Introducción

Durante la germinación se activan vías metabólicas y de transducción de señales que conducen a la expansión, división y diferenciación celular (^{Tnani et al., 2012}). Los niveles de azúcares y almidón en la semilla deben estar regulados para asegurar un buen aporte de biomoléculas y energía al embrión y controlar la distribución de agua en los tejidos en expansión. Los micronutrientes que escapan de la semilla durante la imbibición son reabsorbidos y su movilización depende de la tasa de crecimiento de la plántula, solubilidad de los mismos y concentración de estos en la solución que rodea a la semilla (^{Melo et al., 2009}). La presencia de compuestos en la cubierta de la semilla, como los flavonoides, disminuyen la pérdida de solutos, son una barrera contra hongos y tienen efecto antimicrobiano (^{Angelovici et al., 2010}).

El tamaño de semilla puede ser uno de los factores que controla la eficiencia de la germinación. De acuerdo con ^{Limami et al. (2002)}, las líneas de maíz con menor tamaño de semilla tienen mayor eficiencia de germinación; las semillas de mayor tamaño producen plántulas más grandes, capaces de emerger a mayor profundidad de siembra y tienen una tasa mayor de crecimiento de la radícula. La síntesis de novo de proteasas e hidrolasas de pared celular es requerida para la protrusión de la radícula (^{Dogra et al., 2013}); otros eventos, como la oxidación de puentes disulfuro de enzimas, ya presentes en la semilla, pueden ser importantes para la regulación metabólica durante la germinación.

Se han detectado modificaciones postraduccionales en las proteínas durante la germinación, como oxidación, desaminación, acetilación e isoformas truncas (^{Angelovici et al., 2010}; ^{Tnani et al., 2012}). Un incremento en giberelinas e isopentenil adenina se ha correlacionado con el inicio de la absorción de agua. Después de la imbibición y la percepción de giberelinas, muchas enzimas se activan y degradan el endospermo almidonoso, cuyos productos son absorbidos por el escutelo (^{Preston et al., 2009}).

Las semillas de maíz que tardan más en germinar tienden a producir un mayor número de plántulas anormales. El deterioro de la semilla provoca un retraso en la germinación en diferentes procesos, desde la imbibición y primeros signos de germinación, hasta el estadio de la cuarta hoja (^{Khajeh-Hosseini et al., 2009}). En la fase de desecación de la semilla se acumulan azúcares como sacarosa, rafinosa, galactinol, trehalosa, intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, algunos aminoácidos y ácidos grasos libres (^{Angelovici et al., 2010}). En las células existen moléculas como azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, que incluyen al ácido málico, cítrico y succínico.

Las concentraciones en que se les encuentra no permiten considerarlos sólo como intermediarios de las vías metabólicas. La propuesta es que forman un medio distinto al acuoso y al lipídico, que son los dos medios considerados en la célula (^{Choi et al., 2011}). Los ácidos orgánicos son metabolizados mediante el ciclo de Krebs (respiración), gluconeogénesis, fermentación a etanol, síntesis/interconversión de aminoácidos y como sustrato para la producción de metabolitos secundarios, tales como pigmentos (^{Famiani et al., 2015}). Se ha reportado que el tratamiento con microondas mejora la germinación, aumenta la tasa de imbibición y se promueve la redistribución del agua de las células de las semillas (^{Anand et al., 2008}).

En esta investigación se evaluó el efecto del osmoacondicionamiento sobre la germinación, vigor, proteínas de reserva, patrones electroforéticos y acidez titulable de la semilla de un maíz tipo palomero, dado que se ha recomendado este tratamiento para semillas que se sembrarán bajo condiciones de estrés como bajas temperaturas, escasez o exceso de agua (^{Finch-Savage et al., 2004}).

Materiales y métodos

El material genético que se utilizó en esta investigación fue un maíz tipo Palomero, que se adquirió en el mercado local. Se ensayaron cuatro tratamientos, polietilenglicol 8 000 al 30% (P/V) (^{Tiryaki y Buyukcingil, 2009}) y de nitrato de potasio al 3% (P/V) más de ácido giberélico (RaliGeb^MR) al 0.01% (P/V); ambas soluciones se usaron durante la imbibición de la semilla a 6 y 12 horas. Se registró el peso inicial de cada muestra y se agregaron 25 ml de la solución correspondiente. Se realizaron 4 repeticiones de 25 semillas cada una. Después del tratamiento, las semillas se colocaron en toallas de papel para escurrirlas y se registró el peso final, esto para calcular tasa de imbibición. Se colocaron las semillas en cajas Petri y se sometieron a secado durante siete días a temperatura ambiente.

Se registró el peso al final del periodo de secado. Para la prueba de germinación se usó Captán al 1% y se sumergieron las semillas durante 5 min (^{ISTA, 2005}). Como testigo se usó semilla no osmoacondicionada. Prueba de remojo (Soak test): se colocaron 25 semillas en un recipiente de plástico de 250 mL con agua a temperatura de 25 °C durante 24 h. Estas ya habían sido sometidas al osmoacondicionamiento, excepto en el caso de las semillas testigo. Se sumergieron en Captán al 1% durante 5 min y se hicieron cuatro repeticiones de 25 semillas para la prueba de germinación. Se tomaron cuatro plántulas por repetición y tratamiento y se midió la longitud de plúmula y radícula, así como el peso de cada una al cuarto y séptimo día. La prueba de vigor (longitud media de plúmula y radícula), se llevó a cabo conforme al método descrito por ^{Moreno (1984)}.

Se realizó en la cámara de germinación a 25 °C con 4 repeticiones con 25 semillas por tratamiento. Se tomaron 10 plántulas por repetición para peso fresco; se secaron en estufa a 80 °C durante 48 h para determinar peso seco. Extracción de proteína. Se molieron finamente 10 semillas por tratamiento y se tomaron 0.25 g de harina a la que se le agregó 1.5 ml de amortiguador de extracción pH 7.5 que contenía 250 mM de cloruro de sodio, fosfato de potasio 50 mM y 0.03% de ditiotreitol. Se mezclaron e incubaron en baño María a 80 °C durante un min, se enfriaron y refrigeraron a 5 °C durante 24 h. Se centrifugó a 13 000 x g en la microfuga (Eppendorf^MR) durante 15 min, se tomó el sobrenadante y se agregó glicerol para obtener una concentración de 10% y se congelaron a -20 °C hasta su uso. La cuantificación de proteína se llevó a cabo con un equipo Nanodrop Modelo 2000 C mediante el método de ^{Bradford (1976)}. Para acidez titulable se tomaron 2 g de muestra de harina y se añadió una relación 1:4 harina/agua destilada; se tituló con una solución de hidróxido de sodio al 0.1 N (Karal^®).

La acidez en la muestra, expresada como ácido málico, se calcula con la siguiente fórmula: acidez g L^-1 (ácido málico) = (V*N*67)/M, en donde: V= volumen de solución de hidróxido de sodio 0.1 N gastado en la titulación de la muestra, en mL. N= normalidad de la solución de hidróxido de sodio. M= volumen de la muestra, en mL. 67= equivalente del ácido málico. Los patrones electroforéticos se obtuvieron por triplicado usando el método de ^{Schagger y von Jagow (1987)}. La evaluación de las pruebas de germinación estándar, vigor (longitud de plúmula), remojo (soak test) y acidez titulable se hicieron mediante un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones; los Anovas y la comparación de medias se realizaron mediante el programa SAS 9.0.

Resultados y discusión

Prueba de germinación. En el Cuadro 1 se muestra el análisis de varianza para la variable germinación, donde se observó que hubo diferencias altamente significativas entre tratamientos para plántulas normales del primer conteo, la cual define la velocidad de emergencia. En el segundo conteo, el porcentaje de plántulas anormales, semillas duras y tasa de imbibición también mostraron diferencias altamente significativas entre tratamientos; al menos un tratamiento produce efectos diferentes. Los coeficientes de variación son aceptables debido a la variación que expresan estos caracteres entre el primero y segundo conteos.

^*, ^** = indica significancia estadística al nivel 0.05 y 0.01 de probabilidad, respectivamente; ns= indica no significativo; Trat= tratamiento; NOR= semillas normales; MUER=semillas muertas; ANOR= semillas anormales; DRS= semillas duras y TI= tasa de imbibición.

Cuadro 1 Cuadrados medios, grados de libertad y coeficiente de variación del ANOVA para la prueba de germinación en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato.  

En la comparación de medias (Cuadro 2), el testigo y el tratamiento con nitrato 12 h fueron estadísticamente iguales en el porcentaje de germinación, pero en los otros tratamientos el porcentaje de germinación bajó y la diferencia resultó estadísticamente significativa. La absorción de agua fue mayor en el tratamiento con nitrato a 6 h y fue estadísticamente diferente a los otros tratamientos. Los tratamientos PEG a 6 y 12 h y el tratamiento con KNO₃+AG₃ a 6 h de imbibición fueron estadísticamente iguales y se encuentran por debajo de 84% de germinación de la muestra testigo. El valor de KNO₃+AG a 12 h de imbibición fue estadísticamente igual al testigo; entre los pretratamientos, la irradiación con microondas con una dosis de energía baja mejora la germinación; dosis altas dañan la semilla (^{Anand et al., 2008}).

Medias con la misma letra dentro de cada variable son estadísticamente iguales, con base en la comparación de medias con DMS (p< 0.05). NOR= semillas normales; MUER= semillas muertas; ANOR= semillas anormales; DRS= semillas duras y TI= tasa de imbibición.

Cuadro 2 Comparación de medias mediante la prueba DMS (p< 0.05) para la variable germinación en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato.  

La mayoría de los resultados señalan un efecto positivo del osmoacondicionamiento, promoviendo una germinación más rápida y sincronizada (^{Moosavi et al., 2009}), algo también observado en otros resultados con otros materiales genéticos de maíces nativos. ^{Méndez et al. (2008)} también obtuvieron porcentajes muy bajos de germinación en semilla de maíz pretratada con PEG 4000.

El tratamiento con PEG a 6 h de imbibición, en el primer conteo, generó mayor porcentaje de plántulas anormales (15%) que es muy similar al PEG a 12 h (12%); estos tratamientos son los que dieron el mayor porcentaje de plántulas anormales. El tratamiento con KNO₃+AG₃ a 12 h (1%) fue similar al testigo (4%). Ningún tratamiento fue superior al testigo para las variables semillas muertas y semillas duras. Los tratamientos de osmoacondicionamiento tuvieron una mayor tasa de imbibición respecto al testigo, lo cual no se vio reflejado en el porcentaje de germinación estos resultados concuerdan con ^{Méndez et al. (2008)} quienes no encontraron relación entre la tasa de imbibición y los porcentajes de germinación. El Palomero es considerado una raza antigua, por lo que podría necesitar un tratamiento más profundo o prolongado para germinar, como las semillas en la naturaleza (^{Preston et al., 2009}); no obstante, se puede recomendar el tratamiento con KNO₃+AG₃12 h antes de la siembra, para mejorar su comportamiento.

Prueba de remojo

El análisis de varianza para esta variable se muestra en el Cuadro 3, hubo diferencias significativas en el porcentaje de semillas muertas. Se observó diferencias altamente significativas en la tasa de imbibición (TI1) en el segundo conteo; al menos un tratamiento fue diferente. Los coeficientes de variación fueron buenos, lo cual nos indica que el experimento fue bien conducido.

^* , ^** = indica significancia estadística al nivel 0.05 y 0.01 de probabilidad, respectivamente; ns= indica no significativo; Trat= tratamiento; NOR= semillas normales; MUER=semillas muertas; ANOR= semillas anormales; DRS= semillas duras y TI= tasa de imbibición.

Cuadro 3 Cuadrados medios, grados de libertad y coeficiente de variación del Anava para prueba de remojo en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato.  

En la comparación de medias (Cuadro 4), todos los tratamientos excepto PEG 6 h, dieron menor porcentaje de semillas muertas, respecto al testigo, lo cual es positivo. En la tasa de imbibición, todos los tratamientos de osmoacondicionamiento tuvieron mayor tasa de imbibición respecto al testigo, sin que se viera reflejado en el porcentaje de germinación, resultado que concuerda con ^{Méndez et al. (2008)}. Es posible que en condiciones de campo la mayor tasa de imbibición pudiera significar una ventaja para las semillas pues el endospermo toma más tiempo para hidratarse que el embirón (^{Finch-Savage et al., 2004}).

Valores con la misma letra dentro de columnas, son estadísticamente iguales con base en la comparación de medias con DMS= 0.05; MUER= semillas muertas (primer conteo); TI= tasa de imbibición (segundo conteo).

Cuadro 4 Comparación de medias de la prueba de remojo en maíz tipo palomero Roque, Guanajuato.  

El análisis de varianza para las variables longitud de radícula y plúmula (Cuadro 5) mostró diferencias significativas en todos sus componentes; hubo diferencias altamente significativas para longitud de plúmula en primer y segundo conteo y longitud de raíz en el segundo conteo; fue significativa para longitud de raíz en el primer conteo y para peso total de plántula en el primer y segundo conteo. El efecto del osmoacondicionamiento para estas variables se manifestó desde el primer conteo. Esto concuerda con lo encontrado por ^{Zhang et al., (2015)} respecto a que el osmoacondicionamiento incrementa el índice de germinación y el de vigor.

^*, ^**= indica significancia estadística al nivel 0.05 y 0.01 de probabilidad, respectivamente; LP= longitud de plúmula; LR= longitud de radícula y PT= peso total de la plántula.

Cuadro 5 Cuadrados medios, grados de libertad y coeficiente de variación del ANOVA para longitud de radícula y plúmula del primer y segundo conteo de la prueba de remojo en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato.  

En general no hubo efecto de los tratamientos sobre el peso total de plántula, comparados con el testigo (Cuadro 6), en cuanto a la variable longitud de plántula, todos los tratamientos fueron superiores al testigo; para longitud de radícula destacan los tratamientos con PEG a 6 y 12 h en ambos conteos y fueron superiores al testigo. Los tratamientos con PEG son los que dieron mejor resultado para longitud de plúmula y de radícula (Cuadro 6). En México se tiene la costumbre de sembrar maíz a gran profundidad, para asegurar la emergencia en suelo bien húmedo, esta práctica podría verse favorecida por el osmoacondicionamiento.

Medias de tratamiento con la misma letra dentro de cada variable son estadísticamente iguales, con base en la comparación de medias con DMS (p< 0.05); TRAT= tratamientos; LP= longitud de plúmula; LR= longitud de radícula y PT= peso total de la plántula.

Cuadro 6 Comparación de medias mediante la prueba DMS (p< 0.05) para la variable longitud de plúmula en tratamiento de remojo primer y segundo conteo en maíz palomero. Roque, Guanajuato.  

En el Cuadro 7 se muestra el ANOVA para contenido de proteína en la semilla y sus componentes. Hubo significancia estadística entre tratamientos para las tres características.

^*, ^** = significativo al 0.05 y 0.01 de probabilidad; ns= no significativo.

Cuadro 7 Cuadrados medios, grados de libertad y coeficiente de variación del ANOVA para contenido proteico por el método de Bradford en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato.  

Los coeficientes de variación fueron buenos. Los tratamientos con KNO₃ fueron superiores al testigo y a los otros tratamientos esto podría deberse a la mayor disponibilidad de proteína soluble para el embrión cuando se inicia el proceso de germinación; dado que el PEG tiene un efecto sobre la disponibilidad de agua, hay menor cantidad disponible para la semilla por el efecto osmótico (^{Moosavi et al., 2009}), lo que explicaría que en estos tratamientos no se incremente la proteína extraída (Cuadro 8), en endospermo los tratamientos en general fueron superiores al testigo, dado que la proteína de esta estructura es la primera en ser movilizada, explicaría en parte, el efecto positivo del osmoacondicionamiento. En embrión se observa una disminución en el contenido de proteína en los tratamientos a 12 h, lo cual se podría deber a la utilización de estas para la generación de aminoácidos y síntesis de nuevas proteínas. ^{Zhang et al. (2015)} hallaron un incremento en proteínas solubles y aminoácidos libres en semillas osmoacondicionadas; también hallaron que se activan genes relacionados con la degradación de péptidos y proteínas. Determinaciones llevadas a cabo por ^{Narváez-González et al. (2006)} muestran que el contenido de proteína total entre variedades nativas es muy semejante (8.8-9.5% en el caso del palomero).

Medias de tratamiento con la misma letra dentro de cada variable son estadísticamente iguales con base en la comparación de medias con DMS (p< 0.05).

Cuadro 8 Comparación de medias mediante la prueba DMS (p< 0.05) para contenido de proteína mediante el método de Bradford en maíz tipo Palomero. Roque, Guanajuato.  

Hubo diferencias entre tratamientos para acidez titulable en el embrión y el endospermo solamente (Cuadro 9), los tratamientos de osmoacondicionamiento redujeron la acidez titulable en el embrión, respecto al testigo, lo cual indica un cambio en el conjunto de moléculas de bajo peso molecular. Ya que es el embrión la parte viva de la semilla y el que dirige los cambios que se dan en toda ella al momento del inicio de la germinación, estos cambios se operarían primero en el propio embrión (Cuadro 10). Se han documentado diferencias en la distribución del agua dentro de la semilla, lo cual tendría efecto sobre las actividades metabólicas (^{Anand et al., 2008}).

^*, ^**= significativo al 0.05 y 0.01 de probabilidad; ns = no significativo.

Cuadro 9 Cuadrados medios, grados de libertad y coeficiente de variación del ANOVA para acidez titulable en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato. 

Medias de tratamiento con la misma letra dentro de cada variable son estadísticamente iguales, con base en la comparación de medias con DMS (p<0.05)

Cuadro 10 Comparación de medias mediante la prueba DMS (p< 0.05) para acidez titulable en maíz tipo palomero. Roque, Guanajuato. 

Por encima del marcador de masa molecular de 66.2 kDa se señala una banda (flecha carril 4 Figura 1) que aparece en los tratamientos pero no en el testigo. Por debajo de este marcador (66.2) se señala una banda (flecha carril 4) y otra en el carril 5 que no se aprecian en el testigo. En el carril 3 por encima del marcador de 31 kDa una banda, señalada con flecha en el carril 5 no se aprecia. En el carril 4 se nota una banda en el fondo del gel, que no aparece en los demás carriles (Figura 1). Los tratamientos provocaron alteraciones no muy notorias en los patrones electroforéticos de la semilla.

Figura 1 Patrón electroforético de proteínas de maíz tipo palomero en semilla completa. Carril 1, marcadores de peso molecular (MPM); carril 2 testigo; carril 3 PEG 6 h; carril 4 PEG 12 h; carril 5 KNO₃ 6 h; carril 6 KNO₃ 12 h.  

En la Figura 2 entre el marcador de 97.4 y 66.2 kDa carril 4 se señala con flecha una banda presente en los tratamientos pero no en el testigo. Por debajo de este marcador, 66.2 kDa, se señala una banda que no está en el testigo pero si en los tratamientos de osmoacondicionamiento. En semillas de Brassica napus en la fase de secado, luego del tratamiento de osmoacondicionamiento, solo se observó una disminución en la abundancia de la cruciferina (^{Kubala et al., 2015}).

Figura 2 Patrón electroforético de maíz tipo palomero en proteína del embrión. Carril 1, marcadores de peso molecular (MPM); carril 2 vacío; carril 3 testigo; carril 4 PEG 6 h; carril 5 PEG 12 h; carril 6 KNO₃ 6 h; carril 7 KNO₃ 12 h.  

En la Figura 3 carril 6 se señala una banda casi a la altura del marcador de 66.2 kDa, que se observa en este tratamiento, pero no en los demás, incluido el testigo. En esta misma figura se observa que el frente del carril del testigo se va más abajo con respecto a los tratamientos, esto podría deberse a que las proteínas sufrieron modificaciones o incluso cortes que dan por resultado péptidos o proteínas de menor masa molecular.

Figura 3 Patrón electroforético de maíz tipo palomero en proteína de endospermo. Carril 1, marcadores de peso molecular (MPM); carril 2 vacío; carril 3 testigo; carril 4 PEG 6 h; carril 5 PEG 12 h; carril 6 KNO₃ 6 h; carril 7 KNO₃ 12 h.  

Las proteasas halladas en trigo se propone que estarían involucradas en el crecimiento de la radícula y la plántula durante la germinación y proteasas e hidrolasas de pared celular son requeridas para la protrusión de la radícula (^{Tamura et al., 2007}; ^{Dogra et al., 2013}).

Conclusiones

Sólo el tratamiento KNO₃ 12 h no tuvo un efecto negativo sobre la germinación con respecto al testigo en plántulas normales y anormales en el primer conteo. Para el segundo conteo ya no se observaron estas diferencias. Como se mencionó antes, es probable que en campo se puedan apreciar mejor los efectos del osmoacondicionamiento, pues aunque es de valor, la prueba de germinación en laboratorio es limitada.

En la prueba de remojo (soak test) no se observaron diferencias entre el testigo y los tratamientos de osmoacondicionamiento; esto indica que el maíz tipo palomero es resistente a la inmersión en agua (soak test), bajo las condiciones probadas. Cuando se usa el riego rodado para la siembra es común que se inunde el campo y la semilla se someta a hipoxia, esto nos permite señalar que aún bajo esas condiciones el Palomero tendría una buena emergencia.

No hubo efecto de tratamientos de osmoacondicionamiento sobre el peso total de plántula, comparados con el testigo; en la variable longitud de plántula, todos los tratamientos fueron superiores al testigo; para longitud de radícula destacan los tratamientos con PEG a 6 y 12 h en ambos conteos y fueron superiores al testigo. Un mayor alargamiento de la plántula puede permitirle alcanzar la luz y, por lo tanto, la autotrofía; la mayor longitud de raíz le permitiría llegar a la zona húmeda del suelo.

Los tratamientos con KNO₃ incrementaron la cantidad de proteína que se extrae de semilla completa. En el endospermo en general, se observó un incremento en la proteína extraída respecto al testigo.

Hubo diferencias entre tratamientos para acidez titulable en el embrión y el endospermo solamente. Los cambios en el estado de la semilla han sido estudiados; la redistribución del agua y el cambio de fases en la membrana permiten a la semilla germinar y establecerse; el osmoacondicionamiento parece darle ventajas en este sentido.

Se lograron obtener los patrones electroforéticos y se observaron cambios en las semillas osmoacondicionadas respecto al testigo. Otros autores han reportado cambios en las proteínas; es deseable profundizar en esto para tratar de identificarlas y conocer su función, así como si hay una correspondencia entre la cantidad de proteína, su actividad y la cantidad de transcrito.