Biofabricación de nanopartículas

Se conocen diferentes métodos de fabricación de NPs, nanomateriales o nanodispositivos (^{EPA, 2007}), pero en particular el uso de metabolitos, extractos vegetales, células, tejidos, semillas o estructuras para reproducción vegetativa, órganos y organismos completos para la biofabricación de NPs constituye un área de gran dinamismo científico (Iravani, 2011; ^{Kuppusamy et al., 2016}). La cantidad de publicaciones es muy grande y buena parte de los estudios se refieren a la biosíntesis de NPs de metales, aunque también se encuentran resultados acerca de la biosíntesis de nanomateriales como el grafeno (^{Gurunathan et al., 2014}). Se dispone de una serie de revisiones de literatura que señalan muchos casos específicos, incluyendo las especies vegetales utilizadas para la biofabricación de NPs, así como los elementos transformados a NPs (Iravani, 2011; ^{Baker et al., 2013}; Rai y Yadav, 2013; ^{Pardha-Saradhi et al., 2014b}; ^{Ahmed and Ikram, 2015}; ^{Keat et al., 2015}).

Métodos de biofabricación de nanopartículas. Pueden clasificarse en (i) bioquímicos y (ii) biológicos. Ambos tipos se han denominado “verdes”, ya que al contrario que los métodos fisicoquímicos no generan subproductos contaminantes (Kharissova et al., 2013) y entre otras ventajas tienen un menor costo ya que no requieren de tanta infraestructura, reactivos y gasto de energía (^{Li et al., 2011}).

Para la fabricación bioquímica de NPs no se utilizan seres vivos, sino los extractos frescos o secos obtenidos de raíces, hojas, tallos, flores o frutos de diferentes especies vegetales (^{Mittal et al., 2013}; ^{Borovaya et al., 2014}) o de sus semillas (^{Rajasekharreddy and Rani, 2014}), de la biomasa remanente de procesos bioindustriales o biosólidos (^{Sarkar et al., 2014}; ^{Dauthal y Mukhopadhyay, 2015}), o bien biopolímeros, carbohidratos, gomas y látex (^{Hortigüela et al., 2011}; Iravani, 2011) que se ponen en contacto con una solución conteniendo de 1 a 5 mM de iones de metales para que el potencial reductor de los compuestos contenidos en el extracto o compuesto bioquímico lleve a cabo la reacción indicada en la ecuación (1).

Por otra parte para la fabricación biológica de NPs es posible utilizar cultivos de bacterias o cianobacterias (^{Patel et al., 2015}), hongos (^{Ahmad et al., 2003}), microalgas (^{Patel et al., 2015}) o bien cultivos de células u órganos vegetales (AlShalabi y Doran 2013), plantas completas (^{Mittal et al., 2014}) o sus estructuras, por ejemplo brotes (^{Gardea-Torresdey et al. 2003}), flores y tallos (^{Kuppusamy et al., 2016}) o raíces (^{Pardha-Saradhi et al., 2014b}). El proceso de fabricación biológica puede ocurrir de forma intracelular (^{Haverkamp and Marshall 2008}), extracelular (^{Li et al., 2011}) o inclusive ex planta por medio de los exudados radicales (^{Pardha-Saradhi et al., 2014a}). Básicamente lo que se lleva a cabo para la biofabricación de NPs es poner en contacto una solución con 1 a 2 mM de iones de un metal con un cultivo celular, órgano, semillas o planta completa, de tal forma que se desarrolle el proceso reductivo indicado en la ecuación (1). La concentración más baja indicada se utilizaría para elementos con alta toxicidad como el Cu y la más alta para elementos como el Au.

El mecanismo de biofabricación de nanopartículas. La síntesis bioquímica o biológica de NPs de metales es una reacción redox y ocurre gracias a la capacidad reductora de los componentes celulares o extracelulares como proteínas, carbohidratos, ácidos orgánicos, fenoles y otros metabolitos (^{Haverkamp y Marshall, 2008}; ^{Juárez-Maldonado et al., 2013}; Rai y Yadav, 2013; ^{Kumar et al., 2013}), los cuales aportan electrones a los cationes de los metales llevándolos a una forma metálica con carga cero y de escala nanométrica. En general para las NPs de metales como Cu, Ag, Pd, Au, Ni, Ce, entre otros, el proceso es como el indicado en la ecuación (2) siguiente:

El compuesto reductor en las ecuaciones (1) y (2) indica un único metabolito o compuesto químico o bien un conjunto de varios de ellos provenientes de un extracto vegetal o de células vivas. Los grupos funcionales que se ha reportado intervienen en la biosíntesis de NPs son los alcoholes, aldehídos, aminos, carboxilos, cetonas, hidroxilos, sulfhidrilos (^{Baker et al., 2013}; Rai y Yadav, 2013; ^{Huang et al., 2015}), por lo que puede suponerse que prácticamente cualquier compuesto biológico que aporte dichos grupos es utilizable para transformar iones de metales en NPs. Sin embargo, Rai y Yadav (2013) indican que algunos compuestos como los terpenoides, flavonoides, heterocíclicos diversos, polifenoles, azúcares reductores, glutatión y ascorbato se involucran directamente en la biosíntesis, mientras que otros, como las proteínas funcionan como agentes estabilizantes, formando por adsorción una cubierta orgánica denominada corona.

El Cu de valencia cero (Cu⁰) señalado en la ecuación (2) se obtuvo con la reducción en dos pasos del Cu⁺², primero a Cu⁺ y luego a Cu⁰ (Kitching et al., 2014) el cual forma complejos con otros átomos de Cu⁰ dando lugar por agregación a una nanopartícula que puede ser cristalina o amorfa y tendrá ciertas dimensiones y geometría específicas, ello dependiente del ambiente químico en donde ocurre la reacción y los compuestos que aportan el potencial reductor (^{Bashir et al., 2015}; Metz et al., 2015). La magnitud nanométrica de las NPs da lugar a un alto cociente superficie/volumen, generando una gran exposición del plasma electrónico del metal con cantidades de masa muy pequeñas. Lo anterior acrecienta en varios órdenes de magnitud la cantidad de energía electrostática y cinética del plasma electrónico disponible para interacción (por ejemplo con la radiación electromagnética o con metabolitos y proteínas que forman la corona) por unidad de masa del nanoelemento (^{Noguez, 2007}; ^{Lynch y Dawson, 2008}). Precisamente allí radica gran parte de la reactividad biológica de las NPs y lo que las convierte por un lado en un microbicida muy efectivo pero, por otra parte, también las vuelve un agente inductor de estrés celular para otros organismos como plantas, animales y humanos.

Otros factores adicionales al cociente superficie/volumen, como la geometría de las NPs y el tipo de recubrimiento orgánico también modifican la interacción con los componentes celulares (^{Karlsson et al., 2009}). Esto explicaría parcialmente la existencia de reportes contradictorios respecto a los efectos positivos y negativos de diferentes tipos de NPs (^{Rivera-Gil et al., 2013}), ya que la actividad específica de las NPs de un mismo elemento dependería de la interacción superficial con los diferentes metabolitos y proteínas presentes (Metz et al., 2015). De hecho se afirma que la corona formada por esta adsorción de proteínas y metabolitos diversos a la superficie de las NPs, es la señal que las células perciben y señalizan para modificar su comportamiento fisiológico y la expresión génica (^{Lynch y Dawson, 2008}). Por otra parte, es posible que los diferentes métodos de síntesis: fisicoquímica, bioquímica y biológica den lugar a NPs con los mismos rangos de diámetro pero con diferencias en geometría y por lo tanto en su cociente superficie/volumen y en la cubierta orgánica o corona, lo cual daría lugar a que las NPs del mismo elemento y de la misma categoría diamétrica ejercieran efectos diferentes al aplicarse para ciertos usos o al interactuar con los seres vivos o los sistemas ecológicos.

Surge la cuestión del porqué las células vivas fabrican las NPs en presencia de iones de metales cuando se ha demostrado que aquellas son muy reactivas y capaces de inducir estrés oxidativo y otros desórdenes celulares (^{Navarro et al., 2008}). Es posible que simplemente se trate de una respuesta automática del sistema bioquímico que dispone de cierta capacidad antioxidante. O tal vez la respuesta se relacione con la mayor facilidad para mantener a las NPs en ubicaciones celulares específicas con un menor costo energético en comparación con los iones de metales en solución (^{Karlsson et al., 2009}).

Frente a un estrés inducido por el exceso de iones de metales las plantas responden con varios mecanismos de defensa como disminuir el ingreso y elevar la excreción de estos elementos por la raíz, la complejación con metabolitos, proteínas o la pared celular, la acumulación de antioxidantes así como el transporte y complejación en la vacuola (^{Shahid et al., 2014}). Todas estas respuestas son inducidas y requieren de tiempo y gasto de energía para su implementación funcional. La ventaja de la formación de las NPs es que ocurre rápidamente, depende solamente del potencial antioxidante existente en el momento y funciona como una respuesta expedita que sería complementada posteriormente por los ajustes antes mencionados que darían lugar al control más fino y efectivo de la concentración de los iones de metales.

Tal parece entonces que la síntesis de NPs sería de las primeras respuestas defensivas de las plantas frente al estrés inducido por el exceso de iones de metales. Por ello se espera que la capacidad de producción de NPs de un sistema biológico responda por una parte al aporte de los iones de metales en concentraciones por encima de las adecuadas y por otro lado, a la capacidad del sistema para biotransformar los iones en NPs. Esto último obedecerá a la capacidad antioxidante global aportada por los metabolitos y otros compuestos localizados en el extracto vegetal o células vivas (^{Huang et al., 2015}; ^{Valko et al., 2016}).

La biosíntesis de NPs ocurre de forma espontánea en la naturaleza, tanto en sus componentes abiótico como biótico (^{Hochella et al., 2008}). Sin embargo, la literatura consultada muestra un sesgo de información, en el sentido de que los estudios publicados se dirigen principalmente hacia la biofabricación de NPs así como a los efectos de NPs artificialmente manufacturadas y su destino ecológico. Hay poca información acerca de las NPs generadas en condiciones naturales. ¿qué efectos causan en los organismos y que funciones ecológicas desarrollan las NPs naturales? El tema parece relevante no solo para las NPs de metales sino también para las NPs de arcillas, de minerales diversos y de componentes biológicos.

La biosíntesis de NPs se observa incluso en células humanas (^{Anshup et al., 2005}; ^{El-Said et al., 2014}), y en general en los sistemas bioquímicos derivados de seres vivos, es decir, sistemas que muestren capacidad reductora como por ejemplo los extractos frescos o secos obtenidos de organismos vegetales (^{Mittal et al. 2013}; ^{Kumar et al. 2013}; ^{Huang et al., 2015}), la miel (^{Venu et al., 2011}), el vino (^{Mittal et al., 2014}), o hasta el material obtenido de la lisis celular (^{El-Said et al., 2014}). Las NPs obtenidas pueden formar óxidos (^{Haverkamp y Marshall, 2008}) o complejos hidratados (^{Petit et al., 2015}), aunque lo que normalmente ocurre es que las NPs adquieran un recubrimiento orgánico, adsorbido en la superficie de las NPs, que aumenta su estabilidad ya que disminuye la agregación (Iravani, 2011); es decir, los agentes biológicos desarrollan una doble función: como agentes reductores y como recubrimiento.

No está claro aún si la biotransformación depende principalmente de uno o unos cuantos tipos de metabolitos o bien si lo importante es el potencial reductor global, esto es, la suma de las capacidades reductoras de todas las biomoléculas encontradas en el sistema (^{Anshup et al., 2005}). No se ha reportado ninguna limitante en cuanto a que la transformación de iones a NPs deba realizarse por medio de algún tipo de compuesto específico (^{El-Said et al., 2014}), aunque algunos autores señalan metabolitos específicos como los responsables de la biotransformación (^{Shukla et al., 2014}; ^{Huang et al., 2015}), pero sin aportar elementos que permitan excluir totalmente la acción de otras biomoléculas. Si lo que se requiere es la presencia de unos cuantos metabolitos reductores diferentes en gran cantidad se usarían organismos transgénicos o sus extractos vegetales (^{Hong-Bo et al., 2010}), o bien hiperacumuladores con innata capacidad de acumulación del elemento que se utilizará para la biosíntesis de las NPs (Iravani, 2011). Por otra parte si se necesita una gran capacidad reductora general proveniente de muchos metabolitos distintos entonces pudiera aplicarse selección genética, manipulación ambiental o manejo agronómico (^{Ortega-Ortíz et al., 2007}).

Destino de las nanopartículas en la célula o tejido. Una vez que se forman las NPs en las células o tejidos vivos a partir de los iones del elemento de interés ¿qué ocurre con ellas? Se sabe que las NPs presentan movilidad intracelular y apoplástica (^{Larue et al., 2014}), pudiendo ingresar en organelos como los cloroplastos (^{Miralles et al., 2012}), la vacuola y el núcleo (^{Kurepa et al., 2010}) por lo que es posible que se distribuyan en toda la célula. Adicionalmente se ha demostrado que las NPs de varios elementos no mayores a 100 nm se movilizan entre los diferentes órganos de la planta a través del floema (^{Rico et al., 2011}; ^{Wang et al., 2013}).

Es posible también que las NPs sean transformadas de nuevo al elemento en forma iónica, dando entonces lugar a un recambio continuo de estado del elemento de NPs a iones, verificándose así en el caso de la Ag que forma NPs inestables (^{Larue et al., 2014}), mientras que las NPs con mayor estabilidad serían aquellas de elementos como el Ce, que al acumularse causan daños por interferencia mecánica con los poros de las paredes celulares (^{Asli y Neumann., 2009}), por interacción con las proteínas modificando la conformación y funcionalidad (^{Mahmoudi et al., 2011}), o bien por interferencia con el citoesqueleto o por estrés oxidativo (^{Wang et al., 2011}). Los cambios fenotípicos observados en células u organismos completos en presencia de NPs posiblemente provengan de las interacciones antes mencionadas que ocurren en los ámbitos genómico, epigenómico, bioquímico y metabólico. El escenario general que se obtiene es de una alta movilidad entre órganos de las plantas, tanto en términos de las NPs intactas como de su recambio a la forma iónica del elemento y viceversa. Esto debe de tomarse en cuenta tanto por su potencial impacto ecológico como para propósitos de uso alimenticio de las plantas que interactúen con NPs.

Factores que regulan la biofabricación de nanopartículas en las células y tejidos vegetales. De acuerdo con ^{Haverkamp y Marshall (2008)} existen varias limitantes para la síntesis bioquímica y biológica de NPs a partir de iones en solución:

En el caso de la fabricación bioquímica con extractos vegetales el volumen finito de compuestos que aportan potencial reductor en el sistema.

La capacidad de restauración o mantenimiento del potencial reductor, que en el caso de la fabricación biológica depende de la fotosíntesis y la respiración de las reservas de carbono de las plantas, órganos o células vegetales.

Para la transformación biológica el potencial redox (potencial de reducción electroquímico estándar) de la transformación del ión del elemento a su forma de valencia cero (ejemplo de Cu⁺² a Cu⁰), es un factor a considerar, estando limitada según los autores a valores mayores a 0 Voltios (V) (potencial electroquímico relativo a un electrodo estándar de hidrógeno) y por lo tanto incluye solamente a elementos como el Au, Ag, Cu, Se, Pd, Ir, Pt, Cr, Ru y Rh. Mientras mayor sea el valor positivo de este potencial redox más fácil ocurre la biotransformación, es decir, habrá un mayor porcentaje de recuperación del elemento en su forma nanoparticulada. Otros elementos como el Zn, Ni, Pb, Tl y Cd que tienen potenciales redox menores a 0 V para la transformación de su forma iónica común a la forma con valencia cero no parecen ser susceptibles de transformarse en NPs usando células, órganos o plantas completas, pero si por medios bioquímicos, usando por ejemplo extractos vegetales (^{Kuppusamy et al., 2016}).

La forma química del elemento en solución, tanto si se encuentra en forma iónica como Ag⁺ o en forma de un complejo iónico como Ag(NH₂)₂ ⁺ ó Ag(S₂O₃)₂ ^3- también tiene un impacto en el proceso de biotransformación cuando éste ocurre intracelularmente en células en cultivo o microorganismos o bien intrasomáticamente en plantas. No se sabe con certeza porqué ocurre así pero las NPs obtenidas de iones son de mayor tamaño a las obtenidas de complejos iónicos (^{Haverkamp y Marshall, 2008}). Esta diferencia pudiera relacionarse con la facilidad de difusión o transporte (^{Anshup et al., 2005}), que a su vez se asocia con la mayor facilidad de transporte de elementos en forma iónica (normalmente cationes) por transportadores energizados por bombas de protones (^{Guerinot, 2000}) vs los complejos iónicos (que normalmente serán aniones) y que se movilizan más lentamente (^{Wright y Diamond, 1977}). No se han reportado transportadores especiales para elementos que se transforman en NPs al interior de las células, como Ag y Au, sino que esto ocurre por medio de las proteínas transportadoras utilizadas para la movilización de otros elementos como el Fe (Jain et al., 2014) o bien directamente a través de la bicapa lipídica de las células u organelos al parecer por transporte vesicular (^{Serag et al., 2012}).

La concentración de los elementos también impacta en la biosíntesis de NPs ya que al elevarse la salinidad se hace menos efectivo el transporte de los iones hacia la célula o sus diferentes compartimientos (^{Grattan and Grieve 1998}), aumentando igualmente el efecto tóxico de algunos elementos, sobre todo los no esenciales, cuando se encuentran encima de cierta concentración umbral (^{Poschenrieder et al., 2013}). Adicionalmente los cambios en la concentración y las especies químicas en solución modifican el potencial redox del sistema, lo que impacta tanto en la capacidad para biotransformar los iones en NPs como en el tamaño finalmente obtenido de dichas NPs (^{Haverkamp y Marshall, 2008}).

Una vez terminada la reacción de biotransformación de los iones a NPs el potencial reductor del sistema bioquímico tomaría menor magnitud. En el caso de un sistema vivo el potencial reductor pudiera ser igual o mayor dependiendo de la capacidad metabólica y el efecto inductivo del propio elemento en forma iónica o de sus NPs que en algunos casos da lugar a mayor capacidad antioxidante en el sistema biológico (^{Juárez-Maldonado et al., 2013}). La concentración de los iones del elemento o elementos sujetos a biotransformación disminuye en mayor o menor cantidad dependiendo del elemento de que se trate, de su forma química y de la capacidad de reducción del sistema (^{Haverkamp y Marshall, 2008}), encontrándose que la eficiencia de biotransformación con microorganismos puede ser tan alta como el 88% de la concentración inicial del metal o complejo en forma iónica (^{Suresh et al., 2011}). En el caso del uso de plantas vivas para la biofabricación de NPs se ha encontrado que especies como Brassica juncea y Medicago sativa pueden acumular hasta 3% de su peso seco en forma de nanopartículas de plata, en tiempos de 24 a 72 h, usando una solución hidropónica con 1 000 a 10 000 mg L^-1 de AgNO₃ (^{Harris y Bali, 2007}).

Escalamiento de la biofabricación de nanopartículas con plantas

Una posible limitante en el uso a mayor escala de los métodos de biotransformación con plantas o sus derivados es que la capacidad reductora del sistema (sea este un producto biológico como la miel, ácidos húmicos, un extracto fresco o bien un conjunto de células vivas) será dependiente de su composición (Iravani, 2011; Kharissova et al., 2013), siendo en principio complicada su estandarización ya que cada combinación específica de ambiente-organismo dará lugar a una composición distinta (Starnes et al., 2010). Igualmente la identidad y reactividad de la corona de las NPs será diferente dependiendo de la composición de las células o extractos (Metz et al., 2015). En el caso del uso de las plantas para la biofabricación de NPs el resultado será diferente dependiendo de la especie o variedad, de las condiciones de crecimiento (Jain et al., 2014), del elemento que se trate de biotransformar y de su concentración así como de la forma en que se aplique a la planta sea esta por la raíz (^{López-Moreno et al., 2010}) o por aspersión foliar (^{Juárez-Maldonado et al., 2013}).

Si el sistema no está bioquímicamente estandarizado entonces se dificultaría obtener NPs con ciertos estándares (Starnes et al., 2010), sobre todo tamaño, geometría y composición de la corona. La estandarización proporciona certidumbre acerca de la efectividad de las NPs. Muchos estudios reportan la obtención de NPs por medios bioquímicos o biológicos, pero son estudios realizados en una ocasión, con una especie e individuos específicos, quedando sin respuesta la reproducibilidad del fenómeno en términos de las características de las NPs.

Efectivamente, si pensamos en un proceso con cultivos en invernaderos o casas sombra, en donde ya sea por medio de la solución nutritiva o por aspersión foliar se aplique el elemento que se busca biotransformar entonces la manera de elevar la producción de NPs tendría como base las mismas técnicas o procesos usados para:

Como es difícil que la producción de NPs utilizando plantas completas compita con otros sistemas (microorganismos u órganos vegetales en bioreactores) en cuanto a la facilidad de implementación, entonces sería necesario pensar en sistemas de biofabricación de NPs con doble finalidad: un ejemplo sería la producción de forraje verde hidropónico, un sistema diseñado para la producción de biomasa optimizando el uso del agua. Si los iones para biotransformar, ejemplo Cu⁺² o Ag⁺, los introducimos en la solución nutritiva (^{Haverkamp y Marshall, 2008}) usando las concentraciones reportadas en la literatura el proceso de biotransformación ocurrirá utilizando el potencial reductor obtenido de la actividad fotosintética y respiratoria de las plantas. Al terminar el cultivo y antes de su cosecha las NPs serán cosechadas por molido y centrifugación y la pasta fresca remanente, que se espera tenga una mayor capacidad reductora por el efecto inductivo del elemento aplicado (^{Juárez-Maldonado et al., 2013}), pudiera utilizarse para la fabricación de composta o incluso para la alimentación del ganado, poniendo el debido cuidado en evitar la trasferencia trófica de NPs a los organismos animales y humanos. Es obvio que el desarrollo de un sistema de esta clase requeriría de múltiples pruebas para verificar la seguridad del mismo en cuanto a la liberación de NPs a los ecosistemas y cadenas tróficas.

Los procesos que se espera ocurran en este sistema de bioproducción de NPs acoplado a la producción de forraje verde hidropónico son los mismos que de manera natural se presentan durante la nutrición mineral de las plantas o durante una biorremediación de tierras con plantas nativas, esto es: complejación del ión, absorción, asimilación y transporte, uso y almacenamiento o excreción en casos de exceso (^{Haverkamp y Marshall, 2008}; Jain et al., 2014).