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Introducción
Cedrus atlantica es una especie arbórea perteneciente a la familia Pinacea conocido como el verdadero cedro. La planta se introdujo a México como una planta ornamental. El árbol puede alcanzar 30 a 40 m de altura (Pijut, 2000), su madera posee características excelentes para ser usada en la construcción, la artesanía y la industria. El aceite esencial de ésta planta tiene actividad antifúngica contra Penicilluim digitatum (Chebli et al., 2004), antimicrobiana contra Acinetobacter baumannii, Aeromonas veronii, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Escherichia coli y citotóxica contra diversas líneas de cáncer (Barrero et al., 2005).
La propagación de C. atlantica se realiza por semillas; sin embargo, la producción de semillas es irregular y las semillas son escasas. Una alternativa para multiplicar especies arbóreas de difícil reproducción es el empleo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales. Las características que presenta el cultivo in vitro para la multiplicación de plantas son: a) el uso de pequeños segmentos de la planta, que son el punto de partida para el inicio del cultivo; b) se obtiene un gran número de plántulas en corto tiempo y con características fenótipicas y genótipicas similares a la planta madre; c) el crecimiento es continuo a lo largo del año y no se ve afectado por variaciones climáticas; d) se requiere poco espacio y mantenimiento para la propagación que los métodos tradicionales; y e) se asegura la calidad sanitaria de las plantas (Evans, 2003).
Los sistemas de propagación de plantas in vitro han sido utilizados exitosamente para la multiplicación de varias especies ornamentales, pero su aplicación en especies arbóreas está limitada, debido a los problemas de oxidación que se presenta en los explantes; por lo que se requiere implementar los protocolos para la desinfección y multiplicación de las plantas (Orellana, 1998). Particularmente, para la familia Pinaceae existen antecedentes del empleo de estas técnicas para la propagación de algunas especies como: Pinus maximartinezii (Zacarias et al., 2006; Paz et al., 2009), Pinus pseudostrobus y Pinus jaliscana (Rebolledo et al., 2006); Pinus roxburghii (Arya et al., 2000); Picea chihuahuana (López et al., 2000), pero solo se documenta la propagación in vitro de Cedrus deodara (Rebolledo et al., 2006).
En los reportes anteriores, se documenta que la vía de micropropagación es por organogénesis, con tasas de multiplicación de 3 hasta 29 brotes por explante, además es frecuente el uso de agentes antioxidantes para evitar la oxidación de los tejidos, como es el empleó del ácido ascórbico y carbón activado. También se reporta que es posible obtener embriogénesis en cultivos de Pinus cubensis (Cantillo et al 2011); sin embargo, aunque se obtiene callo embriogénico y embriones en estadios de desarrollo I y II, no se logró completar el proceso de propagación.
Lo estudios anteriores, muestran que es factible técnicamente obtener plantas in vitro principalmente del género Pinus, sin embargo para Cedrus atlantica, no se reportan cultivos in vitro. Por lo que en este trabajo se planteó como objetivo, implementar un protocolo para el establecimiento del cultivo in vitro de Cedrus atlantica y su multiplicación por medio de brotes adventicios que sirvan para la micropropagación de esta especie.
Materiales y métodos
Material vegetal
Plantas de C. atlantica de 50 cm de altura fueron proporcionados por el Vivero el Solitario de Cuautla, Morelos, México. Estas plantas se mantuvieron en cuarentena en el vivero del CEPROBI-IPN en Yautepec, estado de Morelos, México. A las plantas se les aplicó una solución antifúngica y bactericida cada dos días, durante 15 días. La solución contenía Agrimycin® 1.5 g L-1 y Benlate® 0.8 g L-1.
Establecimiento del cultivo axénico
La desinfestación del material vegetal de C. atlantica, se realizo por la metodología reportada para Pinus pseudostrobus y Pinus jaliscana (Rebolledo et al., 2011). La cual consistió en utilizar 80 explantes de la planta formados por segmentos de yemas axilares de 1 cm. El material fue lavado en agua jabonosa durante 15 min; los explantes fueron tratados con alcohol etílico al 50% durante 30 segundos y tres enjuagues con agua destilada estéril. Después los explantes se sumergieron en hipoclorito de sodio grado reactivo (Hycel, HY57011019000) al 10% v/v durante 15 min, con una gota de Tween 20. Los explantes se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril.
El medio de cultivo utilizado para la siembra de los explantes fue el medio basal McCown’s Woody Plant WPM (McCown y Lloyd, 1981), suplementado con 2.7 g L-1 de phytagel. El pH del medio se ajustó a 5.7 y se sirvió en frascos tipo Gerber, con 30 mL de medio. El material se esterilizó en una autoclave a 120 ºC y 15 libras durante 20 min. En total se sembraron 25 frascos, cada uno con 3 explantes. Los cultivos se incubaron a una temperatura de 25 ± 3 oC, con un fotoperíodo de 16 h luz: 8 h oscuridad, con una intensidad lumínica de 11.14 µmol m-2 s-1. Después de 5 días de cultivo, se realizó la determinación del porcentaje de contaminación: considerando la relación de explantes contaminados entre el total de explantes sembrados. Además se documentó la frecuencia de oxidación en los explantes.
Inducción de brotación multiple
Para inducir brotación múltiple, se utilizaron las yemas apicales obtenidas después del proceso de desinfestación. Los explantes se inocularon en el medio de cultivo WPM suplementado con sacarosa al 3%, carbón activado 1 g L-1 y cisteína 25 mg L-1, con phytagel 2.7 g L-1. Se ensayó el efecto de la citocinina bencil amino purina (BAP) en concentraciones de 3 y 5 mg L-1. Se sembraron tres explantes por frasco con tres repeticiones por tratamiento. Después de 21 días, se midió los parámetros morfométricos: crecimiento del explante y número de brotes.
Resultados y discusión
Desinfección y establecimiento in vitro
El tratamiento de desinfestación en los explantes de yemas apicales de C. atlantica utilizando en este trabajo con hipoclorito de sodio y alcohol, permitió obtener 83% de explantes sin contaminación, solo 17% de los explantes presentaron contaminación por hongos después del 5º día (Figura 1). En las yemas apicales sin contaminación no se presentó oxidación y solamente los explantes contaminados presentaron oxidación. En la Figura 1 se observa la planta madre de C. atlantica utilizada, así como las diferentes etapas del establecimiento del cultivo.
Figura 1 Establecimiento del cultivo in vitro de Cedrus atlantica: planta madre (a) explantes de yemas apicales; (b) cultivos in vitro sin contaminación; y (c) cultivos contaminados por hongos (d).
El método de desinfestación de las yemas apicales de C. atlantica puede considerarse satisfactorio, considerando que el tejido no presentó daño y que el porcentaje de contaminación fue del 17 %. Este resultado es consistente con el reportado por Rebolledo et al (2006), quienes ensayaron los mismos agentes desinfestantes y tiempos de inmersión pero en semillas de Pinus jaliscana y Pinus pseudostrobus. Para otras especies de Pinus también se reporta el uso de otros agentes desinfectantes con los que se obtienen resultados satisfactorios como es el cloruro de mercurio (Tamta y Palmi 2004; Oliveira et al., 2011) y el peróxido de hidrógeno (Arya et al., 2000; Zacarias et al., 2006; Robledo et al., 2009).
En la micropropagación de especies leñosas, uno de los factores que limita el desarrollo de la técnica es el corte o la lesión de los tejidos, ya que se genera la oxidación de los mismos. Por tal motivo, durante el establecimiento de sus cultivos in vitro uno de los aspectos a controlar es el desarrollo del proceso de oxidación. La elección de un medio de cultivo adecuado y el uso de agentes antioxidantes son dos consideraciones importantes para la sobrevivencia de los explantes de yemas apicales en los cultivos in vitro. Para las yemas apicales de C. atlantica, el medio de cultivo WPM junto con el carbón activado y cisteína, resultaron adecuados para evitar el proceso de oxidación de los explantes. Este resultado es consistente con el reportado para Cedrus deodara (Tamta y Palni, 2004), en donde se evitó la oxidación de los explantes usando el medio WPM en combinación con el ácido ascórbico. También es consistente con lo reportado por Rebolledo et al. (2006), quienes también usaron el medio WPM para Pinus pseudostrobus y Pinus jaliscana, en combinación con ácido ascórbico y ácido cítrico. También en otros trabajos se reporta el uso de medios como el Murashige y Skoog MS (1962) y el de Schenk y Hildebrandt SH (1972), ampliamente usados en cultivos vegetales in vitro para especies no leñosas. Para Pinus cubensis se reportó el usó del medio MS sin agentes antioxidantes (Cantillo et al., 2011) y para Picea chihuahuana se empleó el medio SH adicionado con ácido ascórbico y ácido cítrico (López et al., 2000).
Multiplicación por brotación múltiple de Cedrus atlantica
En el Cuadro 1 se observa que la presencia de la BAP en el medio de cultivo, estimuló la brotación en C. atlantica en las dos de las concentraciones evaluadas (3 y 5 mg L-1). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el número de brotes. También se observó que el BAP estimula la elongación de los brotes, que presentaron hasta 1.53 cm de longitud, pero con las dos concentraciones de BAP que se usaron, no se observaron diferencias significativas en el tamaño de los brotes (Figura 2).
Cuadro 1 Efecto la citocinina bencil amino purina (BAP) en la brotación múltiple de yemas de Cedrus atlantica.
| BAP (mg L-1) | Núm. de brotes | Longitud del brote (cm) |
| 0 | 2.77 ± 0.83 a* | 0.08 ± 0.16 a |
| 3 | 4.44 ± 0.88 b | 1.53± 0.22 b |
| 5 | 4.88 ± 0.92 b | 1.43 ± 0.92 b |
*Letras diferentes en cada columna indican que existen diferencias significativas. Prueba de Tukey con un nivel de significancia de p< 0.05.
Figura 2 Efecto de la citocinina bencil amino purina (BAP) en la brotación múltiple de yemas de Cedrus atlantica.
El efecto de la BAP sobre la brotación multiple que se obtuvó en éste trabajo, es consistente con los reportes de otros autores en plantas de la familia Pinacea. López et al. (2000) reportaron para Picea chihuhuana, que con la adición de 3.5 mg L-1 de kinetina se producen siete brotes por explante; Oliveira et al (2011) reportaron que 0.4 mg L-1 de bencil adenina (BA) puede generar tres brotes por explante en cultivos in vitro de Pinus taeda.
Sin embargo, el número de brotes que se obtuvo de C. atlantica en éste trabajo está por debajo de los reportados para Pinus maximartinezzi, en donde se reportó que la adición de BA en una concentración de 16 mg L-1 produce la formación de 29 brotes por explante Robledo et al. (2009); mientras que BA a una concentración de 1.1 mgL-1 también se producen de 7 a 50 brotes por explante de Cedrus deodara (Tamta y Palni, 2004). De esta manera se evidencia la importancia de las citocininas en el metabolismo de las Pinacea para inducir el proceso de brotación multiple.
Enraizamiento
En esta investigación las concentraciones del ácido indol butírico (AIB) empleadas para C. atlantica no fueron las más adecuadas, debido a que no formó raíz, solamente se observó la presencia de callos en los explantes sembrados (Figura 3). Este resultado es consistente con lo reportado en la literatura, donde se observa que la inducción de enraizamiento in vitro son bajos en comparación con los tratamientos ex vitro. Asimismo, Hartmann et al (2002) consideran que la etapa de enraizamiento representa a menudo la fase crítica y difícil en los protocolos de micropopagación de la mayoría de las especies leñosas. Al respecto Paz et al. (2009) reportaron que en P. maximartinezii, solo se logró inducir 3% de formación de raíces en los brotes con una concentración de 3 mg L-1 de AIB. Una alternativa para mejorar el proceso de enraizamiento de las plántulas de C. atlantica podría ser el empleo de IBA en combinación con ANA. Esto considerando los resultados reportados Pinus cubensis (Oliveira et al 2011), ellos reportan que la combinación de 1.8 mg L-1 de ácido naftalen ácetico (ANA) y 2.03 mg L-1 AIB favorece la formación del 47% de raíces, sin la formación de callo.
Conclusión
En éste estudio se reporta un protocolo para obtener un cultivo in vitro de C. atlantica a partir de yemas axilares. El medio de cultivo que se usa es el WPM con la adición de carbón activado y cisteína con lo que se obtiene un cultivo in vitro sin rasgos de oxidación y con potencial para la generación de brotes en presencia de la citocinina bencil amino purina. Los estudios futuros son encaminados para inducir la formación de raíces.
