Introducción

Las colecciones de microorganismos tienen fines académicos o referenciales (^{Borman, et al, 2006}).Y es el mantenimiento y viabilidad de estas colecciones, uno de los problemas más comunes en los laboratorios de diagnóstico de enfermedades en las plantas. Los métodos de conservación de los microorganismos causales se presentan como un paso crítico en el cumplimiento de estos fines. Debido a sus características fisiológicas, especies de los géneros Phytophthora y Pythium presentan los mayores problemas en su sobrevivencia, y más aún, si no se cuenta con la infraestructura necesaria. Hongos y oomicetos pierden viabilidad en diferentes métodos de conservación y en caso contrario, pierden virulencia y patogenicidad, como en el método de resiembra periódica (^{Dhingra y Sinclair, 1987}; ^{Richter y Bruhn, 1989}; ^{Humber, 1997}).

Los oomicetos pueden ser conservados mediante métodos de corto plazo como la siembra en tubos inclinados con papa-dextrosa-agar o V8-agar cubiertos con lugol o aceite mineral, en donde es necesario resembrar cada dos años (^{Humber, 1997}; ^{Heckely, 1978}). Grandes colecciones, como la World Phytophthora Collection, se encuentran en criopreservación a -120 °C en ultracongeladores (^{Coffey, 2008}) e incluso se reporta inmersión en nitrógeno líquido a -190 °C, en donde permanecen viables por más de 9 años (^{Smith, 1982}; ^{Dahmen et al, 1983}). Aunque la criopreservación es capaz de mantener al organismo en su estado genético original, se requiere de equipo costoso, siendo esta su principal limitante.

Una de las formas más prácticas y confiables de conservar a Phytophthora es en agua destilada estéril (^{Dhingra y Sinclair, 1987}; ^{Simpfendorfer et al, 1996}; ^{Ryan et al, 2000}; ^{Ko, 2003}), sobre todo en lugares en donde no hay la infrestructura necesaria para criopreservación. ^{Boesewinkel (1976)} reporta haber mantenido a Phytophthora cactorum, P. cinnamomi y P. megasperma var. sojae por 6 a 7 años en agua destilada estéril a temperatura ambiente; por otra parte, ^{Ko (2003)} conservó viables aislamientos de P. cinnamomi, P. parasitica y P. palmivora en agua destilada estéril atemperatura ambiente por periodos de 6 a 23 años. En el caso de la conservación en suelo de Pythium y Phytophthora, esta ha sido poco documentada.

Comúnmente, se considera este método de conservación de corto plazo y su éxito depende mayormente del suelo utilizado y de la cantidad de agua que sea capaz de retener (^{Dhingra y Sinclair, 1987}) ya que la formación de estructuras de propagación en Phytophthora requiere alta humedad, alta concentración de oxígeno y baja de dióxido de carbón (^{Ribeiro, 1983}). Con la intención de resguardar aislamientos de Phytophthora y Pythium, mediante un método que impidiera la pérdida de virulencia y patogenicidad, además de ser económicamente accesible, se han estado almacenando en tubos de ensaye conteniendo agua destilada estéril y suelo estéril desde hace 2 a 19 años. Recientemente, se determinó su viabilidad con el fin de conocer cuál ha sido el mejor método para la conservación de estos dos géneros.

Materiales y métodos

Para la conservación de los diferentes aislamientos de Phytophthora y Phytium en suelo estéril se utilizó el siguiente protocolo Dr. García-Espinosa, R. (Com. Per.): se colocaron 2 segmentos circulares (9 mm diámetro y de grosor variable) de los diferentes aislamientos creciendo en medio harina de maíz-agar (100%), agar (1.9%) y antibióticos (250 ppm ampicilina, 10 ppm rifampicina y 10 ppm pimaricina) en tubos de ensayo de 30 ml de capacidad que contenían suelo previamente tamizado (malla #20) y esterilizado en autoclave a 15 lbs de presión por tres horas durante dos días consecutivos. Después de la siembra, los tubos se cerraron con su tapón de baquelita, se incubaron a 28 °C durante 48 h, y se almacenaron en oscuridad a temperatura ambiente.

Adicionalmente, se conservó en tubos con agua estéril Dr. García-Espinosa, R. (Com. Per.). A tubos de ensaye, de aproximadamente 20 ml de capacidad, se les adicionó 12 ml de agua destilada y se esterilizó durante 30 minutos a 15 lbs de presión; posteriormente, se colocaron en cada tubo, 4 segmentos circulares (9 mm diámetro y de grosor variable) de los diferentes aislamientos creciendo en medio harina de maíz-agar (100%), agar (1.9%) y antibióticos (250 ppm ampicilina, 10 ppm rifampicina y 10 ppm pimaricina). Los tubos se almacenaron en oscuridad a temperatura ambiente.

Al menos, había cinco tubos de conservación en suelo estéril por cada aislamiento. Para determinar la viabilidad de los cultivos conservados en suelo, se sustrajo suelo de cada tubo de ensaye, realizando previa homogenización, y se colocó (por duplicado) en cajas Petri con medio harina de maíz-agar (100%), agar (1.9%) y antibióticos (250 ppm ampicilina, 10 ppm rifampicina y 10 ppm natamycin (Delvocid®). Se incubó a 28 °C en obscuridad. En el caso del método de conservación en agua estéril, se sustrajeron los segmentos circulares de cada tubo y se colocaron (por duplicado) en cajas petri con el medio antes descrito.

Los aislamientos conservados en suelo estéril fueron:

Phytophthora cinnamomi, Phytophthora sp., Pythium vexans y Pythium aphanidermatum. Los conservados en agua destilada estéril fueron Phytophthora citricola, Phytophthora sp., Phytophthora cinnamomi,Phytophthora capsici, Pythium sp. y Pythium aphanidermatum (Cuadro 1).

Cuadro 1 Sobrevivencia de especies de Phytophthora y Pythium en agua destilada y suelo estéril. 

Resultados y discusión

En ninguna de las dos réplicas realizadas, de cada tubo de conservación, sobrevivió al tiempo de conservación en suelo estéril ya que no hubo crecimiento del patógeno en medio de cultivo. En el caso de la conservación en agua destilada estéril, en ambas o en una de las réplicas, hubo respuesta positiva en crecimiento, por lo que se mantuvieron viables por el tiempo en que fueron conservadas. Los dos aislamientos de Phytophthora citricola permanecieron viables después de 18 y 19 años mientras que P. cinnamomi se cultivó con éxito después de 10 años. P. capsici pudo ser reactivado después de 10 y 21 años, al igual que Pythium aphanidermatum reactivado 7 años después. Para P. citricola, P. capsici y Pythium aphanidermatum es el primer reporte de conservación en agua estéril, y para P. cinnamomi había sido reportado un periodo de sobrevivencia de entre 9 a 18 años en agua estéril (^{Ko, 2003}).

Todos los aislamientos presentaron un crecimiento micelial característico en caja Petri, y sólo Phytophthora citricola produjo estructuras de propagación (oosporas) 6 días después de haber sido reactivado.

Comúnmente se cultiva a Pythium y Phytophthora en medio libre de antibióticos previo a ser conservados bajo diversos métodos (^{Dhingra y Sinclair, 1987}; ^{Ko, 2003}). En este caso, los diferentes aislamientos crecieron en medio que contenía pimaricina previo a ser conservados, y esta condición no afectó su viabilidad, ya que fue posible su cultivo después de periodos de 3 a 19 años. ^{Tsao y Ocana (1969}) comentan que 100 ppm de pimaricina en el medio inhibe la germinación de clamidosporas, esporangios y zoosporas de muchas especies, pero también comentan que hay una inhibición parcial a 25 ppm y cesa la inhibición por debajo de 12 ppm. Los segmentos de medio conservados en agua destilada estéril y suelo estéril no sobrepasaron las 10 ppm de pimaricina.

El éxito en la conservación en suelo depende del desarrollo del aislamiento en los primeros días de su conservación. En la conservación en suelo, el micelio y las unidades propagativas de la segunda generación son las que se preservan (^{Dhingra y Sinclair, 1987}) y de este suceso depende el éxito y el tiempo en que pueden ser conservados.

A diferencia de lo anterior, la conservación en agua destilada estéril ofrece un mayor tiempo de preservación. Este estudia confirma que especies de los géneros Phytophthora y Pythium se conservan de manera exitosa en agua estéril. Las estructuras de resistencia en Pythium y Phytophthora pueden ser oosporas, clamidosporas, y esporangios (^{Ribeiro, 1983}), aunque estos últimos son sumamente sensibles a la desecación (^{Judelson y Blanco, 2005}). Ya sea en el caso de especies homotálicas (P. citricola y Pythium aphanidermatum) en donde oosporas, clamidosporas y esporangios actúan como mecanismos de supervivencia, o en el caso de especies heterotálicas (P. capsici y P. cinnamomi), considerando sólo un grupo compatible en el medio, en donde esporangios y clamidosporas actúan como estructuras de resistencia (Ribeiro, 1983; ^{Elliot, 1983}), la conservación en agua evita la desecación de las estructuras de propagación. La conservación en agua estéril de especies de Phytophthora y Pythium es sencilla, confiable y económica, sobre todo comparada con métodos de resiembra o en donde se requiere de ultracongeladores como en el caso de la criopreservación.

Conclusiones

La viabilidad se confirmó mediante siembra en medio de cultivo harina de maíz-agar suplementado con antibióticos. Ninguno de los oomicetos conservados en suelo sobrevivió durante los periodos de conservación mientras que la conservación en agua estéril mantuvo viables a especies de Phytophthora por periodos de hasta 21 años y de Pythium por 7 años.