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Introducción
El virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV) por sus siglas en inglés, es un virus que ataca principalmente cebada, trigo y avena en la mayoría de las áreas productoras de norte y sur América, Asia, África, Europa y Australia (Mathre, 1997; Bockus, et al., 2010). Las pérdidas en producción y rendimiento total de grano, ocasionadas por la enfermedad, pueden ser considerables, dependiendo del tipo de cultivar, nivel de infección, virulencia del virus y medio ambiente (Mckinney y Greeley, 1965; Carroll, 1986). Las pérdidas en producción son principalmente por la disminución de la fotosíntesis (Brakke et al., 1988) y la inducción de esterilidad de óvulos y polen. Plantas enfermas con el virus BSMV producen significativamente menos espigas y semillas que las sanas, con decremento en el peso y rendimiento total de grano (hasta 35%).
El virus BSMV se transmite por semilla, polen, óvulo y savia pero no por insectos vectores como áfidos (Carroll, 1972; Carroll, 1974; Carroll y Mayhew, 1976). En cebada la transmisión es por semilla vía óvulo pero en trigo es por polen y las infecciones naturales, en este cultivo, resultan de la transferencia de savia por el contacto entre plantas. En hospederos distintos la transmisión por semilla es relativamente ineficiente.
Debido a que el virus puede permanecer viable por varios años en la semilla esta se constituye como la fuente de inoculo primario y la principal vía de transmisión del virus (Carroll, 1986). Se menciona que en infecciones tempranas algunas razas del virus pueden tener 100% de transmisión por semilla, pero lo más común es de 50 a 60% de transmisión. La transmisión por semilla se puede determinar directamente por la búsqueda del desarrollo de síntomas en plántulas crecidas en invernadero ya que en general las semillas infectadas con el virus BSMV son asintomáticas (Carroll, 1980; Mathre, 1997; Bockus et al., 2010).
Para la detección e identificación del virus BSMV se utilizan diferentes métodos. En campo, la inspección de plantas para buscar síntomas característicos de la enfermedad; en plantas sospechosas, observaciones de preparaciones foliares al microscopio electrónico para detectar la presencia de partículas virales características; y en hoja y semilla, por pruebas serológicas como la de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) por sus siglas en inglés con anticuerpos específicos, o con la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por sus siglas en inglés con iniciadores específicos (Jackson et al., 1991).
La detección y la identificación oportuna del virus BSMV son esenciales para el control de la enfermedad del mosaico estriado de la cebada e importantes para su regulación y control a través de programas de certificación fitosanitaria y de cuarentena en el comercio nacional e internacional de semillas (Morrison, 1999). Por lo anteriormente indicado se establecieron los objetivos de determinar si: 1) el nivel de infección (de 5, 10 y 15%); 2) el incremento del número de muestra simples (10, 15, 20 y 25), utilizadas para formar muestras compuestas; y 3) el aumento o la reducción del tamaño de muestra usual de 10% a 15 y 5%, afectan la sensibilidad de la prueba DAS-ELISA para la detección del virus BSMV. Las hipótesis planteadas fueron: a) los niveles de infección de 5, 10 y 15%; b) el incremento en el número de muestras simples utilizadas para formar muestras compuestas; y c) el aumento o la reducción actual del tamaño de muestra de trigo de 10% a 15 y 5% no afectan la sensibilidad de la prueba DAS-ELISA.
Materiales y métodos
Establecimiento de prueba DAS- ELISA
La prueba DAS (Double-antibody sándwich)- ELISA es una variante de la prueba directa ELISA por sus siglas en inglés, desarrollada para la detección de virus de plantas con un conjugado especifico de enzima-anticuerpo para cada virus en particular. En este caso la prueba se estableció con muestras de semilla molida (provenientes de 2 g de semilla) en placas de poliestireno de 96 pozos. Los reactivos empleados así como el protocolo fueron de Agdia®, DAS- Elisa (2013) para el virus BSMV.
Sensibilización y lavado de placas
El anticuerpo de cobertura se diluyó 1:200, para esto se mezclaron 10 000 µl de búfer de cubrimiento (1X), pH 9.6, con 50 µl del anticuerpo de cobertura concentrado. Con excepción de los pozos blanco, en cada pozo se adicionaron 100 µl de la dilución del anticuerpo de cobertura y se incubó por 4 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C, en cámara húmeda. Después de la incubación, se vacío el contenido de la placa y se lavó con el búfer de lavado PBST (1X) con una piceta multicanal. Este proceso se repitió tres veces y entre cada lavado la placa se sacudió con fuerza, hacia abajo, sobre una toalla de papel doblada para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.
Adición de muestras
A cada uno de los tubos con las muestras de semilla molida se les agrego 20 ml de búfer de extracción (1X) relación 1:10 (peso de muestra en g: volumen del búfer en ml). Con excepción de los pozos blanco, se agregaron 100 µl por pozo de cada una de las muestras por duplicado, así como el control positivo, control negativo y el búfer, de acuerdo al diagrama de carga preestablecido. La placa se incubó por 2 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C, en cámara húmeda. Al completarse la incubación la placa se vació y se lavó ocho veces con el búfer de lavado, con la finalidad de eliminar todo residuo de muestra. Entre cada lavado la placa se sacudió con fuerza, hacia abajo, sobre una toalla de papel doblada para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.
Adición del conjugado enzimático
Poco antes de usarse la enzima (fosfatasa alcalina) conjugada se diluyó a una relación 1:200. Para esto se mezclaron 10 000 µl del búfer ECI (1X) con 50 µl del conjugado enzimático concentrado. Con excepción de los pozos blanco de la placa, en cada pozo se agregaron 100 µl de la dilución enzimática. Después de 2 h de incubación en cámara húmeda, la placa se vació y se lavó ocho veces con el búfer de lavado, con la finalidad de eliminar todo residuo de muestra. Entre cada lavado la placa se sacudió con fuerza, hacia abajo, sobre una toalla de papel doblada para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.
Revelado de placa
Para el revelado se preparó una solución PNP (p-nitrofenil fosfato) a 1 mg por ml con dos tabletas PNP (sustrato) disueltas en 10 ml de búfer PNP (1X) en un agitador Vortex Scientific Industries G-560. Se evitó tocar las tabletas y de exponer la solución PNP a luz intensa para evitar contaminación y desarrollo de falsos positivos por desarrollo de color en los pozos de las muestras negativas. Inmediatamente después de prepararse, se depositaron 100 µl de la solución PNP, en cada uno de los pozos de la placa y se incubó en oscuridad a temperatura ambiente por 60 min. Transcurrido el tiempo de incubación, se depositaron 70 µl de hidróxido de sodio (NaOH) 3 molar por pozo para detener la reacción en la placa. La lectura de la placa se hizo en un espectrofotómetro BioTek ELx808 a 405 nm.
Preparación de muestras simples
A partir de dos lotes de semilla de trigo harinero (Triticum aestivum L.), uno de semilla naturalmente infectada (SI) con el virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV, por sus siglas en ingles) y otro de semilla sana (SS), se formaron muestras simples (MS) de 20 g de semilla. Cada muestra MS se preparó de acuerdo al nivel de infección (NI) correspondiente: NI 15%, 3 g de SI con 17 g de SS; NI 10%, 2 g de SI con 18 g de SS; y, NI 5%, 1 g de SI con 19 g de SS. Una vez formadas las muestras MS estas se depositaron por separado en sobres de papel debidamente identificados. En total se prepararon 210 muestras MS (70 nuestras MS por NI) de las cuales se tomaron 2 g de semilla de cada una para molerse y analizarse por separado por DAS-ELISA de acuerdo al protocolo descrito arriba.
Preparación de tamaño de muestra y muestras compuestas
De cada una de las 210 muestras MS se tomaron por separado, 1.0, 1.9 y 2.56, g de semilla para formar tamaños de muestra (TM) de 5, 10 y 15% respectivamente (Figura 1). Para esto a partir de un lote inicial de 20 g se tomó 1 g para formar el TM de 5%; de los 19.0 g restantes se tomaron 1.90 g para formar el TM de 10%; y de los 17.1 g finales se pesaron 2.56 g para el TM de 15%.
Figura 1. Diagrama para la composición de las muestras simples (MS) con su nivel de infección y la estructuración de las muestras compuestas (MC= NMS + TM + NI).
Las muestra compuestas (MC) se formaron con diferente número de muestras MS (25, 20, 15 y 10 NMS). En total se formaron 36 muestras MC, cada muestra MC con tres NI y tres TM y un peso total de acuerdo al TM (Figura 1). Con fines prácticos de manejo, las MC anteriores se etiquetaron considerando primero la clave para el número de muestras MS, después la clave para el TM y por último la del NI. Por ejemplo, la muestra etiquetada como MC25-15-15 indica que se trata de una muestra MC con 25 muestras MS, con TM de 15% y con 15% de NI. En tanto que la MC25-10-15 indica que se trata de una muestra MC formada por 25 muestras MS, con TM de 10% y con 15% de NI. Mientras que la MC25-5-15 indica que se trata de una muestra MC con 25 muestras MS, con TM de 5% y con 15% de NI. Esta metodología se aplicó para el resto de las 33 muestras.
En la Figura 1 y Cuadro 1 siguientes se ilustra el esquema de formación de muestras MS y MC.
Evaluación del número de MS, TM y NI en muestras compuestas
Para determinar si el NMS, el incremento o reducción del tamaño TM y el nivel NI que conforman la muestra MC afectan la sensibilidad de la prueba DAS-ELISA al virus BSMV, se analizaron por separado cada una de las 36 muestras MC. De cada muestra MC se tomaron tres repeticiones de 2 g de semilla cada una (108 sub muestras en total), las cuales se depositaron en tubos tipo falcón de 50 ml debidamente identificados para ser molidas por separado en un molino Peter Instruments. La semilla molida se recuperó en el mismo tubo. Entre cada molienda se limpió el molino con aire a presión y los fragmentos de semilla atorados en los discos del molino se retiraron con una aguja de disección para evitar contaminación entre muestras. El procedimiento del análisis de las sub muestras se hizo como se describió en el establecimiento de prueba DAS-ELISA para sensibilización y lavado de placas, adición de muestras, adición del conjugado enzimático y revelado de placas, del protocolo de Agdia, Das Elisa (2103) para el virus BSMV.
Análisis estadístico
Los datos de absorbancia obtenidos de la evaluación de las muestras MS y MC se analizaron con el programa estadísticos SAS system for Windows 9.4, usando para el análisis de la varianza el modelo lineal correspondiente a un diseño de bloques completos al azar (DBCA) con sub muestreo, con el procedimiento del modelo lineal general (GLM) y prueba de comparaciones múltiples de medias usando la diferencia significativa honesta (DSH) de Tukey, con un nivel de significancia de 5% (α= 0.05).
Resultados y discusión
Efecto del NMS y NI en la sensibilidad de la prueba DAS- ELISA
En el Cuadro 2 se muestran los valores promedio y comparación de medias de absorbancia en diferente NMS usadas para formar las muestras MC, con diferente NI del virus BSMV, utilizando la diferencia significativa honesta (DSH) de Tukey con nivel de significancia al 5% (α= 0.05). Con los niveles 15, 10 y 5% de NI se registraron muestras con valores superiores al valor umbral (0.22). Similarmente, los valores de las medias por grupo y los de las medias generales también fueron superiores al del umbral. Sin embargo, al analizar los resultados por nivel y entre niveles se encontraron diferencias.
Cuadro 2. Valores promedio y comparación de medias de absorbancia en diferente NMS usado para formar muestras MC, con diferente NI del virus BSMV.
| NI (%) | NMS | NI (%) | |||||
| NMSx | 15 | 10 | 5 | 25 | 0.74 by | 15 | 0.92 ay |
| 25 | 0.97 | 0.7 | 0.54 | 20 | 0.72 b | 10 | 0.73 b |
| 20 | 0.89 | 0.57 | 0.71 | 15 | 0.85 a | 5 | 0.63 b |
| 15 | 0.91 | 1.05 | 0.6 | 10 | 0.74 b | ||
| 10 | 0.87 | 0.63 | 0.72 | DSH | 0.032 | DSH | 0.107 |
x= número muestras simples usadas para formar la MC. Umbral de absorbancia promedio = 0.22 nm.
El valor promedio general (0.92) registrado con el nivel NI de 15% fue significativamente diferente (α= 0.05) al registrado con los NI de 10 y 5%, los cuales presentaron valores similares estadísticamente (0.73 y 0.63, respectivamente). Esto indica que al reducir el nivel NI de 15% a 10 y 5% se detectó un porcentaje de disminución de 20 y 34%, respectivamente, de la sensibilidad de la prueba DAS-ELISA al virus BSMV. Estos resultados confirman los resultados encontrados por Scott y Zummo (1995) quienes mencionan que conforme se reduce el nivel de incidencia natural de un patógeno en la semilla la probabilidad de no detectarlo se incrementa.
Al analizar la comparación de medias de absorbancia en los diferentes NMS, se encontró que en el NMS de 25, 20 y 10 que forman las muestras MC no tienen diferencias significativas estadísticamente (α= 0.05) a excepción de NMS de 15 (0.85) que si mostró diferencias con las anteriores. Al comparar el NMS con valor de absorbancia menor al del umbral (0.22), las muestras con NI de 10 y 5% registraron el mayor número de muestras MS negativas (14 y 24 muestras, respectivamente) respecto a las muestras con NI de 15% (6 muestras). Es decir, conforme disminuyó el NI de 15% a 10 y 5% se incrementó el número de muestras negativas al virus BSMV (datos no mostrados). En síntesis con un nivel de infección de 15% se detectó un porcentaje de 91.5% de probabilidad de detectar al virus BSMV por la prueba DAS-ELISA; esto es, que de las 70 muestras MS con 15% de NI, 64 de ellas fueron positivas al virus; en cambio con el NI de 10% se detectó un porcentaje de 80% y con 5% de NI se detectó un porcentaje de 66% de probabilidad de detectar al virus BSMV.
El nivel de infección de una semilla o de incidencia del patógeno en el cultivo es clave para su detección (Scott y Zummo, 1995), además que determina el tamaño de muestra o muestra compuesta, como lo encontrado por Priou et al. (2001), que la reducción del tamaño de muestra compuesta de tubérculos de papa están en función del nivel de incidencia de Ralstonia solanacearum en los cultivos.
Efecto del NMS, TM y NI en muestras compuestas
El Cuadro 3 muestra los resultados promedio de absorbancia de 36 MC con la prueba DAS-ELISA. En general los valores promedio de absorbancia de las muestras MC resultaron por arriba del valor umbral de absorbancia (0.21), tan solo en la muestra MC10-10-5 el valor de absorbancia (0.18) se mantuvo por debajo del umbral, ya que en cuatro de 6 observaciones individuales (repeticiones) obtuvieron una absorbancia menor al umbral. Aunque en las MC10-15-15, MC10-10-10 y MC10-5-5 registraron dos repeticiones por debajo del umbral, al promediar las 6 repeticiones este supero el umbral de absorbancia, marcándose como positivos al virus BSMV. Esto indica que cuando las muestras MC se forman con un NMS inferior a 15 o igual a 10 decrece la sensibilidad de la prueba DAS-ELISA al virus BSMV y la probabilidad de registrar falsos negativos se incrementa.
Cuadro 3. Valores promedio de absorbancia obtenidos con la prueba DAS-ELISA de muestras MC de semilla de trigo.
| TM | NI | NMS (Valor promedio de absorbancia) | |||
| 25 | 20 | 15 | 10 | ||
| 15 | 15 | 3.23 | 2.95 | 1.84 | 0.71 |
| 10 | 15 | 2.81 | 3.36 | 2.12 | 0.93 |
| 5 | 15 | 3.08 | 2.33 | 2.25 | 0.52 |
| 15 | 10 | 1.38 | 3.25 | 2.61 | 0.66 |
| 10 | 10 | 1.54 | 0.58 | 1.7 | 0.75 |
| 5 | 10 | 2.19 | 2.35 | 2.13 | 1.43 |
| 15 | 5 | 2.39 | 1.48 | 1.07 | 1.32 |
| 10 | 5 | 2.72 | 0.91 | 0.95 | 0.18 |
| 5 | 5 | 2.8 | 1.75 | 0.84 | 0.58 |
Umbral de absorbancia promedio= 0.21 nm. Los valores en cada celda provienen de 6 observaciones individuales.
Debido a que al comparar los 36 valores presentados en el Cuadro 3, obtenidos de la combinación de los tres factores, como si fuesen tratamientos individuales no hace mucho sentido, se realizó un análisis de varianza considerando la estructura factorial de los tratamientos, 3 factores: i) número de muestras simples (NMS) con 4 niveles (25, 20, 15 y 10); ii) tamaño de muestra (TM) con tres niveles (15, 10 y 5); y iii) nivel de infección (NI) con tres niveles (15, 10 y 5). En el Cuadro 4 se presentan los resultados de las comparaciones múltiples de medias utilizando la diferencia significativa honesta (DSH) de Tukey con nivel de significancia al 5% (α= 0.05), para cada uno de los efectos principales. Ahora las medias presentadas provienen de mayor número de valores individuales (N).
Cuadro 4. Comparaciones múltiples de medias de absorbancia para los efectos principales de los factores número de muestras simples (NMS), tamaño de muestra (TM), y nivel de infección (NI) utilizados para la formación de las muestras compuestas (MC).
| NMS | TM | NI | |||
| MC | Media | (%) | Media | (%) | Media |
| 25 | 2.46 ax | 15 | 1.91 a | 15 | 2.18 a |
| 20 | 2.11 a | 10 | 1.55 b | 10 | 1.71 b |
| 15 | 1.72 b | 5 | 1.85 a | 5 | 1.42 c |
| 10 | 0.79 c | ||||
| DSH | 0.365 | DSH | 0.288 | DSH | 0.288 |
| N | 54 | N | 72 | N | 72 |
x= valores dentro de cada columna con letras iguales no fueron estadísticamente diferentes. DHS= diferencia significativa honesta de Tukey, con nivel de significancia al 5%, N= número de valores individuales de los cuales proviene cada media.
Los resultados del análisis de la comparación de las medias para los efectos principales generales de absorbancia entre las muestras MC con diferente NMS, TM y NI indican diferencias estadísticas (α= 0.05) entre muestras. Específicamente señala diferencias entre las medias registradas por las muestras MC con un NMS de 25 (2.46a) y NMS de 20 (2.11a) con las muestras MC con un NMS de 15 (1.72b) y NMS de 10 (0.79c) y diferencias entre estas últimas. Lo anterior indica, que conforme disminuye el NMS en la muestra MC, decrece estadísticamente el valor de absorbancia confirmando lo encontrado por Fernández (2007) que menciona que los tamaños de muestra grandes registran mayor nivel de confianza y grado de precisión en contraste a lo presentado por las muestras pequeñas.
Al comparar las medias de absorbancia entre muestras MC con diferente TM se encontraron diferencias estadísticas (α= 0.05) entre muestras. Es de notar que estas diferencias se presentaron solamente entre las muestras MC con TM de 15 (1.9a) y 5 (1.8a) con la MC con TM de 10 (1.5b). Esto es, entre los tamaños de 15 y 5% no existen diferencias estadísticas pero si entre estas y el tamaño de 10%. Lo anterior puede estar relacionado con el hecho de que la muestra MC10-10-5 registró dos muestras (repeticiones) con valor (0.15 y 0.13) por debajo del umbral (0.21).
En este caso no se encontró una relación lineal entre el TM de la muestra MC con el valor de absorbancia; es decir, no hay una tendencia entre las medias de las muestras compuestas de acuerdo al tamaño de muestra. Estos resultados concuerdan con los encontrados por Moreno y Castillo (1978) para la clasificación de árboles cafetaleros, quienes indican que una muestra de 250 g usada para tamaño de grano se puede reducir a 100 o 50 g sin causar alguna alteración. Así como por los reportados por Thomas et al. (2005) quienes mencionan que no existen diferencias en el porcentaje de infección entre muestras compuestas de 40 y 80 muestras obtenidas de lotes de trigo de 200 y 500 t, respectivamente, infectados con Microdochium nivale.
Varios investigadores señalan que el análisis de tamaños de muestra pequeños da como resultado menor nivel de confianza, y grado de precisión en contraste con lo registrado con los tamaños de muestra mayores los cuales registran mejores resultados (Lawrence et al., 1995; Fernández, 2007; Miyamoto et al., 2008; Montesinos et al., 2010). Sin embargo, Thomas et al. (2005) indican que en lotes de semilla infectada con Tilletia tritici es el nivel de infección y no el NMS de la muestra MC el que determina la capacidad de una prueba de detectar al hongo.
Según Nyrop et al. (1999) cuando se desarrollan planes de muestreo se debería comenzar por comprobar lo que se sabe acerca de la distribución del muestreo, y realizar un análisis sensitivo para determinar si un perfeccionamiento de esta información está justificado, y que el tamaño de la muestra debería basarse en la información de la muestra representativa, ya que esta es un buen indicador de la incidencia de plagas en la unidad de manejo.
Al analizar las medias para los efectos principales generales de absorbancia entre las muestras MC con diferente NI se encontraron diferencias estadísticas (α= 0.05) entre las muestras. En este caso se registraron medias de 2.18a, 1.71b y 1.42c para las muestras MC de NI de 15, 10 y 5%, respectivamente (Cuadro 4). Conforme se redujo el NI, decreció significativamente el valor de absorbancia de la muestra MC. La Figura 2 muestra la tendencia lineal de los valores promedio de absorbancia de las muestras MC de acuerdo al NMS, TM y NI con solo el valor de la MC10-10-5 por debajo de la línea del umbral.
Figura 2. Tendencia de valores promedio de absorbancia de muestras compuestas (MC) de semilla de trigo. Cada muestra MC se formó con diferente número de muestras simples (NMS, 25, 20, 15 y 10), tamaño de muestra (TM, 15, 10 y 5%) y nivel de infección (NI, 15, 10 y 5%) del virus BSMV. Los valores de la línea marrón indican el promedio de tres muestras MC, los de la punteada morada, la tendencia lineal de los valores y los de la azul, el promedio del umbral de absorbancia (0.21).
Priou et al. (2001) encontraron que conforme el nivel de incidencia de la enfermedad por Ralstonia solanacearum disminuye en el cultivo, se reduce la detección del hongo en el tubérculo. Por lo anterior, estos autores sugieren analizar muestras compuestas grandes cuando los niveles de enfermedad son bajos en el cultivo. Similarmente, Scott y Zummo (1995) observaron que cuando el nivel de infección natural por Aspergillus flavus es alto (3%) el tamaño de muestra a analizar se reduce pero que cuando el nivel de infección es muy bajo ni con tamaños de muestra mayores se detecta al hongo.
Los resultados descritos anteriormente son evidencia de la importancia que se debe dar al muestreo como actividad fundamental en un programa de análisis de semillas (Morrison, 1999). El ISTA (2013) señala que un lote puede estar compuesto de semillas cosechadas de un solo campo o de varias secciones de terreno y, que el objetivo del muestreo de semilla será obtener una muestra representativa, de tamaño adecuado, para que los resultados de los análisis en laboratorio reflejen la calidad del lote de semilla. El conocimiento de la importancia que tienen los parámetros de tamaño de muestra, y nivel de infección en los muestreos de lotes de semillas es fundamental para determinar la probabilidad de seleccionar muestras positivas o negativas al patógeno de interés lo cual se traducirá en confiabilidad de los resultados, y en la toma de decisiones acertadas sobre el destino final del lote evaluado.
Conclusiones
El nivel de infección (NI de 15, 10 y 5%) y el incremento del número de muestra simples (NMS 10, 15, 20 y 25), utilizadas para formar muestras compuestas; y el incremento y la reducción del tamaño de muestra (TM) usual de 10% a 15 y 5%, respectivamente, afectaron la sensibilidad de la prueba DAS-ELISA para la detección del virus virus del mosaico estriado de la cebada (BSMV), por sus siglas en inglés en semilla de trigo.
Al reducir el NI en muestras simples (MS) de 15% a 10 y 5% decreció significativamente (α= 0.05) en 21 y 31.5%, respectivamente, la sensibilidad de la prueba al virus. Similarmente, la reducción del NMS para formar muestras compuestas (MC) afectó significativamente (α= 0.05) la sensibilidad de la prueba al virus e incremento la probabilidad de registrar falsos negativos. El incremento y la reducción del TM de 10% a 15 y 5% afectó significativamente (α= 0.05) la sensibilidad de la prueba al virus pero no se encontró una relación lineal entre el TM de la muestra MC con el valor de absorbancia. Entre los tamaños de 15 (1.91a) y 5% (1.85a) no se encontraron diferencias estadísticas (α= 0.05) pero si entre estos y el tamaño de 10% (1.55b), indicando que no hay una tendencia entre las medias de las muestras MC de acuerdo al tamaño de muestra.
