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Introducción
El aguacate (Persea americana Mill.) es un importante cultivo frutal de las zonas tropicales y subtropicales, originario del área de Mesoamérica (Premkumar et al., 2003; Galindo-Tovar et al., 2008). Es un árbol perenne de la familia Lauraceae cultivado por sus frutos, los cuales son una fuente balanceada de proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales, pero sobre todo por su alto contenido de aceites (Ben-Ya´acov y Michelson, 1995; Knight, 2002; Chanderbali et al., 2008).
Mediante la propagación tradicional de aguacate, los programas de mejoramiento para incorporar resistencia a enfermedades y otros rasgos deseables, son tardados y minuciosos debido al largo período juvenil y heterocigosidad de la especie (Ben-Ya´acov, 1987; Pliego-Alfaro y Bergh, 1992; Litz et al., 2007; Raharjo et al., 2008). De igual manera se ve afectado el uso de portainjertos a partir de semilla, los cuales no garantizan homogeneidad genética y comportamiento estable en campo (Ben-Ya´acov, 1987; Köhne, 1992). Sin embargo, la propagación clonal de aguacate se ha logrado principalmente por injerto, un proceso costoso y que consume mucho tiempo (Brokaw, 1987). Debido a esto, se deben implementar y desarrollar diversos métodos de propagación para el cultivo de aguacate (Barceló-Muñoz et al., 1999).
El cultivo de tejidos vegetales permite la propagación clonal de un gran número de plántulas en un periodo breve, bajo condiciones controladas, en espacios pequeños y con poca mano de obra, además de garantizar sanidad y estabilidad genética (Kumar y Loh, 2012). La micropropagación en aguacate está enfocada en propagar masivamente portainjertos de interés comercial, principalmente con tolerancia a enfermedades transmitidas por el suelo o con resistencia a condiciones de suelos salinos o calcáreos, así como para revitalizar material adulto que posteriormente podría multiplicarse por técnicas convencionales (Barceló-Muñoz y Pliego-Alfaro, 2003; Litz et al., 2007). Por otra parte, la recolecta y conservación de germoplasma es prioritario para iniciar los programas de mejoramiento genético de este frutal, además de evitar la erosión genética (Vidales-Fernández et al., 2011).
La comprensión de los factores que controlan el proceso de desarrollo in vitro es esencial para el establecimiento de un sistema eficiente de regeneración (Ahmed, 2002). En aguacate, la regeneración por medio de organogénesis directa ha sido reportada en la literatura; sin embargo, diversos factores pueden afectar significativamente el éxito de este cultivo como: cultivar utilizado, la composición del medio de cultivo, concentración de los reguladores de crecimiento y su interacción con el medio, tipo de explante y su etapa de desarrollo, y época de recolecta del material vegetal (Cooper, 1987; Dalsaso y Guevara, 1988; Zirari y Lionakis, 1994; Castro et al., 1995; Barringer et al., 1996; Barceló-Muñoz et al., 1999; Rodríguez et al., 1999; de la Viña et al., 2001; Vidales-Fernández, 2002; Barceló-Muñoz y Pliego-Alfaro, 2003; Nhut et al., 2008; Zulfiqar et al., 2009; Cortés-Rodríguez et al., 2011).
Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación está dirigido hacia la identificación del medio de cultivo y la combinación de reguladores de crecimiento y suplementos, adecuados para las etapas de establecimiento e inducción de brotes en dos cultivares de aguacate raza Mexicana (P. americana var. drymifolia Schltdl. & Cham).
Materiales y métodos
En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Unidad Marín, Facultad de Agronomía, UANL, durante 2013-2014, se establecieron en invernadero, plantas de aguacate de la raza Mexicana (P. americana var. drymifolia Schltdl. & Cham), de los cultivares Huevo de Toro y Mantequilla, provenientes del municipio de Aramberri, N. L., de estas se recolectó el material vegetal utilizado en la presente investigación.
Desinfestación
La pre-desinfestación consistió en seleccionar varetas de 10 a 15 cm de longitud en óptimas condiciones y con gran número de yemas axilares, considerando la medición de la parte apical hacia abajo. Las varetas se lavaron con jabón líquido y se enjuagaron con agua potable. Posteriormente fueron seccionadas en unidades más pequeñas de 2-3 cm aproximadamente. Con la finalidad de disminuir el porcentaje de fenoles, el material vegetal se colocó en una solución jabonosa por tres lapsos de 10 min c/u y en constante agitación. Seguido de tres enjuagues con agua bidestilada para proceder a colocarlos en una solución fungicidabactericida, compuesta de 2 g L-1 de Agry-Gent Plus 800 (Gowan Mexicana), 1.5 mL L-1 de Amistar Gold (Syngenta), 2 g L-1 de Antrak 500 PH (Agroquímica Tridente), 800 mg L-1 de ácido cítrico, 800 mg L-1 de ácido ascórbico y 30 g L-1 de sacarosa durante 1.5 horas en agitación, finalizando con un enjuague con agua bidestilada. En estas condiciones el material vegetal fue llevado a la campana de flujo laminar para realizar la desinfestación.
La desinfestación consistió en la inmersión del material vegetal en etanol 100% durante 1 min, seguido de una inmersión en una solución con blanqueador comercial al 50% v/v más 0.2% de Tween-20 durante 20 min. Concluido el tiempo se enjuagó tres veces con agua bidestilada esterilizada. Inmediatamente el material vegetal se colocó en una solución de PVP (polivinilpirrolidona) 400 mg L-1 para reducir la oxidación del mismo. Finalmente el material fue seccionado en explantes de 1 cm de longitud para ser utilizados posteriormente en los medios de establecimiento.
Establecimiento in vitro
El tipo de explantes utilizados fueron segmentos internodales con una o dos yemas axilares (microestacas), los cuales fueron sembrados en los medios de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) con macroelementos al 50%, DCR (Gupta y Durzan, 1985) y Yasuda (Yasuda et al., 1985), suplementados con vitaminas, 30 g L-1 de sacarosa, 2.0 mg L-1 de BAP, 0.3 mg L-1 de AIB, 2 g L-1 de oxitetraciclina, 2 g L-1 de benomilo y 4.4 g L-1 de Phytagel™. El pH se ajustó a 5.7 en los medios MS y Yasuda, mientras que en DCR fue 6, posteriormente esterilizados a 1.2 kg cm-2 de presión a 121 °C durante 15 min. Concluida la siembra, las unidades experimentales fueron incubadas a una temperatura de 26 ± 2 °C bajo un fotoperíodo de 16 horas luz durante dos semanas. Las variables que se evaluaron fueron contaminación, oxidación y viabilidad de los explantes.
Inducción de brotes
Después de 14 días del establecimiento in vitro, las microestacas viables se transfirieron a los mismos medios de cultivo modificados, los cuales fueron MS con macroelementos 50%, DCR y Yasuda, adicionados con vitaminas, 30 g L-1 de sacarosa y solidificados con 4.4 g L-1 de Phytagel™; además suplementados de las combinaciones: 20% de agua de coco (AC), 2.0 mg L-1 de BAP, 0.01 mg L-1 de AIA y 0.5 mg L-1 de AG3 (Sandoval-Prando et al., 2014); y la segunda combinación de 2 g L-1 de caseína hidrolizada (CH), 1 mg L-1 de BAP y 0.3 mg L-1 de AIB (Cuadro 1). El pH de los medios de cultivo se ajustó a 5.7 (MS y Yasuda) y 6.0 (DCR) esterilizado posteriormente a 1.2 kg cm-2 de presión a 121 °C durante 15 min. Las microestacas se incubaron bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Se evaluó el número de brotes por explante, longitud de brotes y número de hojas a 60 y 90 días después del subcultivo.
Análisis estadístico
Para la etapa de establecimiento, las variables cualitativas evaluadas fueron: contaminación, oxidación y viabilidad de los explantes a 14 días después de la siembra en los tres medios de cultivo de dicha etapa con ocho repeticiones, los cuales se incubaron bajo un diseño completamente al azar en condiciones homogéneas. Estas variables se analizaron mediante tablas de contingencia y la prueba de Ji-cuadrada. Mientras que, en la etapa de inducción de brotes, se evaluaron las variables: número de brotes, longitud de brotes y número de hojas a dos y tres meses después del establecimiento de los explantes. Estas variables se establecieron bajo un diseño completamente al azar con un arreglo factorial 2x6, donde el factor A fueron los cultivares y el factor B fueron los medios de inducción, obteniendo un total de 12 tratamientos con seis repeticiones. Se realizó un análisis de varianza con los datos previamente transformados con
Resultados y discusión
Establecimiento aséptico
La contaminación microbiana y el oscurecimiento de explantes son las mayores dificultades para el establecimiento in vitro de cultivares de aguacate de la raza Mexicana (Cortés-Rodríguez et al., 2011). El proceso de desinfestación del material vegetal tuvo diversos efectos en las variables evaluadas.
La contaminación para los medios utilizados, en los dos cultivares a 14 días de establecido el experimento, fue superior al 50%, con excepción del medio Yasuda en el cultivar Huevo de Toro con 26.66 % (Cuadro 2). Es importante señalar que esta variable se vio afectada por la presencia de hongos y bacterias, los cuales impidieron el desarrollo favorable de al menos 50% de los explantes. Resultados similares muestra Cooper (1987), con 70% de contaminación en el cultivar Duke 7, reduciendo el efecto a 16% con el uso de etanol 100% y una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) 0.5% durante 30 min. Por su parte Dalsaso y Guevara (1988), observaron el alto porcentaje de contaminación por bacterias en microestacas del cultivar Fuerte, donde el uso de bactericida en la desinfestación y tratamiento de la planta madre, no fueron efectivos para disminuir la contaminación, por lo que sugieren que el patógeno se encuentra de forma endógena, situado posiblemente en los tejidos vasculares de la porción del tallo. En contribución a lo anterior, Vidales-Fernández (2002), recomienda utilizar la combinación de Agrimycin y benomilo en la pre-desinfestación de los explantes, y una desinfestación de hasta 40% v/v de blanqueador comercial y sembrar los explantes en medio de cultivo adicionado con benomilo hasta 2 g L-1. Zulfiqar et al. (2009), reportan hasta 72% de contaminación por hongos y bacterias en microestacas del cultivar Fuerte, recomendando que 1% de NaClO es suficiente para la desinfestación del material vegetal sin dañar gravemente al explante.
Cuadro 2 Porcentajes de contaminación, oxidación y viabilidad a dos cultivares de aguacate en tres medios de cultivo después de dos semanas del establecimiento aséptico
| Cultivar/Medio | Contaminación | Oxidación | Viabilidad |
| Huevo de Toro | |||
| MS | 60.46 | 2.32 | 37.2 |
| DCR | 63 41 | 0 | 36.58 |
| Yasuda | 2666 | 0 | 73 33 |
| Mantequilla | |||
| MS | 65.9 | 6.81 | 27.27 |
| DCR | 78.72 | 0 | 21 27 |
| Yasuda | 58 69 | 0 | 41.3 |
Oxidación
En el caso de la oxidación, se hizo presente solo en el medio de cultivo MS con resultados bajos que no rebasaron el 7% en ambos cultivares (Cuadro 2). El bajo porcentaje de oxidación en los explantes puede deberse al uso de los diferentes agentes antioxidantes en los procesos de desinfestación, como el lavado del material vegetal con agua potable durante 30 min, reportado por Vidales-Fernández (2002), así como el uso de PVP reportado por Dalsaso y Guevara (1988). Investigaciones más recientes sugieren la adición de ácido ascórbico y carbón activado al medio de cultivo para reducir hasta un 70% el proceso de oxidación (Cortés-Rodríguez et al., 2011).
Viabilidad
La viabilidad de los explantes presentó valores de 22 a 37% en los medios de cultivo MS y DCR, en los cultivares utilizados. A diferencia de los anteriores, el medio de cultivo Yasuda demostró mayor viabilidad en los explantes, hasta 73.33% en el caso del cultivar Huevo de Toro. Cabe señalar que esta variable se vio afectada por el proceso de contaminación que se desarrolló en el tiempo transcurrido después del establecimiento aséptico del material vegetal (Cuadro 2).
Tablas de contingencia
Las tablas de contingencia con pruebas de Ji-cuadrada (Cuadro 3), demostraron que en los medios de cultivo MS y DCR en el tiempo establecido, las variables contaminación, oxidación y viabilidad resultaron no estar relacionadas a los cultivares utilizados, por lo que no existe relación significativa entre las variables y los cultivares (p≤ 0.05). Lo contrario sucedió para las mismas variables en el medio de cultivo Yasuda, donde muestran dependencia a los cultivares, es decir, si existe relación significativa entre la contaminación, oxidación y viabilidad con los cultivares (p≤ 0.05).
Inducción de brotes
Explantes viables provenientes de la etapa de establecimiento aséptico de ambos cultivares, se transfirieron en los medios de inducción de brotes y se evaluaron las variables número de brotes, longitud de brotes (cm) y número de hojas a los 60 y 90 días del subcultivo.
Número de brotes
La interacción de los factores cultivar x medio de inducción, demostraron que en el caso de Huevo de Toro, los medios M1 y M2 son favorables para el desarrollo de brotes, con valores de 1.32 y 1.5 brotes por explante respectivamente, (sig. p≤ 0.05) a 12 semanas del subcultivo. Los medios M3, M4, M5 y M6, no propiciaron el desarrollo de brotes en el cultivar Huevo de Toro. Mientras que en el caso del cultivar Mantequilla, el medio M3, resultó ser el más favorable en el crecimiento de brotes en los tiempos evaluados, 1.89 y 2.14 brotes por explante (sig. p≤ 0.05). En significancia continuaron los medios M2 y M6 con valores de 1.13 a 1.5. No se presentó la formación de brotes en los medios M1, M4 y M5 en el cultivar Mantequilla (Cuadro 4; Figura 1). Resultados semejantes se han obtenido en el mismo tipo de explante, pero con modificaciones en la cantidad de reguladores de crecimiento utilizados, en diferentes cultivares, época de desarrollo, así como tipo y concentración de sales en el medio de cultivo; considerando que todos son constantes en el uso de BAP (0.1 hasta 5 mg L-1) adicionado al medio de cultivo (Cooper, 1987; Dalsaso y Guevara, 1988; Barceló-Muñoz et al., 1999; VidalesFernández, 2002; Zulfiqar et al., 2009; Cortés-Rodríguez et al., 2011). Sandoval-Prando et al. (2014), mencionan que los reguladores de crecimiento desempeñan un papel clave en el desarrollo cualitativo y cuantitativo de los brotes.
Cuadro 4 Comparación de medias de la interacción cultivar por medio de inducción, en las variables número y longitud de brotes y número de hojas en el tiempo evaluado.
| Cultivar | Variable | Semana | Medio de inducción | Tukey† | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| Huevo de Toro | Brotes | 8 | 1.32 a | 1.19 a | 1.0 b | 1.0 b | 1.0 b | 1.0 b | 0.176 |
| 12 | 1.32 a | 1.5 a | 10 b | 10 b | 10 b | 10 b | 0261 | ||
| Longitud†† | 8 | 1.08 a | 1.09 a | 10 b | 10 b | 10 b | 10 b | 0 051 | |
| 12 | 1 09 a | 1.07 a | 10 b | 10 b | 10 b | 10 b | 0 038 | ||
| Hojas | 8 | 1.2 a | 1.0 b | 10 b | 10 b | 10 b | 10 b | 0 169 | |
| 12 | 1.21 a | 12 a | 10 b | 10 b | 10 b | 10 b | 0 151 | ||
| Mantequilla | Brotes | 8 | 1.0 c | 1.41 b | 1.89 a | 10 c | 10 c | 1.13 c | 0 176 |
| 12 | 10 c | 1.5 b | 2.14 a | 10 c | 10 c | 1 34 b | 0261 | ||
| Longitud†† | 8 | 10 c | 1.03 c | 1.23 a | 10 c | 10 c | 1 13 b | 0 051 | |
| 12 | 10 c | 1 02 c | 1.21 a | 10 c | 10 c | 1 08 b | 0 038 | ||
| Hojas | 8 | 1.0 d | 1 21 c | 2.28 a | 1.0 d | 1.0 d | 1 45 b | 0 169 | |
| 12 | 1.0 c | 1 21 b | 2 38 a | 1.0 c | 1.0 c | 1.3 b | 0 151 | ||
†Medias con la misma letra en cada fila no muestran diferencia significativa, Tukey sig. p≤ 0.05. ††Longitud en cm.
Barra: 1 cm.
Figura 1 Respuesta de los cultivares de aguacate utilizados en los medios de inducción de brotes a 8 semanas. a-b: cultivar Huevo de Toro; c-d: cultivar Mantequilla. a: M1; b: M2; c: M2; d: M3.
Estos resultados al igual que investigaciones previas, indican que el BAP, juega un importante papel en la inducción de brotes y su longitud en explantes de aguacate (Barceló-Muñoz y Pliego-Alfaro, 2003; Zulfiqar et al., 2009; Cortés-Rodríguez et al., 2011; Sandoval-Prando et al., 2014). Sin embargo, Barceló-Muñoz y Pliego-Alfaro (2003) y Cortés-Rodríguez et al. (2011), mencionan que altas concentraciones de este regulador no solo reducen el número de brotes formados, sino que además detiene el crecimiento de los mismos.
Sandoval-Prando et al. (2014), indican que el uso de agua de coco en el medio de cultivo, normalmente no es suficiente para promover una multiplicación satisfactoria, por lo que sugieren su combinación con BAP y AG3.
Longitud de brotes
De acuerdo a la interacción cultivar por medio de inducción, en el cultivar Huevo de Toro, los medios M1 y M2 son propicios para el crecimiento de los brotes, presentándose en valores de 1.07 a 1.09 cm en los tiempos evaluados (sig. p≤ 0.05). Sin embargo, no se presentó crecimiento de los brotes en los medios M3, M4, M5 y M6 en este cultivar. En el cultivar Mantequilla, el medio M3 fue el más satisfactorio en el crecimiento de los brotes en los tiempos evaluados, 1.23 y 1.21 cm respectivamente (sig. p≤ 0.05). En los medios M6 y M2 se observaron resultados menores, en valores de 1.02 a 1.13 cm; mientras que en los medios M1, M4 y M5 no se presentó el crecimiento de brotes (Cuadro 4; Figura 1). Estos resultados coinciden con trabajos anteriores donde se reporta un crecimiento de 0.89 hasta 2.5 cm en diferentes cultivares de aguacate, utilizando los medios de cultivo MS con macroelementos modificados y DF (Dixon y Fuller, 1976); ambos con la presencia de BAP en concentraciones de 0.5 a 5.0 mg L-1 (Dalsaso y Guevara, 1988; Rodríguez et al., 1999; Zulfiqar et al., 2009; Cortés-Rodríguez et al., 2011). Vidales-Fernández (2002), menciona que la reducción de los macroelementos en el medio MS resulta benéfico para el desarrollo de brotes, pero induce una reducción de los mismos y por consecuencia una menor cantidad de yemas axilares. Esto puede sugerir el bajo crecimiento de los brotes en los tratamientos utilizados, ya que el medio MS se utilizó con macroelementos al 50%, mientras que el Yasuda es una modificación del MS con macroelementos al 25% y vitaminas de Gamborg (Gamborg et al., 1985); el medio DCR difiere en la cantidad de nitrato de amonio y nitrato de potasio y además se complementa con la adición de nitrato de calcio.
Número de hojas
La cantidad de hojas desarrolladas en el cultivar Huevo de Toro, fue en mayor grado en los medios M1 y M2, con hasta 1.21 hojas por brote (sig. p≤ 0.05). De igual forma los medios M3, M4, M5 y M6 no presentaron la formación de hojas en los explantes utilizados. Con respecto al cultivar Mantequilla, el medio Yasuda + AC, BAP, AG3 y AIA, presentó los mayores valores en la formación de hojas, en el los tiempos evaluados, 2.28 y 2.38 respectivamente (sig. p≤ 0.05). En significancia continua el medio Yasuda + CH, BAP y AIB, con valores de hasta 1.45 hojas por brote. Se presentaron resultados menores en el medio M2, 1.21 hojas por brote. Los medios M1, M4 y M5 no provocaron la inducción de hojas en este cultivar (Cuadro 4; Figura 1). Estos resultados son bajos comparándolos con lo reportado por Zirari y Lionakis (1994), para los cultivares Topa-Topa, Fuerte, Hass y Duke con valores de 3.9 hasta 8.25 hojas por explante, utilizando material etiolado y no etiolado en medio MS de doble fase. De igual forma, de la Viña et al. (2001), obtuvieron valores de hasta 4.8 hojas por microestaca en el cultivar RR-86, utilizando el medio de cultivo MS con 50% de macroelementos y 1.3 µM de BAP. Dalsaso y Guevara (1988), aportaron que las microestacas del cultivar Fuerte, presentan hojas muy desarrolladas de lámina totalmente extendida, a diferencia de utilizar yemas axilares, las cuales separadas de la porción del tallo, quedan libres de las correlaciones que estas tenían con el tejido e inician un proceso morfogenético diferente, modulado por la capacidad interna y el medio de cultivo.
Conclusiones
En la etapa de establecimiento, los tres medios de cultivo permitieron el desarrollo de los explantes; sin embargo, el medio Yasuda favoreció la mayor viabilidad. En la etapa de inducción de brotes, los medios M1 y M2, son los más satisfactorios para iniciar la presencia, proliferación, longitud y número de hojas para el cultivar Huevo de Toro. En comparación con el cultivar Mantequilla, el medio M3 es el que presenta los mayores valores para la formación y crecimiento de brotes y desarrollo de hojas.
