Preparación del material experimental

Al inicio del estudio, se caracterizaron las semillas para determinar humedad, la cual, fue de 11.5 a 12%, rango considerado como idóneo para su almacenamiento comercial (^{FAO, 2011}). Posteriormente, con tapete y almohadilla de caucho corrugado y fricción manual, se eliminaron brácteas accesorias del Cs: gluma, lema, palea, ramillas modificadas, según la especie, hasta obtener, al inicio del experimento, 0.5 kg de Cs (Cs Base; CsB) y 100 g cada 60 días (Cs testigo; CsT), de cada especie, las cuales se colocaron en recipientes plásticos con tapa y se almacenaron en condiciones de laboratorio. Para clasificar Cs, se tomó al azar un número considerable de semillas botánicas para medir largo, ancho y grueso (mm de diámetro) con vernier manual y, con ayuda tamices, se separaron; para Buffel y Banderita, las medidas de criba o tamiz fueron 0.5, 0.59 y 0.7 mm para Cs chicos (CsCh), medianos (CsM) y grandes (CsG), respectivamente. Para Navajita y Rhodes, los tamaños de tamices fueron 0.42, 0.5 y 0.59 mm, para CsG, CsM y CsCh, respectivamente.

Una vez clasificadas las Cs, tanto en CsB o como CsT, se seleccionaron aquellas en buen estado y se eliminaron dañadas y ralladas con ayuda de microscopio estereoscópico. Posteriormente, tanto CsB, CsT, diásporas y recipientes plásticos con tapa, se desinfectaron con solución de hipoclorito comercial al 0.6% por 3 min, se enjuagaron con agua destilada y se secaron a la sombra con flujo ligero de aire, durante 24 h, dispuestas sobre papel en mesas de trabajo en condiciones ambientales de laboratorio. Posteriormente, se colocó a los propágulos por especie y en su caso, por tamaño, en recipientes identificados a la sombra, en ambiente seco y fresco.

Posteriormente, de cada tamaño y especie por propágulo, se tomaron 50 semillas en cuatro repeticiones para determinar su viabilidad con la técnica del tetrazolio al 0.1%; para lo cual, los 200 Cs se embebieron en agua destilada durante 10 h y con el microscopio estereoscópico, se disectó cada Cs, de tal modo que las estructuras del embrión fueran expuestas a la solución del tetrazolio. La lectura se realizó 12 h después del contacto con la solución y se evaluaron de acuerdo a la tinción mostrada: rojo intenso a rosa fuerte: viables; rosa pálido a blanco: no viables. El resultado de viabilidad para CsB fue válido para pruebas de germinación en cuatro intervalos de 30 días; en CsT, fue válido para dos intervalos de 60 días y en diásporas, válida para cuatro intervalos de 30 días (^{Andreoli y Vilela, 2007}).

Una vez conocida la viabilidad por tratamiento, se procedió a sembrar cuatro repeticiones de 100 semillas en base a semilla pura viable, ya sea en Cs clasificadas o diásporas. Antes de la siembra, se desinfectaron las charolas plásticas con hipoclorito comercial al 0.6%, durante 3 min y se secaron a la sombra por 3 h. La siembra en Cs clasificadas se realizó en cajas plásticas transparentes con tapa (20*10*7 cm) y con flujo ligero de aire, con la técnica sobre papel filtro humedecido. La siembra de diásporas se realizó en charolas (40*25*10 cm) sin tapa, a 1 cm de profundidad, en peat moss húmedo. Las charolas sembradas con Cs clasificadas y diásporas, se mantuvieron en cámara de ambiente controlado con flujo ligero de aire, 24 h de luz fluorescente a 22 ±2 °C. Se irrigó a las Cs clasificadas cada 24 h, con 8 mL de agua destilada por debajo del papel filtro y, a diásporas, cada 72 h con 100 mL de agua destilada, mediante aspersión.

Establecimiento del experimento y análisis de datos

Se realizaron 16 pruebas de germinación en CsB y diásporas con intervalo de 30 días; mientras que, para CsT, se realizaron ocho pruebas con intervalo de 60 días. En pastos nativos en siembras con Cs, se evaluaron 12 tratamientos (Cuadro 1) en CsB, 6 con la combinación de dos especies (Banderita y Navajita) con tres tamaños de Cs (CsCh, CM y CG) y, por otro lado, seis en CsT con la combinación de dos pastos nativos (Banderita y Navajita) con tres tamaños de Cs, obtenidas cada 60 días. Así mismo, en pastos introducidos, 12 tratamientos en siembras con Cs, seis con CsB con la combinación de dos pastos (Buffel y Rhodes) con tres tamaños de Cs (chicos, medianos y grandes) y seis con CsT, con la combinación de Buffel y Rhodes, con tres tamaños de Cs (chicos, medianos y grandes). Otros tratamientos consistieron Cs envuelta aún con brácteas accesorias o unidades de dispersión completas en dos pastos nativos (Banderita y Navajita) y por otro lado, dos pastos introducidos (Buffel y Rhodes).

La variable de respuesta en siembras con Cs clasificadas fue germinación de plántulas normales, la cual se registró cada 24 h, durante 15 días (^{ISTA, 1996}). En siembras con diásporas, la variable de respuesta fue emergencia de plúmulas y se registró cada 24 h, durante 25 días (^{ISTA, 1996}). Se consideraron plántulas normales aquellas que germinaron con plúmula y radícula, aun con ligeros defectos y, en diásporas, con desarrollo satisfactorio de plúmula (^{ISTA, 2012}). La variable respuesta se modeló usando una variable aleatoria con distribución Bernoulli (p), dado que para cada semilla en prueba solo hay dos resultados posibles (la semilla germina o no germina).

La distribución Bernoulli, depende del parámetro p que en este caso corresponde a la probabilidad de germinación. La probabilidad de germinación puede depender de covariables, en este caso tiempo, beneficio (eliminación de brácteas accesorias) y especie de pasto. El problema se reduce a determinar si las probabilidades de germinación cambian en función de estas covariables. Un modelo ampliamente utilizado para este tipo de problemas es el de regresión logística (^{Hosmer y Lemeshow, 2000}).

Donde: x= vector de covariables (por ejemplo tiempo, tamaño de semillas, Cs, etc.) y β= vector de parámetros desconocidos y corresponden al efecto de las covariables. El modelo de regresión fue ajustado utilizando la rutina logistic del paquete estadístico SAS (^{SAS Institute Inc., 2009}). La bondad de ajuste del modelo se probó mediante la estadística D de Somers ^{(Somers, 1962}). La significancia de los coeficientes de regresión asociados a las covariables se probó al utilizar la prueba de razón de verosomilitudes generalizada y la prueba de Wald (α= 0.05).

Especies nativas

La germinación mostró diferencia entre tratamientos (p< 0.001; Figura 1). Posterior a 16 intervalos de 30 días, la tasa de germinación disminuyó tanto para CsB como CsT en cada tamaño de Cs (CsCh, CsM y CsG). Para pasto Navajita, en CsB (Figura 1a), la germinación disminuyó 39, 26 y 24 (UP) y, la reducción en germinación fue menor en CsT, respecto a CsB (Figura 1b) con 33, 22 y 16 UP, respectivamente. En pasto Banderita, para CsB (Figura 1c), fue de 35, 19 y 4 UP y, en CsT (Figura 1d); similarmente, la pérdida fue menor, con 20, 15 y 7 UP, respectivamente. La germinación de las Cs almacenadas con brácteas accesorias, hasta el momento de su siembra, en CsM y CsG, mantiene mayores niveles de germinación para todas las fechas de siembra en el periodo evaluado.

Figura 1 Germinación observada y predicha de tres tamaños de cariópsides de Bouteloua curtipendula (1a y 1b) y B. gracilis (1c y 1d) durante 16 meses, con intervalo de 30 días y para cariópsides testigo (obtenidos cada dos meses) en laboratorio.CsCh= cariópsides chicas; CsM= cariópsides medianas; CsG= cariópsides grandes.  

Las curvas de germinación predichas por el modelo logístico en pastos nativos a lo largo de 16 pruebas de germinación (Figura 1), indican que la germinación disminuirá en mayor medida, a menor tamaño de Cs, tanto en Navajita como en Banderita, ya sea en CsB o CsT; es decir, a mayor tamaño de Cs es una ventaja al momento de la siembra, por la calidad alcanzada por la semilla. Por tanto, manejar la producción de semilla y el beneficio de la misma con procesos de selección por tamaño de Cs resulta en mayor germinación al momento de la siembra.

En pastos nativos, a medida que se incrementó el tiempo de almacenamiento, se observó menor germinación a menor tamaño de Cs, tanto para CsB como CsT y por especie evaluada. ^{Springer et al. (2001)}, en T. dactyloides, indican que la viabilidad y germinación en Cs de mayor peso y tamaño, es mayor, en comparación a aquella observada en CsCh; de igual modo ^{Pérez et al. (2006)}, en maíz, encontraron que a mayor peso y longitud de semilla, mayor vigor, lo que se refleja en mayor cantidad de materia seca de la parte aérea de plántulas durante los primeros días de establecimiento. Similarmente ^{López- Castañeda et al. (1996)}, en plantas de trigo, demostraron que a mayor peso de Cs se obtienen plantas con mayor peso de raíz y área foliar, lo que puede resultar en mayor sobrevivencia de plántulas ante la sequía intraestival, además de mayor crecimiento inicial; teóricamente, puede incrementar el éxito de establecimiento de plantas en praderas de temporal.

El modelo logístico en pasto Navajita mostró diferencia en germinación entre tamaños de semilla y, las covariables tiempo y beneficio, fueron significativas (p< 0.001; Figura 1a; Figura 1b); similarmente, mostró un coeficiente de ajuste de datos de 83%, dadas las mismas covariables; por otra parte, la germinación de CsG superó a aquella observada para CsCh y CsM en 23 y 2.7 veces, respectivamente. El efecto de beneficiar (liberación de Cs) mejoró la germinación cuatro veces, también el modelo indica la disminución de germinación de una UP cada 30 días. En Banderita, el modelo logró clasificar de manera correcta 75% de los datos, dadas las covariables tiempo y beneficio (Figura 1c y Figura 1d); además, se observó diferencia en germinación entre tamaños y las covariables fueron significativas (p< 0.001). Dadas las covariables mencionadas, al comparar germinación entre tamaños de Cs, la germinación en CsG es 5.7 veces mayor, en comparación a Cch y 1.3 veces mayor, en comparación a CsM. Por otro lado, la germinación de pasto Banderita fue mayor en comparación a pasto Navajita en 1.3 veces (p< 0.001).

Especies introducidas

Contrariamente a lo observado para nativas, la germinación aumentó conforme el tiempo de evaluación, en cada tamaño de Cs (Figura 2), se observaron diferencias entre tratamientos (p< 0.001 ). Para CsB en Buffel (Figura 2a), la germinación (inicial menos final) para Csch, CsM y CsG se incrementó 51, 67 y 66 UP , respectivamente; lo anterior, es indicativo de marcada capacitación del embrión; mientras que, para CsT de Buffel (Figura 2b), la germinación aumentó en 26, 62 y 64 UP para CsCh, CsM y CsG, respectivamente lo cual, es ligeramente menor, en comparación con CsB (p< 0.001). Lo anterior, es indicativo de que en Cs de Buffel no existe diferencia entre beneficiar la semilla al momento de siembra o desde el inicio del experimento, almacenando las Cs en condiciones frescas y secas, como aquellas de laboratorio, en este caso.

Figura 2 Germinación observada y predicha de tres tamaños de cariópsides en Cenchrus ciliaris (2a y 2b) y Chloris gayana (2c y 2d) durante 16 meses, intervalo de 30 días y para cariópsides obtenidos cada dos meses en laboratorio. CsCh= cariópsides chicas; CsM= cariópsides medianas; CsG= cariópsides grandes. 

En Rhodes, la germinación se incrementó al eliminar brácteas accesorias desde el inicio del experimento (CsB; Figura 2c) la cual, para CsCh, CsM y CsG fue 48, 31 y 13 UP mayor, respectivamente, mientras que, en CsT (Figura 2d), la germinación también se incrementó para CsCh, CsM y CsG, en 42, 20 y 7 UP, respectivamente. Por tanto, mayor germinación ocurrió en CsB en los tres tamaños de Cs, tanto en Buffel como en Rhodes; sin embargo, a mayor tiempo de almacenamiento tanto Buffel como Rhodes, los CsT pierden latencia y, al final de las pruebas de germinación, la cantidad de plántulas normales es ligeramente menor, en comparación a aquellas observadas para CsB. Contrariamente a las otras tres especies evaluadas, en Rhodes, se observó mayor germinación en CsB y CsT a menor tamaño de Cs; lo anterior, puede ser informativo sobre la capacidad de Rhodes para consolidar semilla viable a pesar de las condiciones de estrés que pudiera enfrentar el cultivo en la fase reproductiva, durante la fase de campo en producción de semilla.

Se observó mayor germinación a mayor tiempo de almacenamiento en pastos introducidos y cuando se eliminaron las brácteas accesorias al inicio del experimento (CsB), la germinación aumentó (^{Tian et al., 2002}); lo anterior, es indicativo de la existencia de inhibidores de germinación en el embrión (^{Simpson, 1990}); además, las brácteas accesorias son una barrera hidrofóbica donde la lignina, polisacáridos y pectinas fenólicas contribuyen a determinar el carácter impermeable de la cubierta seminal e impiden la difusión de agua para la imbibición (^{Castillo y Guenni, 2001}) y a mayor tiempo de almacenamiento (mayor a 18 meses), la dormancia secundaria disminuye en pastos como Buffel (^{Butler, 1985}).

La eliminación de brácteas accesorias ha sido evaluado por ^{Anderson (1985)}, en T. dactyloides, donde obtuvo semilla y posteriormente la escarificó de manera física con tapete y almohadilla de caucho corrugado y encontró que se incrementó la germinación de 5 a 40% y de 10 a 90%. En el presente estudio, eliminar brácteas accesorias incrementó la germinación, lo que es conveniente cuando se conjuntan buenas condiciones de siembra (agronómicas y climáticas), ya que las plántulas maximizarían el uso de humedad para llegar a edad adulta y evitar exponerse a rápida evaporación durante la sequía interestival, además de desarrollar estructuras de fotosíntesis y asimilación eficiente de nutrientes para la posible competencia con maleza de mayor tamaño y capacidad de crecimiento (Zhuang et al., 2010).

Eliminar brácteas accesorias y clasificar Cs en pastos nativos tuvo marcadas diferencias, en Cs T, la germinación a intervalo de 30 días para Cs Ch, CsM y CsG, en Navajita fue 58, 73 y 82% y para Banderita 62, 82 y 91%, respectivamente; mientras que, la emergencia al sembrar a intervalos de 30 días fue 78% y en Banderita, 87%. ^{Tian et al. (2002)}, en T. dactyloides variedad Pete, encontraron, a 14 días pos siembra, mayor germinación al escarificar Cs (80%), contrastando con Cs sin escarificar (8%) y diásporas (2%). La pobre germinación en Cs chicos en pastos nativos está relacionada con bajo vigor (^{Culleton et al., 1991}); mientras que, en introducidos, éste se asoció con latencia de semilla. Por tanto, para siembras en campo ^{Ellis y Roberts (1980)}, ^{Naylor (1982)}, ^{Larsen y Bibby (2004)}, mencionan que el proceso de producción, cosecha, almacenamiento y beneficio de semilla son importantes para mantener la mejor calidad biológica de ésta y lograr mayor cantidad de plántulas por m² ya establecidas en campo.

En pastos introducidos, el análisis con el modelo de regresión logística indicó diferencias en germinación entre tamaños de Cs, las covariables tiempo y beneficio fueron significativas (p< 0.001) y la germinación de plántulas normales es mayor, conforme avanza el tiempo de almacenamiento (^{Butler, 1985}). En Buffel, el modelo logra clasificar de manera correcta 75% de los datos, dadas las covariables tiempo y beneficio, la germinación incrementa en 2.2 veces cuando se eliminan brácteas accesorias y se incrementa 1.2 veces cada 30 días. Así mismo en Buffel, al comparar la germinación entre tamaños de Cs, el CsG mostró 1.8 y 1.5 veces mayor germinación en comparación a Cch vs CsM, respectivamente. En Rhodes, el modelo logra explicar 82% del comportamiento de los datos en las curvas de germinación dadas las covariables tiempo y beneficio, la germinación incrementó 6.5 veces al eliminar brácteas accesorias e incrementa 1.1 veces cada 30 días. La germinación de CsG, comparada con Csch y CsM fue 16 y 2.7 veces mayor; por tanto, a mayor tamaño de Cs, mayor germinación. La germinación observada para Rhodes fue 1.4 veces mayor en comparación a aquella observada en Buffel.

Las curvas de germinación predichas por el modelo logístico a lo largo de 16 intervalos (Figura 2a, 2d), indican que la germinación aumentó a mayor tamaño de Cs tanto en Buffel como en Rhodes y al último intervalo de haber evaluado la semilla, se presenta la mayor germinación en ambos pastos; sin embargo, de acuerdo a las curvas de germinación predicha para ambas especies, las curvas probables de germinación disminuirán.

Emergencia en diásporas

En especies nativas hubo diferencias en emergencia (Figura 3a); la cual disminuyó al avanzar el tiempo de almacenamiento (p< 0.001); en Navajita, disminuyó seis UP y en Banderita, 10 UP. La emergencia de Banderita fue 2.6 veces más, en comparación a aquella de Navajita. Al respecto ^{Simpson (1990)} y ^{FAO (2011)}, mencionan que a mayor tiempo de almacenamiento de semillas en general la germinación se ve afectada y mayor cantidad de plántulas anormales germinarán. En pastos introducidos (Figura 3b), se observó diferencia en emergencia (p< 0.001) y una pendiente positiva, al avanzar el tiempo de almacenamiento (p< 0.001); Buffel aumentó 38 UP y Rhodes, 43 UP. La emergencia de Rhodes fue 1.9 veces mayor en comparación a aquella de Buffel, ^{Harty et al. (1983)}, en Panicum máximum y ^{Butler (1985)}, en Buffel mencionan que la germinación en pastos con latencia, la germinación aumenta posterior a cuatro meses de almacenamiento, en Panicum spp., posterior a 12 meses y en Buffel, posterior a 18 meses.

Figura 3 Emergencia observada y predicha de semilla con brácteas accesorias, en Bouteloua curtipendula (3a) y B. gracilis (3a);así como en Cenchrus ciliaris (3b) cv. Común y Chloris gayana cv. Bell (3b), a lo largo de 16 pruebas con intervalos de 30 días en laboratorio.  

En pastos nativos, el modelo logró clasificar 63% de cada uno de los casos de semilla como emergida o no y en introducidos, el modelo logístico ajusto apropiadamente, 80% de cada uno de los casos de semilla como germinada o no. Las curvas de germinación predichas en pastos nativos disminuyen en poca medida, lo que indica que la viabilidad de la semilla botánica se conserva cuando se almacena con brácteas accesorias, mientras que, en pastos introducidos las curvas de emergencia indican que la latencia impuesta, tanto por el embrión como por brácteas accesorias, es menor conforme avanza el tiempo de almacenamiento i.e. ocurre una capacitación para la germinación.