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Introducción
En la región de la Ciénega de Chapala porción Michoacán la mayor parte de los cultivos forrajeros son el sustento fundamental de los sistemas ganaderos tradicionales (Moreno et al., 2012). Sin embargo, los incrementos de las zonas agrícolas cultivables han impulsado a estos sistemas a moverse hacia áreas menos productivas, de tipo marginal y con problemas de diversos tipos, entre los que destacan: factores ambientales tales como la escasez de agua y el aumento de salinidad y sodicidad, debido al recurrente uso del agua subterránea de mala calidad (Silva et al., 2006). Estos factores ambientales afectan el establecimiento y desarrollo de las especies orientadas a la producción agrícola (García et al., 2005; Colunga et al., 2009). Situación que se refleja directamente en la economía de los productores.
De acuerdo con Villa et al. (2006), el sodio (Na+) es uno de los iones dominantes en los ambientes salinos y durante todo el ciclo fenológico de las plantas (especialmente de las glicofitas), induciendo mal funcionamiento de sus procesos fisiológicos, ya que puede considerarse equivalente a la sequía, debido a que retiene agua pero indisponible para las semillas o las plántulas; suprimiéndose la absorción neta de nutrimentos, afectando la integridad de la membrana, causando numerosos problemas en el crecimiento y desarrollo de éstas (Tester y Davenport, 2003; Munns y Tester, 2008).
Sin embargo, la tolerancia a la salinidad de cada especie dependerá de las condiciones ambientales y de la habilidad que posea para controlar la absorción y el transporte de Na+ al tejido fotosintético (Laynez et al., 2008; Reyes et al., 2013), principalmente durante la fase de germinación, donde se producen cambios y adaptaciones que pueden afectar no solo al proceso germinativo en sí, sino también al crecimiento y desarrollo futuro de las plantas, por ser la primera etapa crucial del ciclo de vida de muchas especies (Ruiz y Terenti, 2012). Esto ha llevado a indagar acerca de los efectos de las sales sobre la germinación y emergencia en diversos cultivos, tales como el frijol (Caupi Vigna cinencis) (Paliwal y Maliwal, 1973), arroz (Oryza sativa) (Pearson et al., 1966), trigo (Triticum aestivum) (Hampson y Simpson, 1990) y soya (Glycine max L.) (Hosseini et al., 2002).
Para lograr mejoras en la productividad de los sistemas ganaderos, será imperante incrementar la información de los procesos fisiológicos y bioquímicos en las especies forrajeras, al encontrarse inmersos en ambientes estresantes por efecto de NaCl, ya que diversos investigadores han utilizado éstos dos criterios como indicadores útiles para evaluar la tolerancia a la salinidad entre especies (Ulfat et al., 2007; Aghaei et al., 2008; Sankar et al., 2011). Por tal razón, el objetivo del presente estudio es evaluar la capacidad de germinación y emergencia de siete especies forrajeras, entre ellas pasto reygrass (Lolium perenne L.), pasto estrella (Cynodon nlemfuensis), cebada (Hordeum vulgare L.), janamargo (Vicia sativa L.), garbanzo (Cicer arietinum L.), alfalfa (Medicago sativa L.) y avena (Avena sativa L.,) en condiciones in vitro, al ser expuestas a diferentes concentraciones de cloruro de sodio (NaCl).
Materiales y métodos
Material vegetal
Las semillas de las plantas forrajeras se obtuvieron a través de una comercializadora de semillas y agroquímicos de la región de la Ciénega de Chapala michoacana: pasto reygrass cultivar oregón común (Lolium perenne L.); pasto estrella cultivar Estrella Africana común (Cynodon nlemfuensis); cultivar esmeralda (Hordeum vulgare L.); cultivar Mezquita (Vicia sativa L.); cultivar Lerma (Cicer arietinum L.); cultivar Apollo (Medicago sativa L.); cultivar Chihuahua (Avena sativa L.).
Soluciones Salinas
Para probar las respuestas a la salinidad, las semillas fueron sometidas a diferentes concentraciones de NaCl en condiciones controladas durante 21 días, el experimento se realizó tres veces. Las concentraciones de NaCl probadas en el estudio fueron 50 mM (4.8 dS m-1), 100 mM (9.6 dS m-1), 200 mM (18.25 dS m-1), 400 mM (35.3 dS m-1) y agua destilada como testigo (Hanslin y Eggen, 2005).
Capacidad de hidratación de las semillas
Las semillas después de ser hidratas con un volumen de 4 ml, se pesaron (g), con una balanza analítica (SA 120, Scientech Inc., CO, EE.UU.) durante 12 h, para cada especie y cada tratamiento (0, 50, 100, 200 y 400 mM), por triplicado (Ruiz y Terenti, 2012). Las semillas se mantuvieron a temperatura ambiente (≈23°C) en el periodo de imbibición.
Germinación
Después de registrar la imbibición, se evaluó el porcentaje de germinación (PG) en un período de 21 días, las semillas fueron colocadas en una incubadora Precision 815 (Thermo Scientific), con régimen de temperatura 25/17 °C (día/noche). Se registró diariamente y se consideraron germinadas cuando la radícula sobresalía a través de la cubierta seminal (2 mm) (Pablo et al., 2013). Se realizaron mediciones de la longitud alcanzada en mm, tanto en la raíz como en el hipocotílo de cada especie, con un calibrador digital Vernier 14388 de la marca Truper®.
Análisis químico
Las plántulas germinadas fueron lavadas con agua destilada y secadas en estufa a 70 °C durante 24 h, posteriormente se molieron utilizando un mortero para la determinación de la composición mineral. La determinación de Na+, K+, Ca2 + y Mg2+ se llevó a cabo por medio de una digestión ácida y por espectrometría de absorción atómica (Allen, 1989), usando un espectrómetro (AAS), modelo SensAA.
Análisis de datos
El experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar. Las unidades experimentales fueron cajas Petri de 20 cm de diámetro con papel de filtro (Whatman 42), por cada una de las variedades de plantas forrajeras. En cada caja se colocaron 50 semillas, con 3 repeticiones por cada solución salina. Se realizo un análisis de varianza y test de Tukey (p≤ 0.05). Estos se realizaron con el programa estadístico Statistical Analysis Systems 9.1® (SAS, 2004).
Resultados y discusión
El Cuadro 1 muestra los valores medios y las desviaciones estándar obtenidas en la imbibición de las semillas de las especies forrajeras por cada concentración salina evaluada. Las semillas C. arietinum, A. sativa y C. nlemfuensis presentaron diferencias significativas (p≤ 0.05) a partir de los tratamientos 50 y 100 mM respecto a sus testigos. En el caso de las especies H. vulgare, M. sativa, L. perenne y V. sativa, se observaron diferencias significativas en los tratamientos con mayor concentración salina; es decir, a 200 y 400 mM.
Letras iguales no difieren significativamente entre sí según prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Cuadro 1 Imbibición de las siete semillas forrajeras.
De acuerdo con Murillo et al. (2001), las concentraciones altas de NaCl provocan que la movilidad del agua disminuya y por ende la velocidad de imbibición de las semillas, que a su vez, repercute en la síntesis de biopolímeros, proteínas, ácidos nucleicos y la cantidad de hormonas reguladoras de la célula vegetal; aspectos que en su conjunto limitan la intensidad de los procesos de crecimiento conforme se desarrollan en la subsecuente etapa de germinación, también llamada fase de rompimiento de las glumelas, donde intervienen algunos mecanismos fisiológicos de arranque relacionados con los primeros ciclos de división y diferenciación celular que se suscitan en el embrión, independientemente de los productos de la hidrolisis de las sustancias de reserva de las semillas. Según, Hernández et al. (2015), esta respuesta diferenciada entre especies, pudiera ser debido a que cada genotipo requiere de un porcentaje crítico de agua para su germinación, derivadas de la dependencia de la naturaleza química de sus compuestos de reservas y estructurales. Lo cual se validó cuando las distintas variedades exhibieron una reducción en el porcentaje de germinación a través de las diferentes concentraciones a las que fueron sometidas (Cuadro 2).
Letras iguales no difieren significativamente entre sí según prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Cuadro 2 Efectos del gradiente de salinidad con NaCl sobre la germinación, longitud de raíz y longitud del hipocotílo desiete especies forrajeras a 21 días de evaluación.
Los sultados muestran un porcentaje de germinación mayor al 70% para todas las especies en las concentraciones de 0, 50 y 100 mM de NaCl, con excepción de C. nlemfuensis cuya tasa de germinación se redujo 61.45% a 100 mM. Sin embargo, la especie H. vulgare, tuvo la mayor tasa de germinación (>95%) para los tres niveles de concentración salina.
Por otra parte, la tasa de germinación de todas las especies a 200 y 400 mM se vio reducida drásticamente, a estos niveles de salinidad el porcentaje de germinación osciló entre 40 y 0% respectivamente; excepto para las especies L. perenne y H. Vulgare debido que en la primera, el porcentaje de germinación se redujo únicamente 47.3% a 200 mM, en tanto que, para la segunda, su reducción fue de 33.33 y 76% a 200 y 400 mM respectivamente (Cuadro 3). A pesar que en ésta última especie la reducción fue drástica, H. vulgare fue la única que logró germinar a 400 mM de NaCl. Este resultado coincide con los reportados por Munns y Tester (2008); Royo y Aragües (1991); Martínez-Cob et al. (1987), quienes señalaron que a este nivel de concentración salina H. vulgare presenta adecua capacidad de germinación-emergencia. La tendencia general de la reducción en la germinación con el aumento de la concentración salina es una respuesta frecuentemente observada en varias especies (Ruiz y Terenti, 2012).
Letras iguales no difieren significativamente entre sí según prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Cuadro 3 Contenido de Na+, K+, Ca2+, Mg2+ y relación K+/Na+.
Campos et al. (2011) encontraron que la germinación en diferentes cultivares de Phaseohus vulgaris L. sólo fueron afectados a partir de 100 mM de NaCl. Por su parte, Madueño et al. (2006), encontraron que a partir de 150 mM de NaCl, la tasa y el porcentaje de germinación de Rhynchosia minima L. una especie herbácea y de interés particular por su uso forrajero, se reduce. Estos resultados también coinciden con los obtenidos por Lombardo y Saladino (1997) quienes después de haber evaluado el efecto de la salinidad en la germinación en diversas hortalizas (Cichorium endivia L., Chicorium intybus L., Daucus carota L. y Petroselinum crispum L.), y forrajes (Trifolium alexandrinum L., Vicia sativa L., Medicago sativa L., Hedysarum coronarium L. y Lens culinaris L.), encontraron que conforme la conductividad eléctrica se incrementa, la germinación disminuye.
Según Flowers et al. (2010), la reducción de la germinación con el aumento de las concentraciones del NaCl es el resultado de una disminución o retardó de la absorción del agua en las semillas por los efectos tóxicos que ejercen los iones sobre ellas, ya que se afectan las funciones de la membrana y la pared celular del embrión; producto de una reducción en la permeabilidad de las membranas plasmáticas, del incremento del influjo de iones externos y del eflujo de solutos citosólicos. Por su parte, Mahdavi y Modarres (2007) señalan que la reducción de la germinación en condiciones de salinidad se debe también a que las semillas incrementan su estado la latencia y dormancia, dos mecanismos que ayudan a las semillas a germinar en los momentos más adecuados para que las nuevas plantas tengan las máximas posibilidades de supervivencia.
Pese a estas posturas, es evidente que la mayoría de los autores concuerdan en que el efecto inhibitorio de las sales sobre la germinación es tanto iónico como osmótico (Khan et al., 2006), y en la naturaleza actuaría induciendo la dormancia para sincronizar los eventos germinativos con las condiciones ambientales (Redbo, 1994).
Sin embargo, investigadores como Mansour y Salama (2004), han encontrado que las diferencias en la tolerancia a la salinidad varían con las permeabilidades de cada genotipo, razón por lo cual, tanto la composición y estructura lipídica como la viscosidad citoplasmática de cada especie se presentan como factores clave en la preservación de la integridad de la membrana plasmática. Señalamiento que explicaría porque H. vulgare y L. perenne lograron una alta tasa de germinación en las concentraciones de salinidad más elevadas. En el Cuadro 2, también se observa que el tamaño de la radícula (LR) y la longitud del hipocotílo (LH) de las siete especies forrajeras se vieron influenciadas con los incrementos de las concentraciones de NaCl; así como, los mayores valores de crecimiento en todas las especies se encontraron a 0, 50 y 100 mM.
Las especies H. vulgare, M. sativa, L. perenne y V. sativa exhibieron un grado de afectación menor al 50% en el crecimiento, tanto de la raíz como del hipocotílo, bajo estos mismos niveles de concentración salina respecto a sus propios testigos. C. nlemfuensis fue la especie con menor crecimiento a 100 mM en relación con el resto de las forrajeras evaluadas. En la concentración salina de 200 mM hubo una afectación mayor al 90% en el crecimiento de la raíz y del hipocotílo de todas las especies, con excepción de H. vulgare y L. perenne, cuyo crecimiento mermó entre 43.35 y 69.85% para la raíz y en 30.02 y 100% para el hipocotílo respectivamente. Jamil et al. (2007); Llanes et al. (2005), señalaron que las longitudes de de las radículas e hipocotílos se reducen al incrementar las concentraciones de NaCl a partir de 50 Mm.
Tal disminución es el resultado de la pérdida de turgencia celular, provocada por la disminución del potencial osmótico en el medio de crecimiento, lo cual es indispensable para el debilitamiento del endospermo y la expansión del embrión; al ser un proceso de crecimiento impulsado por la absorción de agua (Nawaz et al., 2013). El Cuadro 3, muestra el contenido de Sodio (Na+), Potasio (K+), Calcio (Ca2+), Magnesio (Mg2+) y la relación K+/Na+ de las siete especies forrajeras a los 21 días de la prueba.
Contenido de Na +
El contenido de sodio (Na+) en todas las especies forrajeras mostró diferencias significativas (p≤ 0.05) en los diferentes tratamientos respecto a sus propios testigos. El contenido de Na+ en los tejidos de las especies H. vulgare, L. perenne y V. sativa fue menor al 50% en los tratamientos a 50 y 100 mM NaCl; siendo H. vulgare la especie con menor contenido Na+ (entre 14.81 y 37.03%). Los mayores contenidos de Na+ se encontraron a 200 mM en las especies M. sativa, C. arietinum y A. sativa cuyos incrementos fueron de 122.72, 218.18 y 247.05% respectivamente. Los resultados coinciden con los encontrados por Parés y Basso (2013) quienes señalaron que la absorción de Na+ incrementa con las concentraciones de NaCl. Esto puede deberse a la necesidad de las especies de mantener un potencial osmótico intracelular aún más bajo que el del agua proporcionado por el medio externo, como un mecanismo eficiente de energía de tolerancia a la salinidad (Casierra et al., 2000).
Contenido de K +
El potasio K+ es uno de los cationes principales que participa activamente en los procesos de osmoregulación, mantenimiento de la turgencia y expansión celular, además de contribuir a más de 6% del peso seco de la planta (Africano y Pinzón, 2015). Los resultados mostraron que el contenido de K+ sufrió una reducción menor a 10% para los tratamientos de 50 y 100 mM respecto al control en todas las especies; con excepción de A. sativa y C. nlemfuensis cuya reducción varió entre 18.3% y 27.25% respectivamente. A 200 mM, el contenido de K+ de las especies se vio reducido de 25.72 a 52.11%; siendo H. vulgare y L. perenne las especies que mostraron una menor reducción, al oscilar entre 5.74 y 16.73% respectivamente. La concentración de K+ es más baja en plantas estresadas por salinidad comparada con los tratamientos sin estrés durante el ciclo de evaluación, lo cual sugiere que el potasio constituye el principal mecanismo de tolerancia al estrés salino, por su capacidad de mantener la turgencia celular, el ajuste osmótico y el crecimiento (Sobhanian et al., 2010).
Relación (K + /Na + )
Las concentraciones de NaCl empleadas tuvieron efecto significativo (p≤ 0.05) sobre la relación K+/Na+. En todas las plántulas testigo se observó que la relación K+/Na+ fue mayor a la de los tratamientos, este comportamiento puede obedecer a que en condiciones de baja salinidad las plántulas tienden a mantener las concentraciones de K+ altas y casi estables para su funcionamiento. A partir de la concentración de NaCl 50 mM la relación disminuyó con el incremento en la salinidad, posiblemente por el efecto competitivo entre el K+ y el Na+ por los sitios de absorción en las raíces de las plantas (Lamz y González, 2015). La relación K+/Na+ en los tratamientos a 50 y 100 mM disminuyeron respectivamente 14.57 y 28.94% en H. vulgare, 27.44 y 41.47% en L. perenne y 27.74 y 44.38% en V. sativa respecto a los testigos; mientras que en las especies M. sativa, C. arietinum, A. sativa y C. nlemfuensis la disminución fue mayor, entre 46.24 y 67.9% respecto a los testigos. Para la concentración de 200 mM, la relación K+/Na+ se redujo en menor proporción en las especies H. vulgare, L. perenne y V. sativa, entre 42.15 y 72.97%; Para M. sativa, C. arietinum y A. sativa la disminución fue mayor, entre 74.13 y 81.49%. La relación K+/Na+ es considerada un componente clave de la tolerancia a la salinidad en plantas, por su habilidad de evitar la toxicidad por Na+ y al mantenimiento de Ca2+ y K+ (Chen et al., 2007).
Contenido de Ca 2+ y Mg 2+
El calcio (Ca2+) es un factor importante en el mantenimiento de la integridad de la membrana y la regulación del transporte de iones (Cramer et al., 1985). Por su parte, el magnesio (Mg2+) forma parte esencial de la clorofila y es necesario para la actividad enzimática; por lo cual se encuentra asociado con el metabolismo energético (Ross, 2004). Los resultados mostraron que el contenido de Calcio y Magnesio (Ca2+ y Mg2+) disminuyeron drásticamente a medida que las concentraciones salinas incrementaron. La reducción se observó de manera contundente en las especies C. arietinum, A. sativa y C. nlemfuensis conforme se incrementaron los niveles de salinidad. En estas especies, el Ca2+ disminuyó de 21.05 a 37.5% cuando fueron tratadas a 50 mM; de 42.1 a 62.5% a 100 mM y, de 57.84 a 100% a 200 mM de NaCl. En cuanto al contenido de Mg2+ se observó una respuesta similar, al disminuir de 31.57 a 61.53% cuando fueron tratadas a 50 mM; de 69.23 a 76.96% a 100 mM y de 78.94 a 100% a 200 mM NaCl. La acumulación de Na+ en tejido vegetal en un medio de crecimiento salino se atribuye a una disminución de la integralidad de la membrana celular, debido a la sustitución del Ca2+ por el Na+ que influye directamente en sus funciones biológicas (Nawaz et al., 2013).
El Na+ desplaza al Ca2+ desde la membrana plasmática hacia los espacios intercelulares, lo que permite que se incremente la absorción de Na+ en detrimento de la absorción de K+, y provoque cambios significativos en la anatomía (Tester y Davenport, 2003), como se observó en el crecimiento de la longitud de la raíz e hipocotílo de las especies; lo cual puede estar relacionado también con las reducciones de Mg2+, ya que según Cakmak (2014), muchos procesos metabólicos en los sistemas de las plantas necesitan de un abastecimiento adecuado de éste catión divalente a fin de llevar a cabo una apropiada fotosíntesis, biosíntesis de proteínas y biosíntesis de la clorofila; necesaria para mantener una alta tasa de crecimiento de las raíces y partes de brotes jóvenes, impidiendo su crecimiento y causando que la absorción de nutrientes se encuentre restringida.
Conclusiones
De las siete especies forrajeras evaluadas, H. vulgare fue la más tolerante a los diferentes niveles de concentración salina, seguida de L. perenne L. y V. Sativa. En tanto que C. nlemfuensis fue la especie con mayor grado de afectación a partir de 100 mM lo cual se reflejó en el tamaño de la radícula y en la longitud del hipocotílo de estas mismas especies. A 200 mM, todas las especies mostraron los mayores contenidos de Na+ y las mayores reducciones en el contenido de K+, Ca2+ y Mg2+. Sin embargo, las especies H. vulgare y L. perenne mostraron una menor relación K+/Na+, validando con ello, ser las más tolerantes ante este nivel de concentración salina.
