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Introducción
Las semillas representan el germoplasma de la planta, por lo que la estrategia para su dispersión es fundamental para asegurar la supervivencia de la siguiente generación. Los frutos han desarrollado mecanismos complejos para maximizar la eficacia de este proceso (Karlova et al., 2014). Desde el punto de vista ecológico, los frutos inmaduros representan un órgano que debe ser protegido y no debe ser atractivo, el color verde le permite camuflajearse con las hojas (Iqbal et al., 2017). La maduración es un evento coordinado de diferentes rutas bioquímicas reguladas por el etileno que produce cambios en el tejido que rodea a las semillas, volviendo al fruto más atractivo y así ayudar a la dispersión de las mismas. Estos cambios afectan el color, el olor, la textura y el contenido de azúcares, lo que ha sido explotado por los seres humanos para la domesticación de los cultivos (Klee y Giovannoni, 2011; Seymour et al., 2013).
Por ello, se han realizado estudios para una mejor comprensión del órgano floral el desarrollo del fruto (Bao et al., 2010; Seymour et al., 2013) el papel de las hormonas y los genes relacionados con el desarrollo y la maduración de los frutos (Alexander y Grierson, 2002; Cara y Giovannoni, 2008; Kumar et al., 2014), así como los desórdenes fisiológicos (Pegoraro et al., 2010) y las alteraciones epigenéticas de la maduración (Manning et al., 2006; Zhong et al., 2013).
En este sentido, la biología molecular ha contribuido significativamente a elucidar como ocurren el crecimiento y el desarrollo del fruto (Gapper et al., 2013; McAtee et al., 2013; Pech et al., 2013; Seymour et al., 2013; Gapper et al., 2014; Kumar et al., 2014; Dos Santos et al., 2015).
Estudios realizados por Bouzayen et al. (2010) revelaron a través de herramientas genómicas y post-genómicas avanzadas, los mecanismos por los cuales la calidad nutricional y sensorial se desarrollan durante las etapas de madurez fisiológica y de consumo del fruto utilizando.
Uno de los fenómenos más estudiados es el ablandamiento de los frutos, que es una serie de eventos genéticamente programados, caracterizados por procesos bioquímicos y fisiológicos que alteran su firmeza, color, sabor y textura (Nishiyama et al., 2007). Dado que la mayor parte de los atributos de calidad se generan durante el proceso de maduración, se ha considerado esencial el comprender mejor los mecanismos involucrados en esta última etapa de desarrollo (Bouzayen et al., 2010). El objetivo de esta revisión se enfoca en la recopilación de la información sobre investigaciones relevantes relacionadas con la maduración, ablandamiento y regulación transcripcional de los frutos durante el manejo postcosecha de éstos.
Biosíntesis de etileno y clasificación de frutos
Los frutos pueden clasificarse como climatéricos y no climatéricos en función de su patrón de aumento en la producción de etileno y bióxido de carbono durante la maduración, aunque existen variaciones importantes en la sincronía y tasa de incremento, técnicamente representa una categorización muy útil para el manejo de la cosecha y manejo postcosecha de los frutos (Lelièvre et al., 1997). Aquellos que presentan un climaterio respiratorio y un aumento en la producción de etileno, se conocen como frutos climatéricos e incluyen a frutos como el tomate, plátano, manzana, pera, mango y papaya (Omboki et al., 2015). En contraste, en frutos no climatéricos como la fresa, uva y los cítricos, el aumento en la respiración no manifiesta un clímax y la producción de etileno es baja o ausente (Dos Santos et al., 2015).
Los principales pasos en la biosíntesis de etileno (Figura 1) involucran la conversión de S-adenosilmetionina (SAM) a ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) por la ACC sintasa (ACS) y luego por la ACC oxidasa (ACO) a etileno (Alexander y Grierson, 2002). En el tejido de frutos climatéricos, la biosíntesis de etileno inicia a un nivel bajo durante el desarrollo (sistema 1), pero al inicio de la maduración se vuelve autoctalítico (sistema 2) (Karlova et al., 2014), debido a que la presencia de etileno activa la acción del gen que codifica a la enzimaACO que convierte el ACC a etileno (Liu et al., 2015).
Diversos estudios genéticos han sugerido que el proceso de la maduración está programado en la célula y que requiere de la expresión diferencial de genes, lo que resulta en la transcripción de ARNm específicos y en la síntesis de proteínas de novo (Lincoln y Fischer, 1988; Darley et al., 2001).
En este sentido, una tendencia en las investigaciones ha sido el uso de técnicas de biología molecular dirigidas al aislamiento, reconocimiento y expresión de los genes de las principales enzimas que actúan durante el ablandamiento ocurrido en la maduración de los frutos (Brummell y Harpster, 2001). Sin embargo, las diferencias moleculares entre la maduración climatérica y la no climatérica aún son poco conocidas, por lo que se ha propuesto que el etileno juega un papel como coordinador de la maduración en especies climatéricas para facilitar la maduración rápida y coordinada (Giovannoni, 2004).
Regulación molecular de la biosíntesis de etileno
La comprensión del modo de acción del etileno ha progresado con la identificación y el uso de factores de transcripción capaces de unirse a la región promotora de genes relacionados a la biosíntesis y acción del etileno, como los reguladores transcripcionales que pertenecen al tipo Apetala2 (AP2)/ ethylene response factor (ERF) (Klee y Giovannoni, 2011; Pech et al., 2012; Grierson, 2013; Pech et al., 2013).
Anteriormente, las bases moleculares de la síntesis y regulación del etileno fueron un punto focal del análisis de la maduración. Sin embargo, en estudios más recientes se ha hecho énfasis en la caracterización de la transducción de señales del etileno (Giovannoni, 2004). No obstante, el etileno por sí mismo no es suficiente para la maduración y para que haya una respuesta al etileno debe existir un desarrollo adecuado (Lelièvre et al., 1997; Giovannoni, 2001). Por consecuencia, los frutos inmaduros normalmente no maduran en respuesta a la aplicación de etileno exógeno. Bauchot et al. (1998) observaron que en melones transgénicos con síntesis de etileno silenciada, algunos aspectos de la maduración climatérica, como la producción de los compuestos volátiles de aroma, son regulados por factores del desarrollo que deben ser coordinados adecuadamente con la síntesis de etileno.
Se han identificado al menos seis diferentes receptores de etileno putativos en el genoma del tomate, LeETR1, LeETR2 (Zhou et al., 1996; Lashbrook et al., 1998), NR (Wilkinson et al., 1995; Payton et al., 1996), LeERT4, LeETR5 (Tieman y Klee, 1999), y LeETR6 (Ciardi y Klee, 2001), los cuales se expresan diferencialmente en varios tejidos como hojas, semillas y flor (Alexander y Grierson, 2002).
Los transcritos que codifican para dos receptores de etileno (NR Y LeTR4) se acumulan en altos niveles en frutos de tomate que están madurando, lo que sugiere que estos dos receptores podrían funcionar en la maduración inducida con etileno (Wilkinson et al., 1995; Yen et al., 1995; Alba et al., 2005).
Alba et al. (2005) demostraron que el etileno regula la bioquímica, la morfología, y la actividad transcriptómica en todo el desarrollo del fruto. La comparación de los patrones de expresión de genes que codifican enzimas en rutas de desarrollo del fruto a los productos medidos de dichas rutas (etileno, carotenoides y ascorbato) sugieren nuevos puntos reguladores del desarrollo del fruto influenciados por el etileno.
La actividad de la enzima ACC sintasa se ve afectada por la fosforilación de proteínas. Esta evidencia refuerza la idea de que la síntesis de etileno está regulada desde la transcripción hasta su actividad (Argueso et al., 2007); por ejemplo, los perfiles contrastantes de los genes E4 y E8. La transcripción del gen E4 es estimulada tanto por el sistema 1 como por el sistema 2 de biosíntesis de etileno. Mientras que la transcripción del gen E8 es inducido sólo en frutos maduros; es decir, por el sistema 2, un fuerte indicador de que ambos son regulados en el desarrollo y son específicos para ciertos tejidos (Omboki et al., 2015).
Muchos genes están involucrados en la biosíntesis de etileno, pero los genes que codifican las enzimas ACO y ACS son los más caracterizados (Liu et al., 2015). Barry et al. (2000) reportaron que nueve genes codifican a la enzima ACS, LeACS1A, LeACS1AB y LeACS2 a 8, de los cuales 4 se expresan durante la maduración del fruto: LeACS1A, LeACS2, LeACS4 y LeACS6. LeACS6 es el principal gen de ACS involucrado en la síntesis de etileno en frutos verdes, aunque LeACS1A también se expresó en los mismos tejidos (plántulas de tomate de 10 días). La expresión de LeACS1 y LeACS4 es inducida durante el paso a la maduración que depende del factor de transcripción RIN-MADS ( Vrebalov et al., 2002).
Por otro lado, la enzima ACO es codificada por cinco genes en tomate donde tres de ellos, LeACO1, 3 y 4 se expresan diferencialmente (Van-der-Hoeven et al., 2002). Los niveles de LeACO1 y 4 aumentan de forma masiva en la etapa verde inmadura de un fruto y son altamente expresados durante la maduración climatérica, mientas que sus niveles se mantuvieron durante el período de maduración (Omboki et al., 2015), mientras que la expresión de LeACO3 es altamente dependiende de etileno (Llop-Tous et al., 2000). Los genes que codifican a ACO y ACS también se han caracterizado en durazno (Tatsuki et al., 2006), melón (Yamamoto et al., 1995) y manzana (Dandekar et al., 2004; Omboki et al., 2015).
En fresa, un fruto modelo de maduración no climatérica, se ha encontrado que la concentración de etileno es relativamente alta en frutos verdes, disminuye en frutos blancos y finalmente aumenta de nuevo en la etapa roja de la maduración (Perkins-Veazie et al., 1996; Iannetta et al., 2006). Además, éste último aumento está acompañado por una mayor tasa de respiración que se asemeja a la que se produce en frutos climatéricos al inicio de la maduración (Iannetta et al., 2006).
Evidencia reciente de la regulación de los genes MADS-box de la maduración, tanto en tomate (climatérico) como en fresa (no climatérico), sugiere mecanismos reguladores comunes operando en ambas especies, climatéricas y no climatéricas (Vrebalov et al., 2002).
Control transcripcional de la maduración
El estudio de la regulación transcripcional del desarrollo temprano de frutos carnosos en especies distintas al tomate se ve obstaculizado por la falta de o dificultad de los protocolos de transformación para los estudios funcionales y la falta de mutantes disponibles. Por tanto, la información sobre la función génica de estas especies es a menudo incompleta y se deriva de estudios de expresión o de expresión heteróloga en otras especies (Karlova et al., 2014).
Recientemente, se ha hecho un avance significativo en la comprensión del control transcripcional de la maduración utilizando al tomate (Solanum lycopersicum) como sistema modelo. Los factores de transcripción ripening-inhibitor (RIN) (Vrebalov et al., 2002), nonripening (NOR) (Giovannoni, 2007) y colorless nonripening (CNR) (Manning et al., 2006) funcionan como reguladores globales de la maduración y actúan de forma contraria al etileno, mientras que factores de transcripción adicionales que son requeridos para una maduración normal incluyen TOMATO agamous-like1 (TAGL1) (Itkin et al., 2009; Vrebalov et al., 2009), hd-zip homeobox protein-1 (HB-1) (Lin et al., 2008), apetala2a (AP2a) (Chung et al., 2010; Karlova et al., 2011) , ethylene response factor6 (ERF6) (Lee et al., 2012), arabidopsis pseudo response regulator2-like (APRR2-Like) (Pan et al., 2013) y fruitfull (TDR4/FUL1 y MBP7/FUL2) (Bemer et al., 2012).
La mayoría de los reguladores transcripcionales positivos, como agamous, shatterproof, mads-box, fruitfull que afectan las rutas de maduración han sido descritos (Omboki et al., 2015). Muchos de estos factores de transcripción de MADS -box influyen en la síntesis de etileno por unión directa de los promotores de los genes ACS2 y ACS4 como en el caso de RIN y TAGL1 (Cherian et al., 2014). TAGL1 está involucrado en la maduración normal del tomate y contribuye a su “carnosidad” (Itkin et al., 2009; Vrebalov et al., 2009).
El mecanismo molecular preciso mediante el cual los productos génicos codificados por RIN, NOR, CNR, TAGL1 y HB-1 operan en la red regulatoria sigue siendo desconocido (Seymour et al., 2013); sin embargo, es probable que las proteínas de MADS-box actúen como heterodímeros o multímeros (Giovannoni, 2007).
Adicionalmente, otros componentes de la red regulatoria, incluyendo a los factores de transcripción que actúan como reguladores negativos, tales como AP2 y SIAP2a (que pertenece a la familia apetala2/erf de factores de transcripción y actúa en forma opuesta a RIN, NOR y CNR), han sido reportados como reguladores principales de la maduración (Chung et al., 2010; Karlova et al., 2011). Además, el efector negativo SIAP2a es inducido durante la maduración, pero su represión lleva a una aceleración en la maduración, niveles elevados de producción de etileno y gran acumulación de carotenoides (Chung et al., 2010; Karlova et al., 2011).
Pérdida de la firmeza
Elablandamientoesunprocesodemaduraciónprogramadoen muchos frutos, que les proporciona diferentes características como lo jugoso, lo crujiente y la firmeza (Seymour et al., 2002). Durante este proceso se producen enzimas que modifican la pared celular causando cambios de textura en el fruto; haciéndolo más apetecible a los animales que dispersan las semillas, y/o más susceptibles a patógenos que liberan las semillas (Gapper et al., 2013). La química de la pared celular es el principal contribuyente, junto con los cambios en la turgencia celular, de la textura del fruto y los genes que codifican a las enzimas responsables de estos cambios.
Estos últimos han sido objeto de manipulación genética en el fruto, con el objetivo de extender la vida de anaquel (Vicente et al., 2007; Goulao y Oliveira, 2007; Matas et al., 2009).
El metabolismo de la pared celular durante la maduración del fruto es un proceso muy complejo, que incluye más de 50 genes relacionados con la estructura de la pared celular (Tomato Genome Consortium, 2012).
El ablandamiento de la fruta es un cambio importante en la textura de frutos climatéricos debido a la hemicelulosa de la pared celular y a la solubilización y despolimerización de la pectina por varias hidrolasas (Rose et al., 2004). La enzima poligalacturonasa (PG) sólo se expresa en tejidos del fruto maduro y su transcripción se activa únicamente durante la maduración (Omboki et al., 2015). Diferentes regiones de la región del promotor PG interactúan positiva y negativamente con los elementos que median la expresión del gen que la codifica (Omboki et al., 2015). Se cree que la PG desempeña un papel clave en el ablandamiento del fruto, aunque estudios transgénicos han indicado que la PG no es la única enzima responsable (Giovannoni et al., 1989; Smith et al., 1990).
Además de la PG, que elimina los residuos de galacturosil de la pectina (Atkinson et al., 1998), un conjunto de enzimas modificadoras de la pared celular también participan en la maduración y los genes que las codifican se han aislado a partir de algunas especies, pero principalmente del tomate: la a-L-arabinofuranosidasa elimina el arabinosil y algunos otros residuos de la pectina (Sozzi et al., 2002; Itai et al., 2003); la ramnogalacturonasa (RG) hidroliza los enlaces α-1,2 entre los residuos de galacturonosil y ramnosil en la pectina (Wong, 2008), la xiloglucano/endotransglucosilasa/ hidrolasa hidroliza o transglicosolata xiloglucano (Saladié et al., 2007); las glicosidasas (β -galactosidasa) eliminan los residuos de galactosilo de la pectina y el xiloglucano (Smith et al., 2002).
Las mananasas hidrolizan al azar el enlace β de las cadenas principales de manano que constituyen parte de los glicanos de hemicelulosa (Rodríguez-Gacio et al., 2012); las pectato liasas (PL) catalizan la escisión eliminadora de pectina desesterificada (Marín-Rodríguez et al., 2002); las pectinmetilesterasas (PME) degradan poliurónidos metilesterificados (Wakabayashi et al., 2003) y las expansinas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre las microfibrillas de celulosa y glicanos entrecruzados (Rose et al., 1997; Brummell et al., 1999b). La contribución exacta que cada enzima presta para el ablandamiento del fruto sigue siendo poco clara debido al hecho de que los mecanismos debajo de la pared celular mediados por los cambios de textura son complejos.
Tomando al tomate como modelo, se han aislado algunos genes potencialmente relacionados con la degradación de la pared celular (Bouzayen et al., 2010). Sin embargo, se ha mostrado que la supresión de los genes candidatos, como aquellos que codifican para PG, PME y β-glucanasa, no tienen gran impacto en la evolución de la firmeza del fruto (Giovannoni et al., 1989; Tieman et al., 1992; Brummell et al., 1999a).
Dentro de la familia de genes que degradan la pared celular de frutos climatéricos, algunos miembros son regulados por el etileno, mientras que otros no, lo que confirma la coexistencia de procesos dependientes e independientes de etileno (Flores et al., 2001; Nishiyama et al., 2007). En general, parece que el ablandamiento del fruto involucra a muchos genes que codifican una variedad de enzimas que degradan la pared celular y proteínas no enzimáticas. Cada proteína podría jugar un papel específico en el ablandamiento y en los cambios de textura (Bouzayen et al., 2010).
El desmontaje de la matriz de polisacáridos de la pared celular relacionado con la maduración, es generalmente el único factor que se menciona al describir la base estructural del ablandamiento del fruto y la pérdida asociada con la vida útil y la calidad del fruto, aunque hay otros (Matas et al., 2009). Sin embargo, estudios recientes han comenzado a examinar la implicación potencial y la importancia relativa de otras estructuras y procesos fisiológicos. Por ejemplo, se ha propuesto que las diferencias en la estructura y la composición de la cutícula del fruto de tomate pueden estar asociados con la variación sustancial de la vida de anaquel del fruto que se ha reportado en diferentes genotipos (Saladié et al., 2007).
La cutícula cumple funciones biológicas de impacto en la calidad y la vida de anaquel de frutos, incluyendo la capacidad de mantener la integridad de la piel (Hovav et al., 2007), controlar la transpiración cuticular (Leide et al., 2007) y limitar la infección microbiana. Además, juega un papel en la interacción planta- insecto como componente de la traducción de señales para la activación de genes específicos, controlando los cambios de temperatura y proporcionando soporte mecánico (Tafolla -Arellano et al., 2013) . Otros reportes han resaltado los procesos relacionados con la maduración que probablemente contribuyen a la firmeza del fruto, como la presión de turgencia (Saladié et al., 2007; Thomas et al., 2008).
Conclusiones
A pesar del avance en el estudio de los mecanismos de la maduración de los frutos, aún quedan sin responder un gran número de interrogantes, como la relación entre la síntesis de etileno y la expresión diferencial de genes relacionados con la producción de compuestos volátiles, con el cambio de color, pero más aún, con los que codifican a las enzimas relacionadas con el ablandamiento.
Los factores de transcripción han mostrado tener una gran importancia, no sólo durante el desarrollo temprano, sino también en el control regulatorio de la maduración y la senescencia, aunque hay avances en la identificación de estos reguladores, aún queda mucho por investigar.
El ablandamiento del fruto es el proceso que se da como resultado de la hidrólisis de los diversos componentes de la pared celular que incluyen celulosa, hemicelulosa, pectina y proteínas. La hidrólisis de estos componentes se produce por la acción de PG, PME, PL, RG, endo-1,4-β-D-glucanasa (EGasa) y β-galactosidasa. El papel de estas enzimas ha sido ampliamente confirmado mediante la aplicación de técnicas moleculares que implican sobreexpresar y disminuir la actividad enzimática conocida; es decir, alteración en el proceso de hidrólisis.
En un futuro próximo, será posible controlar la maduración de los frutos y alargar su vida de anaquel manipulando la producción de etileno utilizando un enfoque transgénico.
