Introducción

Varios factores pueden afectar la embriogénesis somática en café, tales como la combinación de sales, presencia o ausencia de algunas hormonas, así como el ambiente gaseoso de los contenedores in vitro (^{Kumar et al, 2009}; ^{López-Gómez et al, 2010}). Generalmente, es posible inducir embriogénesis somática en Coffea canephora variedad Robusta, sólo con la presencia de la citocinina 6-benzilaminopurina (BAP) en el medio de inducción. Sin embargo, en algunos clones no se obtienen buenos resultados con este medio y en ciertos casos el desarrollo de callo embriogénico es un proceso largo, que va de seis a diez meses dependiendo del genotipo (^{López-Gómez et al., 2010}; ^{López-Gómez et al, 2011}).

En C. arabica, la presencia de alguna auxina es siempre necesaria para la obtención de callo embriogénico (^{Van Boxtel y Bertouly, 1996}; ^{Pierson et al, 1983}). Por otro lado, el ambiente gaseoso juega un papel muy importante en el cultivo in vitro. La atmósfera de los recipientes de cultivo puede contener altas concentraciones de dióxido de carbono (CO₂) y etileno (C₂H₄). El primero es conocido por su efecto positivo en la fase de germinación ex vitro (^{Ducos et al., 2009}). El segundo es un componente que afecta la respuesta morfogénica in vitro.^{Kumar et al., (2009)}, demostraron que el etileno inhibe la embriogénesis secundaria en café Robusta. Algunos estudios se han basado en la aplicación de inhibidores del etileno (AgNO₃, cloruro de cobalto y Na₂S₂O₃) o inhibidores de la síntesis del etileno (ácido salicílico), para suprimir su efecto negativo (^{Kumar et al, 2007}).

Algunos reportes describen el efecto de los inhibidores en la inducción de la organogénesis in vitro (^{Giridhar et al., 2003}) y embriogénesis directa en café Robusta (^{Giridhar et al., 2004}), pero se desconocen sus efectos en la embriogénesis somática indirecta en cuanto a la inducción de callo embriogénico y su efecto para las fases de multiplicación y diferenciación.

El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la combinación de dos medios de cultivo e inhibidores de etileno sobre la inducción de callo embriogénico de C. canephora P., y su capacidad para multiplicarse y diferenciarse.

Materiales y métodos

Este trabajo se llevó a cabo en el Centro de Investigación y Desarrollo Nestlé, Tours, Francia (NR&DC-T siglas en Inglés). Se emplearon hojas jóvenes y totalmente expandidas de genotipos de C. canephora P., variedad Robusta (FRT06, FRT07, FRT09, FRT22 y FRT23), seleccionados por su alto rendimiento. Todos ellos obtenidos de la colección del NR&DC-T, los cuales fueron desinfestados y establecidos in vitro de acuerdo a la metodología de ^{Ducos et al. (2007)}. Los explantes fueron incubados en condiciones de oscuridad a 25 °C, subcultivados cada 30 días y puestos en las mismas condiciones.

Se tuvieron seis tratamientos por genotipo que consistieron en: 1) el 23A8 [sales de ^{Yasuda et al., (1985)}, vitaminas de ^{Gamborg (2002)}, 1.12 mg L^-1 de 6-Benzilaminopurina (BAP) y 30 g L^-1 de sacarosa]; 2) el 23A8 adicionado con 6.8 mg L^-1 de AgNO₃; 3) el 23A8 adicionado con 6.3 mg L^-1 de Na₂S₂O₃; 4) secuencia de medios T1B/T2B (^{Van Boxtel y Berthouly 1996}): el medio T1B (utilizado durante un mes) compuesto por 50 % de las sales de ^{Murashige y Skoog (1962)}, más vitaminas de ^{Gamborg (2002)}, 2 mg L^-1 de 2-isopenteniladenina (2iP), 0.5 mg L^-1 de 2,4-diclorofenoxiacético (2, 4-D), 1 mg L^-1 de ácido indolbutírico (AIB), 400 mg L^-1 de extracto de malta, 100 mg L^-1 de caseína hidrolizada y 30 g L^-1 de sacarosa; el T2B (empleado durante dos meses) compuesto por 50% de las sales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962), 4 mg L^-1 de BAP, 60 mg L^-1 de sulfato de adenina, 1 mg L^-1 de 2, 4-D, 800 mg L^-1 de extracto de malta, 200 mg L^-1 de caseína hidrolizada y 30 g L^-1 de sacarosa; 5) la secuencia de medios T1B/T2B adicionado con 6.8 mg L^-1 de AgNO3; y 6) el T1B/ T2B adicionado con 6.3 mg L^-1 de Na₂S₂O₃. Todos los medios fueron gelificados con 8 g L^-1 de agar y ajustados a un pH de 5.6. En el cuarto mes se eliminaron el AgNO₃ y Na₂S₂O₃ y en el sexto mes del establecimiento in vitro se evaluaron el porcentaje y peso fresco de callo embriogénico (tejido friable, amarillo y de aspecto granuloso) (^{Ducos et al., 1999}). Cada tratamiento consistió de cuatro repeticiones de tres cajas Petri, una caja Petri con 50 mL de medio de cultivo e inoculado con quince explantes, un explante consistió en 3 mm² de hoja.

Después de seis meses de inducción y en los tratamientos en donde hubo suficiente callo, se seleccionaron callos embriogénicos y se transfirieron a 10 mL de medio líquido de multiplicación (23A8 sin agar), en matraces Erlenmeyer de 25 mL con una densidad de 10 g L^-1. Los matraces fueron colocados en un agitador orbital (110 rpm), a 25 °C en oscuridad. En esta fase se evaluó el peso fresco (mg), tasa de multiplicación [Tm= (Pf (semana 6) - Pf (semana 0))/ Pf (semana 0)] y el grado de diferenciación de la suspensión de acuerdo al criterio descrito en el Cuadro 1.

Cuadro 1 Criterio para la evaluación del grado de diferenciación de la suspensión en la fase de multiplicación en medio líquido de genotipos de C. canephora. 

Por otro lado se seleccionaron callos embriogénicos y se colocaron en 100 mL de medio líquido para la diferenciación (23A8 sin agar y BAP), en matraces Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con una densidad de 1 g L^-1. Los matraces fueron colocados en agitadores orbitales (110 rpm), a 25 °C con fotoperiodo de 16 hrs luz (0.1 - 0.6 kilolux) y 8 h de oscuridad. Para esta etapa se evaluaron la cantidad de embriones producidos por matraz para conocer el potencial embriogénico [número de embriones g^-1de callo= únmero de embriones por matraz (número de embriones en 1 g de muestra X peso total de embriones por matraz g)/ densidad de inóculo inicial (g)]. Los cambios a medio fresco se hicieron de acuerdo a lo sugerido por ^{Ducos et al. (2003)}. Se establecieron tres repeticiones por tratamiento, donde una repetición fue un matraz Erlenmeyer con la densidad antes mencionada. Todas las variables fueron analizadas por un ANOVA y la comparación de medias se llevó a cabo con la prueba de Tukey con 0.05 de significancia estadística, con la ayuda del programa estadístico SAS versión 9.0 (^{SAS institute 2002}).

Resultados y discusión

A los seis meses de inducción, los explantes comenzaron a producir diferentes tipos de respuesta morfogénica. Una de ellas fue la formación de callo embriogénico (Figura 1a). También fue posible observar embriogénesis directa expresada en la formación de grupos de embriones directamente del explante (Figura 1b), producción de callo acuoso, necrótico y nodular (Figura 1 c, d, e y f); y formación tardía de callo embriogénico a partir del callo acuoso, necrótico y nodular (Figura 1 e, f, g y h) y explante sin respuesta (Figura 1i). Al respecto ^{Ducos et al. (2007)} mencionan como indeseable la formación de embriones de manera directa del explante, ya que este tipo de respuesta (embriogénesis directa) limita el potencial de la embriogénesis somática para un esquema de propagación masiva.

Figura 1 Diferente respuesta morfogénica de genotipos de café Robusta. a) callo embriogénico del FRT06 en 23A8; b) embriogénesis directa del FRT07 en 23A8-Na2S2Oa; c) callo necrótico del FRT07 en T1B/ T2B; d) callo embriogénico y acuoso del FRT06 en 23A8- Na₂S₂O₃; e) callo embriogénico a partir de callo necrótico del FRT22 en T1B/T2B- Na₂S₂O₃; f) callo embriogénico a partir de callo necrótico del FRT07 en T1B/T2B-AgNO3; g) callo embriogénico a partir de callo nodular del FRT22 en el medio 23A8- Na₂S₂O₃; h) callo embriogénico del FRT23 en T1B/T2B- Na₂S₂O₃; e i) explante sin respuesta morfogénica. Barra= 1 mm. 

En los tratamientos cuyo medio base fue el 23A8 la formación de callo embriogénico se dio a partir del explante en los tratamientos con el medio 23A8, pero en los tratamientos con la secuencia T1B/T2B (en presencia de auxinas), la formación de callo embriogénico se dio a partir de un callo necrótico que se formó en etapas tempranas, tal es el caso del genotipo FRT07 en el medio T1B/T2B suplementado con AgNO₃ (Figura 1f). Lo anterior confirma lo encontrado por ^{Ducos et al. (2009)} y ^{López-Gómez et al. (2010)}, quienes mencionan que es posible obtener callo embriogénico sólo con las presencia de BAP como regulador del crecimiento; sin embargo, algunos autores en estudios con diversos genotipos de café Robusta mencionan que es necesaria la presencia de auxinas (^{González, 2003}), e incluso un balance entre auxinas y citocininas, que favorezcan la formación de callo con potencial embriogénico (^{Van Boxtel y Berthouly, 1996}).

En el Cuadro 2, se puede observar que hay diferencias significativas entre los tratamientos para cada variable, con excepción de la biomasa para los genotipos FRT07 y FRT22, así como en el porcentaje de callo embriogénico para el genotipo FRT22. En la comparación del porcentaje de callo embriogénico obtenido en los medios 23A8 y T1B/ T2B, se puede observar que el segundo medio propició una drástica reducción de la respuesta morfogénica para los genotipos FRT07 y FRT09. Por el contrario, este mismo medio favoreció el peso del callo embriogénico del genotipo FRT23. Para los genotipos FRT06 y FRT22 este medio tendió a disminuir la frecuencia de callo embriogénico, sin embargo, incrementó el peso. Este tipo de respuesta ha sido observada en diversas especies al utilizar nuevos inductores de callogénesis en cultivos de interés agrícola (^{Montes et al, 2000}).

Cuadro 2 Porcentaje de callo embriogénico (CE) y peso fresco (PFS) en medio semisólido de genotipos de café obtenidos a partir de los medios de inducción; peso freso en medio líquido (PFL), tasa de multiplicación (TDM), grado de diferenciación de la suspensión (GD) de líneas celulares en fase de multiplicación en medios líquidos y número de embriones (ES) por gramo de callo para el potencial embriogénico de los callos en la fase de diferenciación y en presencia de inhibidores de etileno. 

† Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes según Tukey (p≤ 0.05). ¶ En estos tratamientos no fue posible establecer la multiplicación y diferenciación en medios líquidos por no contar con suficiente callo embriogénico.

Lo concerniente al efecto de los inhibidores del etileno, la respuesta fue diferente y dependió de los genotipos y del medio. Para el genotipo FRT06, se pudo ver que la presencia del AgNO₃ inhibió la producción de callo embriogénico en ambos medios. En general, el Na₂S₂O₃ en ambos medios tuvo un efecto positivo, ya que en la mayoría de los genotipos evaluados, en interacción con alguno de los medios evaluados favoreció la formación de callo embriogénico, y por consiguiente hasta la obtención de embriones somáticos. Para el genotipo FRT07, el AgNO₃ favoreció la producción de biomasa, pero sólo cuando fue adicionado a la secuencia de medios T1B/T2B; esto último confirma los resultados obtenidos por otros autores, quienes consignan que el efecto del AgNO3, estará en función del genotipo, especie y sobre todo en interacción con otros reguladores como las auxinas y fuentes de carbono (^{Fuentes et al, 2000}; ^{Giridhar et al, 2004}). Para el genotipo FRT09, los inhibidores no favorecieron la embriogénesis en ninguno de los medios evaluados.

Para el genotipo FRT22 tanto para la frecuencia de callo embriogénico como para la biomasa, no se detectó efecto por la presencia de inhibidores de etileno. Y por último, para el genotipo FRT23, la producción de callo embriogénico fue mejor con la secuencia de medios T1B/T2B adicionado con Na₂S₂O₃. Esta respuesta puede atribuirse a la concentración empleada de los inhibidores de etileno, ya que de acuerdo a ^{Wang et al. (2002)} el efecto inhibidor de la acción del etileno por el AgNO₃ dependerá del número de iones plata para reemplazar a los iones de cobre que necesita el etileno para tener receptores funcionales en las células vegetales.

En la fase de multiplicación, no se detectaron diferencias significativas en términos de biomasa, tasa de multiplicación y calidad de la suspensión para los genotipos FRT06, FRT07, FRT09 y FRT22. La tasa de multiplicación fue de 10 a 20 después de seis semanas de cultivo. Estos resultados concuerdan con los resultados de ^{Ducos y Pétiard (2003)}, quienes mencionan que la multiplicación de biomasa se da por un factor de 2 a 3 cada dos semanas.

En el caso del genotipo FRT23, el análisis estadístico mostró que la biomasa y la tasa de multiplicación de callos obtenido de la secuencia T1B/T2B adicionado con Na₂S₂O₃ fueron mayor que el resto de los tratamientos; sin embargo, esta suspensión estuvo compuesta principalmente por embriones en diferente estado, tal material recibió una clasificación de "II" por lo que no puede ser considerado como una suspensión celular. Al respecto ^{Ducos y Pétiard (2003)} mencionan que una suspensión celular en la fase de multiplicación debe estar compuesta por agregados celulares compactos y de un tamaño aproximado de 0.3 a1.5 mm. En el resto de los casos, se pudo observar que las suspensiones estaban compuestos por una mezcla de agregados celulares y embriones, o bien sólo por agregados; este último tipo de respuesta es la deseada ya que permiten establecer un esquema de propagación masiva, ya sea para reiniciar un cielo de multiplicación o inducir la diferenciación para la obtención de embriones.

En cuanto a la diferenciación se pudo observar que el potencial embriogénico varió de 25 a 137 mil embriones por gramo de callo inoculado (Cuadro 2). Estos resultados son similares a los obtenidos por ^{Ducos et al. (2007)}, quienes mencionan que el potencial embriogénico de los callos de café Robusta es de 50 000 embriones en promedio por gramo de callo.

Lo concerniente al origen de los callos, no se detectaron diferencias significativas para los genotipos FRT06, FRT07, FRT09 y FRT22. Sin embargo, en el genotipo FRT06 se pudo ver que los callos embriogénicos provenientes de la secuencia T1B/T2B y T1B/T2B con Na₂S₂O₃ presentaron un mayor potencial que los callos provenientes del medio 23A8 (Testigo). Por otro lado, para el genotipo FRT23 se encontraron diferencias significativas y el mejor tratamiento para este genotipo lo propiciaron los callos provenientes del medio 23A8 adicionado con Na₂S₂O₃ (un poco más de 137 mil embriones por gramo de callo embriogénico inoculado). Al respecto ^{Kumar et al. (2007)} mencionan que el efecto del Na₂S₂O₃ no es claro y parece estar asociado a que este como componente del medio puede favorecer la síntesis endógena de auxinas. Por lo que un estudio dirigido a evaluar los niveles endógenos de este regulador en presencia y ausencia de Na₂S₂O₃, podría contribuir a confirmar o descartar ésta hipótesis.

Conclusiones

Se logró determinar el efecto de inhibidores de etileno en interacción con dos medios de cultivo. El callo embriogénico obtenido a partir de los tratamientos mostró capacidad para proliferar en medio líquido, y el potencial embriogénico suficiente para obtener una cantidad aceptable de embriones por gramo de callo. En cada fase de la embriogénesis somática de café, el efecto de los inhibidores de etileno dependió de los genotipos en interacción con el medio de cultivo. Lo anterior permitió sugerir medios de cultivo adicionales en cada genotipo evaluado para la propagación por embriogénesis somática.