto al control de la marchitez de estevia, ^{Hilal y Baiuomy (2000)} indicaron que el tratamiento químico a base de metil tiofanato y el tratamiento biológico a base de Trichoderma harzianum, presentan un control efectivo de la enfermedad. Sin embargo, es poca la información específica sobre las estrategias de manejo de la marchitez de plantas de estevia, por lo que se sugiere realizar estudios dirigidos a evaluar diversas estrategias de control, con la finalidad de obtener herramientas de manejo integrado para minimizar los daños ocasionados por esta enfermedad en áreas de cultivo de estevia en México.