Introducción

La inocuidad de cualquier alimento es una característica indispensable que debe tener todo producto al consumirlo, por eso se han diseñado normas para que esto se lleve a cabo, en cumplimiento de un marco normativo obligatorio. Sin embargo, las normas establecidas en algunas ocasiones se han elaborado sin tener en cuenta completamente las características de las actividades productivas reales (^{Arispe y Tapia, 2007}).

Para el caso específico de los quesos genuinos mexicanos, por ejemplo, la norma NOM-243-SSA1-2010 (^{Secretaría de Salud, 2010}), hace obligatorias diversas operaciones que muchas veces en los procesos para la elaboración de los quesos de este tipo, no se llevan a cabo; esto los pone en una situación de incumplimiento con las normas y genera diversas complicaciones a los productores. La utilización de leche pasteurizada por atender la inocuidad, es una de las principales operaciones que la norma marca, sin embargo muchos de los quesos genuinos no podrían elaborarse realizado este proceso, ya que muchas de las características que los identifican y los hacen genuinos son generadas por los microorganismos nativos provenientes de la leche sin pasteurizar. El no pasteurizar no deriva necesariamente en una falta de inocuidad, pero es una manera fácil y práctica que las autoridades en salud utilizan para forzar a las pequeñas queserías, generalmente artesanales a cumplir con la normatividad.

Esta discriminación hacia la forma de producción afecta directamente la competitividad del sector quesero artesanal, alentando la depreciación, no solamente económica, sino también social de sus productos y obliga a que los productores a abandonar estos sistemas de producción, o sustituirlos por otros, que les sean más redituables, generándose así la pérdida de los procesos y productos genuinos.

El hecho de que en México exista una reglamentación que, enfocada hacia a la inocuidad, genera la pérdida de diversos procesos artesanales y no permite otra alternativa que pudiese contribuir a que éstos se mantengan, es razón para realizar dicha investigación, ayudando de esta manera no sólo a la preservación de dichos procesos. Esto puede ayudar a la preservación de los alimentos artesanales que son parte importante no sólo de nuestra cultura culinaria sino también parte de los rasgos que nos identifican como nación; concretamente este trabajo puede contribuir a resolver la situación reglamentaria que afecta a los productores de quesos genuinos artesanales mexicanos (^{Cervantes et al., 2008}).

En el país, la Secretaría de Salud, a través de la norma oficial antes mencionada, considera que en los productos lácteos, como los quesos, debe haber un límite de microorganismos indicadores y también que no debe haber patógenos, por lo que hace obligatoria la pasteurización (^{NOM, 2010}). Sin embargo esta postura oficial debería ser reevaluada a la luz de una mayor comprensión de las características de los quesos artesanales existentes, en cuyas pastas se llevan a cabo fermentaciones complejas que contribuyen a su inocuidad.

De acuerdo con ^{Jay et al. (2006)}, los agentes patógenos más importantes en los productos lácteos son: Streptococcus mastiditis, causante de la mastitis contagiosa, Mycobacterium tuberculosis, Brucella abortus y Salmonella spp.

En particular la Salmonella spp., es un patógeno importante que se ha encontrado en quesos frescos de leche cruda y pasteurizados, llega a éstos por diversos medios y constituye un problema serio en la calidad de este producto. En ese sentido a través de la reglamentación oficial se ha insistido en que la problemática en la producción artesanal atañe a los procesos de elaboración queso, sin enfocar el sistema completo de producción y las diferentes vertientes que puede haber en la producción y que pueden llevar a la falta de inocuidad en el producto como malas prácticas agropecuarias, malas prácticas de manufactura, malas prácticas en la distribución del producto e incluso en la venta, así en como otras operaciones existentes en la cadena de distribución que pueden generar contaminación de los quesos artesanales (^{Scaramelli et al., 1999}).

La Organización Mundial de la Salud (OMS, 2008) y ^{Longo (2013)} coinciden en que la salmonelosis, así como la mayoría de las enfermedades gastrointestinales, es una de las principales afecciones por las que las personas requieren atención médica, no sólo en México sino en todo el mundo. Por ejemplo, para el caso específico de la tifoidea, existe una tendencia mundial al alza casi exponencial a partir del año 2002, con 22 millones de casos, teniendo una estabilización en 2007; sin embargo, ésta sigue al alza.

En los países desarrollados, la incidencia de casos ha disminuido por las mejoras sanitarias, sin embargo se estima que cada año ocurren en el mundo aproximadamente 17 millones de casos con 300 000 fallecidos (^{INS, 2014}).

La enfermedad es causada por Salmonella typhimurium y en otras ocasiones menos frecuentes, por algunas de las variedades de Salmonella paratyphi, que atacan específicamente al hombre. El microorganismo tiene vía de transmisión oral-fecal, por lo que puede encontrarse en alimentos manejados por portadores, que han tenido contacto con agua de drenaje, como vegetales irrigados con ella, algunos alimentos provenientes del mar, entre otros (^{Díaz, 2005}). Uno de estos alimentos son los quesos artesanales.

Por lo anterior existe la necesidad de buscar una alternativa a la pasteurización de la leche con que se elaboran los quesos, una de ellas podría ser la fermentación acidoláctica generada por las bacterias acidolácticas (BAL) presentes en la microflora nativa de la leche y que realizan procesos de fermentación en los quesos. El hecho de comprobar que la fermentación, generada por las bacterias acidolácticas (BAL), puede inhibir a un patógeno como salmonella, aporta pruebas y el problema puede ser de otra índole. Como parte de la investigación en el presente trabajo se muestran parte de los resultados obtenidos.

Por fortuna, en variadas investigaciones se ha comprobado que cepas nativas de bacterias acidolácticas (BAL), aisladas de quesos artesanales mexicanos y de otros países, han tenido efectos inhibitorios contra diversos patógenos incluida la Salmonella spp. (^{Del Campo et al., 2008}).

En este trabajo se intenta demostrar que la fermentación láctica desarrollada por dichas BAL es capaz de inhibir el crecimiento de este patógeno, así los resultados de esta investigación podrían contribuir a demostrar que la inocuidad en quesos artesanales de leche cruda podría lograse por esta vía biológica, sin recurrir a la pasteurización.

Las bacterias acidolácticas (BAL) son un grupo muy heterogeneo de microorganismos desde un punto de vista taxonómico. Son bacilos o cocos Gram(+) anaerobias o aerobias facultativas y que responden negaivamente a las pruebas de catalasa y oxidasa. En común todas las BAL producen ácido láctico como principal o único metabolito en la fermentación de azúcares. Están clasificadas en dos grupos, las homofermentativas que sólo producen ácido láctico a partir de la glucosa y las heterofermentativas que producen CO₂ además de otros metabolitos (^{Parra, 2010}).

La fermentación llevada a cabo por BAL es una de las técnicas utilizadas en la industria para preservar y mejorar las propiedades sensoriales de los alimentos; este bioproceso genera metabolitos que le proporciona a los productos aromas y sabores deseados. Las principales funciones de la fermentación son la acidificación, la mejora de la textura y el desarrollo del flavor, entre otras. Las bacterias acidolácticas se encuentran presentes en la leche de manera natural, además se ha encontrado que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de patógenos como Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli y Staphylococcus aureus, a través de diferentes compuestos generados en la fermentación, siendo el ácido láctico el principal y las bacteriocinas el más efectivo (^{Piña et al., 2011}).

^{Mataragas (2003)}; ^{Peláez (2005)}; ^{Palomino (2012)}; ^{Parra (2010)}, explican que las bacterias ácidolácticas, que no sólo son responsables de brindar propiedades sensoriales deseables a los productos lácteos, sino que los subproductos de la fermentación que realizan, por ejemplo el ácido láctico y acético, el peróxido de hidrógeno, además de otros, afectan el desarrollo de variados patógenos, incluso inhibiéndolos, dándole cierta inocuidad al producto no sólo en los productos lácteos; lo anterior se ha demostrado en cada una de sus investigaciones.

En la actualidad se utilizan tanto los cultivos puros agregados a los alimentos, como los subproductos de la fermentación de las bacterias ácido-lácticas, para la conservación de los alimentos de manera comercial (Vásquez, 2009).

Las sustancias con efecto antimicrobiano con mayor efecto producidas por las BAL y que se han encontrado, para este fin son las “bacteriocinas”, éstas son compuestos peptídicos naturales, que tienen efecto preferentemente en contra de bacterias Gram(+), aunque también afectan a las Gram(-). Por ejemplo la nisina, una bacteriosina producida por Lactococcus lactis, está aprobada y considerada segura por la FDA, como aditivo para la conservación de alimentos y ya se usa comercialmente (^{Piña et al., 2011}). También existen productos antimicrobianos de naturaleza no peptídica como lo son los ácidos orgánicos, diacetilo, acetoína, peróxido de hidrógeno, reuterina, reuterociclina, péptidos antifúngicos y bacteriosinas. Algunas bacterias ácido lácticas que se ha encontrado secretan bacteriocinas son pertenecientes a los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus y Pediococcus. Incluso ya se han elaborado preparaciones de bacteriocinas puras y semipuras para la inhibición de patógenos en alimentos (^{Saidi, 2011}).

La investigaciones hechas muestran que las BAL nativas de quesos genuinos tienen este efecto inhibidor de patógenos, por lo que la Salmonella spp., tambien puede ser inhibda por la acción de las BAL (^{Del Campo, 2008}). También se ha encontrado el mismo resultado en diversas pruebas de antagonismo de cepas de BAL con otros patógenos como Escherichia coli y Staphylococcus aureus como han reportado ^{Larios (2007)}; ^{Aguilar y Klotz (2008)}.

Por todo lo anterior es que surge la siguiente pregunta de investigación: ¿en un queso panela artesanal que se elabora en el estado de Jalisco, México se pueden distinguir BAL con efecto antagónico en contra de Salmonella enterica var. Typhimurium? Para dar la respuesta a la pregunta se propuso una investigación que tuvo por objetivo identificar en género y especie algunas bacterias acidolácticas nativas de un queso genuino mexicano que tuvieran capacidad antagónica en contra de Salmonella enterica var. Typhimurium. y estudiar sus características tecnológicas. La hipótesis por probar fue que en un queso genuino mexicano de leche sin pasteurizar se identifican especies de BAL con efecto antagónico contra la Salmonella enterica var. Typhimurium.

Materiales y métodos

Para el asilamiento se tomaron dos muestras de 25 g de queso panela artesanal genuino mexicano al azar de una quesería, ubicada en Soyatlán del Oro, Jalisco, obtenidas posterior a su elaboración, transportadas a temperatura de refrigeración (menor a 8 °C) y en cubiertas plásticas y que se sacaron de refrigeración, la primera a una hora y la segunda a 24 h, fueron diluidas en 225 mL de agua destilada peptonada (0.001%, peptona de caseína) estéril y homogenizados por un minuto. Se transfirieron 10 mL de ésta dilución a un vial de 100 mL de capacidad que contenía 90 mL de agua peptonada estéril. Éste mismo proceso se repitió hasta obtener una dilución 10^-6. Un mililitro de las diluciones 10^-4, 10^-5 y 10^-6, fue sembrado por triplicado y mediante vaciado en placa en cajas Petri con medio agar ManRogosa y Sharpe (MRSA).

Las cajas sembradas se incubaron en jarras anaeróbicas a 37 ±1 °C, por tres días. Posteriormente se cuantificó la diversidad colonial y la población de BAL (UFC g^-1 de queso fresco). Una cepa de cada tipo de colonia fue aislada con asa bacteriológica y resembrada en agar MRS e incubado a 37 ±1 °C por tres días. Se confirmó la pureza mediante la morfología colonial y microscópica por tinción de Gram. Se seleccionaron las cepas Gram(+) y catalasa(-), como presuntivamente BAL. Estas cepas fueron conservadas por resiembras en medio inclinado MRSA.

Las cepas de BAL seleccionadas se reactivaron en caldo MRS a 37 °C por tres días en anaerobiosis. Al término de la incubación se centrifugaron 10 000 rpm por 10 min y el sobrenadante de cada cepa se recuperó. Posterior a esto, discos de 5 mm de diámetro fueron impregnados con 20 µL de sobrenadante en 3 repeticiones por sobrenadante, los cuales fueron colocados en la superficie de tripteina soya agar (TSA), previamente sembrado masivamente con un cultivo en medio líquido de Salmonella enterica var. Typhimurium de 1*10⁸ UFC mL^-1. Las cajas se incubaron a 42 °C en aerobiosis por 48h, después de las cuales se identificaron los sobrenadante de las BAL que formaron halo de inhibición de la cepa de salmonela y se midió el diámetro del halo.

Las cepas seleccionadas se identificaron mediante pruebas bioquímicas del sistema “API step 20” (bioMérieux) y el catálogo de perfiles bioquímicos proporcionado por el sistema.

Después, se estudió la cinética de crecimiento donde el cultivo reactivado de cada cepa seleccionada fue sembrado, por triplicado, en 25 mL caldo MRS estéril. Los medios se incubaron en anaerobiosis, a 37 °C, más adelante, se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm cada 30 min. La absorbancia a cada tiempo de medición fue usada para determinar la tasa de cresimiento (S; segundos), el final de la fase lag o de adaptación (L; en segundos) y crecimiento máximo (DOm; absorbancia) del modelo DOo= DOm ∗ 1+ Exp 2−4∗S∗ T−L −1 , para cada cepa seleccionada. A los datos obtenidos de cada uno de los parámetros se les hicieron pruebas de normalidad y homogeneidad de varianzas para posteriormente hacerles un análisis de la varianza (ANOVA) con un nivel de significancia (α= 0.05) y pruebas de comparación de medias de Tukey (α= 0.05) para encontrar que cepa tenía las mejores características de desarrollo. Los análisis se apoyaron del paquete SAS V9.4.

Resultados y discusión

El queso genuino usado en este experimento, con una hora de descongelación tuvo una población de BAL menor (1*10⁶ UFC g^-1) que el de 24 h de descongelación a temperatura ambiente (9.7*10⁶ UFC g^-1). Lo anterior coincide con ^{Del Campo et al. (2008)}, que encontraron una concentración entre 6 y 8 ciclos logarítmicos de UFC g^-1 de queso panela, mientras que ^{Ruth et al. (2003)} cuantificaron una población promedio equivalente a cinco ciclos logarítmicos en quesos frescos, obteniendo una concentración un poco más baja.

Durante el procedimiento de aislamiento y selección, se lograron obtener 55 cepas presuntivamente del tipo BAL. En los traspasos posteriores (seis) para su purificación, se eliminaron 24 (43.6%) que no reunieron las características morfológicas y que dieron positivo a la prueba de catalasa. El resto de aislamientos 31 (56.4%) fueron consideradas como BAL y se usaron para la prueba de antagonismo. Once de los 31 sobrenadantes (35.5%) formaron halos de inhibición contra Salmonella enterica var. Typhimurium. Esta inhibición fue atribuida a la presencia de algún metabolito de las BAL (Figura 1).

Figura 1 Halo de inhibición bajo de Salmonella entérica var. Typhimurium generado por el efecto de los metabolitos de una cepa de BAL aislada de queso artesanal. 

Sin embargo, el efecto de ocho de los once sobrenadantes fue bajo (Figura 1) y en sólo tres el efecto fue destacable. Esto último indica que 9.6% de las BAL que colonizan provenientes de la leche con la que fue elaborado el queso genuino artesanal tipo panela, tienen efecto inhibitorio considerable en contra del crecimiento de Salmonella enterica var. Typhimurium. ^{Ramírez (2008)} encontró que 26% de las cepas que asilaron mostraron algún efecto inhibitorio contra de diversos patógenos Gram(+) o Gram(-), mayor al obtenido en esta investigación (20%) si consideramos los 55 asilamientos (11/55), pero menor si solo consideramos a los asilamientos presuntivos BAL (35.5%; 11/31).

^{Parras (2010)} considera que el efecto inhibitorio bajo pudo deberse a una concentración baja de los productos de la fermentación (entre ellos el ácido láctico) de las BAL puesto que por ejemplo, la cantidad de ácido láctico producido depende de la especie e incluso de la cepa.

Se midió el pH en los sobrenadantes dando un valor de 4.9. Lo anterior concuerda con lo publicado por ^{Makras et al. (2005)} que demostraron que la principal causa de la inhibición de Salmonella enterica var. Typhimurium por cepas de BAL en un medio sintético, es la caída del pH a valores entre 5 y 4.5. Por su parte ^{Aguilar et al. (2008)} ,percibieron que la disminución del pH a un valor inferior a 5 está relacionado al efecto de inhibición de las BAL contra Salmonella sp, cuya población disminuyó en tres ciclos logarítmicos. ^{Piña et al. (2011)} menciona la posibilidad de que existan otros metabolitos con la misma función.

Una vez realizadas las pruebas del sistema “API step 20” (bioMérieux) se obtuvieron los perfiles bioquímicos de las tres cepas estudiadas, luego de esto se buscó y comparó con los perfiles presentados en el catálogo, proporcionados por el mismo sistema, para conocer que género y especie era cada microorganismo. En la Cuadro 1 se presentan los perfiles bioquímicos de las cepas comparándolos con los perfiles bioquímicos de las especies a las que corresponden, en dónde se representa con el símbolo “+” si metabolizaron la sustancia correspondiente y con el símbolo “-” en caso de no hacerlo, generando así los perfiles de cada cepa.

Cuadro 1 Identificación de las tres cepas de BAL aisladas de queso panela artesanal genuino mexicano de leche sin pasteurizar, de acuerdo a las pruebas bioquímicas del sistema “API step 20”. 

+= el microorganismo respondió positivamente a la prueba; -= el microorganismo respondió negativamente.

De acuerdo con las reacciones bioquímicas del sistema “API step 20” (bioMérieux), la cepa “1” se identificó como Leuconostoc spp. El sistema “API 20 step” no identifica las especies del género Leuconostoc; sin embargo, ^{García et al. (2004)} muestra que las especies del género que metabolizan la lactosa y que se encuentran en los productos lácteos y en leche cruda son L. mesenteroides, L. lactis y L. argentinum; por ende la cepa debe pertenecer a alguna de estas tres especies.

Las cepas “2” y “3” se ajustaron a perfil de Lactococcus lactis subespecie cremoris. ^{Koneman (2006)}; ^{Alais (1985)} explican que esta especie mesófila, homofermentativa es la más ampliamente utilizada en productos lácteos, principalmente en quesos. Asimismo ^{Del Castillo et al. (2004)} exponen que Lactococcus lactis subespecie cremoris es una especie deseable dado que aporta propiedades organolépticas al producto; además de brindarle un presuntivo efecto de protector contra patógenos.

Rodríguez (2007), encontró que 22% de las cepas BAL aisladas a partir de leche y de quesos artesanales y semindustriales, son del género Leuconostoc, la mayoría fue encontrada en quesos no madurados o con 10 días de máxima maduración y con pH entre 4.6 y 6.3, condiciones similares al queso utilizado para el aislamiento de BAL en este estudio.

Los valores de los parámetros de la cinética de crecimiento mostraron que las tres cepas (1, 2 y 3) crecen muy similarmente (Figura 2). Sin llegar a ser diferente (p> 0.05), la fase L. La fase de adaptación de las tres cepas se encuentra en aproximadamente en un lapso de 0 a 168 min de haberse inoculado, siendo la tercera cepa seleccionada (identificada como Lactococcus lactis subespecie cremoris) la que mostró una mayor velocidad de adaptación; la fase exponencial de ésta se encuentra aproximadamente entre este punto y hasta los 360 min, a partir de ese punto y hasta los 615 se encuentra la fase estacionaria (Figura 2).

Figura 2 Curva ajustada de crecimiento de BAL en caldo MRS medido en densidad óptica.  

Como se puede notar en el Cuadro 2, la cepa 1 tiene en promedio un desarrollo más rápido en general (S= 5.4*10^-3); sin embargo, alcanza concentraciones un poco más bajas que las otras. La cepa que mayor DO alcanza es la tres (DO m= 1.14) y es también la más rápido alcanza la fase exponencial (L= 113). Asimismo, los rangos a los que se encuentran cada una de las cepas en sus diferentes fases son prácticamente las mismas.

Cuadro 2 Parámetros de la cinética de crecimiento de tres BAL aisladas de queso panela artesanal genuino mexicano de leche sin pasteurizar de Soyatlán del Oro, Jalisco, con capacidad antagónica contra Salmonella enterica var. Typhimurium. 

DO m= crecimiento máximo; S= tasa de crecimiento; L= adaptación. Medias con diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas α= 0.05.

Las cepas muestran un rápido desarrollo y un crecimiento bastante alto, crecimiento que es explicable ya que fue en condiciones muy cercanas a las idóneas para el desarrollo de esta especie, éstas son una temperatura de 37 ±2 °C, en anaerobiosis y en un medio sintético enriquecido con los nutrientes ideales para su metabolismo. En un medio con características tan complejas como lo es el queso en el que las condiciones no son tan aproximadas a las idóneas para las BAL, la tasa de crecimiento puede ser mucho menos rápida.

Conclusiones

El queso panela de Atengo, Jalisco, contiene alta población de BAL mayor a 1*10⁶ UFC g^-1, las cuales además de conferirle propiedades sensoriales, de conservación, tecnológicas al producto, pueden participar en el control de patógenos como Salmonella enterica var. Typhimurium. De un total de 55 asilamientos bacterianos, 31 resultaron ser BAL de las cuales ocho mostraron efecto inhibitorio leve contra Salmonella enterica var. Typhimurium y tres, efecto más severo. Éstas últimas fueron Leuconostoc spp, y Lactococcus lactis subespecie cremoris, con características de crecimiento que le permiten alcanzar su máximo crecimiento entre 8 y 9 h de incubación que las hace competitivas contra Salmonella enterica var. Typhimurium.

Se debe investigar la función del consorcio de BAL inhibitorias en su conjunto y no solo de forma aislada, para determinar si existe efecto sinérgico que potencialice la inhibición de patógenos.También, al comprobar que había BAL presentes en el queso artesanal con actividad antagónica en contra de un patógeno como salmonella, se aportaron pruebas de que la fermentación acidoláctica, generada por estas, es una alternativa a la pasteurización de la leche del proceso quesero y que debe ser considerada dentro de las normas en México.