Introducción

Brachiaria brizanta (Hochst. ex A. Rich.) Stapf., es una planta perenne originaria de África tropical perteneciente a la familia Poaceae. En México, fue introducida como variedad Insurgente y, debido a su alto rendimiento de forraje de buena calidad y excelente aceptación por el ganado, es una de las especies forrajeras más utilizada por los ganaderos de áreas tropicales (^{Peralta, 1990}); sin embargo, la baja disponibilidad y calidad de semilla, son factores limitantes de la expansión y renovación de las áreas cultivadas de esta especie forrajera; además de lo anterior, la presencia de latencia de la semilla (^{Humphreys y Riveros, 1986}; ^{García y Císero, 1992}; ^{Meschede et al., 2004}), es otro factor del poco éxito obtenido en el establecimiento de praderas de esta importante especie.

La latencia es el estado en el cual, las semillas a pesar de tener las condiciones normales del medio ambiente para su germinación, no lo hacen, debido a mecanismos físicos y f isiológicos de la misma (^{Copeland, 2001}). Esta característica es el factor de mayor importancia que afecta la germinación de las semillas del género Brachiaria y, en consecuencia, limita el establecimiento adecuado de las praderas (^{Quero- Carrillo et al., 2014}). Las causas principales de la latencia en semillas de gramíneas incluyen la presencia de embriones inmaduros (^{Hopkinson et al., 1998}), impermeabilidad de la cubierta de la semilla al agua y gases, requerimientos especiales de temperatura y luz, presencia de inhibidores (en brácteas accesorias y embrión) y restricciones mecánicas del embrión para el crecimiento y desarrollo o exersión y extensión de la radícula en la germinación. Sin embargo, la latencia de la semilla se elimina de manera natural con un periodo de “capacitación” de ésta, mediante su almacenamiento entre tres a ocho meses (Enríquez y Quero, 2007), dependiendo de las condiciones climáticas del lugar donde se almacenan. Por tanto, si la semilla se utiliza para el establecimiento de praderas, inmediatamente después de la cosecha, es posible que tenga baja o nula germinación y, por tanto, se fracase en el establecimiento de la pradera (Enríquez y Quero, 2007). Sin embargo, esta limitante de las semillas, se puede mejorar de manera artificial mediante el empleo de métodos de escarificación previos a la siembra (^{García y Cícero, 1992}; ^{Camacho, 1994}; ^{Enríquez y Quero, 2006}).

Entre los métodos para interrumpir la latencia en semillas se encuentran: pre-refrigeración, diferentes combinaciones de temperatura, solución de nitrato al 0.2%, ácido giberélico, prelavado, pre-secado, ácido sulfúrico, entre otros (^{Faria et al., 1996}). Temperatura elevada a 70 ^oC por 15 h ha resultado en reducción de la latencia en semilla de B. brizantha variedad Marandú, con mejoras en la germinación y sin deterioro de la viabilidad (^{Martins y da Silva, 2001}); similarmente, en Aelurpus lagopoides, se ha demostrado que temperaturas medias alternas (20/30 ^oC), mejoran la germinación en esta especie de clima templado, por lo que la temperatura es un factor importante para este propósito (^{Gulzar y Kahn, 2001}).

En Brachiaria hybrido variedad Mulato, almacenada en bodega y cuarto protegido en Tailandia (^{Hare et al., 2008}), indican que la germinación se eleva a 78% a los cuatro meses de almacenado en bodega y toda la semilla muere a los 20 meses; contrariamente a su almacenamiento en cuarto protegido y a temperatura ambiente fresca, alcanzando 80% de germinación a 14 mes de poscosecha y conservándose a estos niveles de germinación durante tres años. En Buffel (Cenchrus ciliaris L.) temperaturas alternas de 25 y 35 ^oC resultaron en mejor viabilidad, vigor y velocidad de germinación y germinación total (^{Machado et al., 2013}). La temperatura de germinación para B. brizantha ha sido reportada en 25 °C y con escotoperiodo ausente (^{Chiodini y Araujo, 2013}).

El ácido sulfúrico es uno de los métodos químicos más recomendado para la ruptura de la latencia en semillas recalcitrantes de especies forrajeras tropicales. Varios estudios han mostrado la efectividad del ácido sulfúrico en mejorar la germinación de semillas de B. brizantha (^{Faria et al., 1996}; , ^{Martins y Da Silva, 2003}; ^{Usberti y Martins, 2007}), ya que disuelve, agrieta y debilita las cubiertas de la espiguilla y, principalmente las de la palea coriácea fusionada al cariópside en Panicoideae, por tanto en el género Brachiaria, lo cual permite la entrada de agua e intercambio de gases necesarios para el proceso de germinación, con lo que se facilita la expansión del embrión y salida de radícula (^{Ramos, 1975}; ^{Zulay et al., 1998}). Sin embargo, en la práctica, el uso de este tratamiento es escaso y una de las razones es que presenta riesgos de seguridad durante su manejo y aplicación.

^{Meschede et al. (2004)}, indican que la remoción de glumas del cariópside presentó los mejores resultados de germinación en tres lotes de semillas de B. brizantha cv. Marandú, con un promedio de 60.3%. En este sentido se ha indicado que la presencia de lema y palea coriácea unida al cariópside e inhibidores, son causa de latencia de las semillas del género Brachiaria, lo cual dificulta su germinación (^{Quero et al., 2007}). Sustancias hormonales como ácido giberélico, se han recomendado para mejorar la germinación de semillas de gramíneas forrajeras tropicales y templadas; sin embargo, se requiere de información que permita su uso y de aplicación práctica, para la utilización en el mejoramiento de la germinación de semillas forrajeras, para el establecimiento de praderas, en nuestro país. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de diversos tratamientos estimuladores de la germinación de semilla de Brachiaria brizanta cv. Insurgente.

Materiales y métodos

El estudio se desarrolló en el Laboratorio de Análisis de Semillas del Instituto de Recursos Genéticos y Productividad (IREGEP) del Colegio de Posgraduados, Campus Montecillo. Se utilizaron dos lotes de semillas de Brachiaria brizanta cv. Insurgente, cosechados manualmente el 28 de septiembre (otoño; lote 1) y 21 de diciembre (invierno; lote 2) del año 2007, en la misma pradera, en el campo Experimental de la Universidad del Papaloapan ubicada en Loma Bonita, Oaxaca.

La cosecha de semilla se realizó en forma manual, utilizando la técnica tradicional para gramíneas tropicales (^{INIFAP, 1989}); la cual, consiste en cortar las inflorescencias presentes y, posteriormente, someterlas a un proceso de sudado natural, el cual incrementa la madurez de semillas con buen desarrollo del embrión y alto contenido de humedad y facilita, al acelerar su desecación en la planta, el desprendimiento de las mismas. Para simular el proceso de sudado, las inflorescencias cosechadas se colocaron sobre un plástico en la pradera de B. brizantha y se cubrieron con el material vegetal remanente, después de haber cortado las inflorescencias. El periodo de sudado fue de cuatro días. Posteriormente, se realizó un proceso de sacudida de inf lorescencias, limpieza y secado a la sombra de la semilla, en forma natural. La semilla obtenida se envasó en bolsa de papel de estraza y se almacenó en condiciones ambientales de laboratorio (obscuridad a 18 °C constantes), en Montecillo, Texcoco, Estado de México.

Al inicio del estudio, se determinó la calidad física y fisiológica de ambos lotes de semilla, en términos de: pureza física; peso de 1 000 semillas; y viabilidad, mediante prueba de tetrazolio (Cuatro 1). Se evaluaron siete tratamientos de escarificación manual y química, con ácido sulfúrico (H₂SO₄) al 98% de concentración y ácido giberélico AG₃; (Cuadro 2). Se utilizó un diseño completamente al azar, con cuatro repeticiones de 100 semillas por tratamiento. Posterior a la aplicación de los tratamientos de escarificación, se evaluó el porcentaje de germinación de semillas de cuatro, cinco y seis meses de cosechada (lote 1) y dos, tres, cuatro, cinco y seis meses poscosecha (lote 2), mediante prueba de germinación estándar. Las semillas se colocaron en cajas “sandwicheras” 14 x 14 x 5.5 cm, con tapa, provistas de papel absorbente y colocadas dentro de cámara germinadora a temperatura de 25 ± 1 °C; 8 y 16 horas luz: oscuridad, respectivamente y humedad relativa de100%, durante 21 días (ISTA,2005).Las semillas y material utilizado en la prueba de germinación, se desinfectó con cloro al 5%, durante 5 min y, posteriormente, se enjuago con agua destilada (^{Meschede et al., 2004}).

En tratamientos basados en ácido sulfúrico, después del periodo de inmersión de las semillas, éstas se lavaron en agua corriente, durante 5 min, con la finalidad de retirar residuos de ácido sulfúrico (^{García y Cícero, 1992}). El conteo de plántulas se inició a partir del día ocho después de la siembra y culminó el día 20, después de haber realizado la siembra respectiva; es decir, un periodo de 12 días para la expresión del potencial de germinación, para todos los tratamientos.

Los datos obtenidos, se sometieron a Análisis de Varianza para detectar diferencias entre tratamientos. La comparación de medias de tratamientos se efectuó mediante la prueba de Tukey, con un nivel de significancia de 0.05 (^{SAS, 1998}). Todos los valores se transformaron previamente a arco seno (%)/100, para normalizar su distribución y, posteriormente, transformados al valor original, para su discusión.

Resultados y discusión

Los porcentajes de germinación de la semilla obtenidos en los diferentes tratamientos de escarificación para el Lote 1, con 4, 5 y 6 meses de almacenamiento, mostraron diferencias (p< 0.05; Cuadro 3). Se observaron diferencias significativas entre tratamientos (p> 0.01) a cuatro meses de almacenamiento, el mayor valor de germinación (58%) se obtuvo con el tratamiento de inmersión de cariópsides en AG₃ a concentración de 400 ppm, durante 5 minutos (T4), valor similar (p> 0.05) a los obtenidos con los tratamientos T3 y T2 (55 y 52%, respectivamente), pero diferente y superior (p> 0.05) al tratamiento T1 (control), el cual presentó un valor de germinación de 11.5%. Un comportamiento similar al anterior, se observó a 5 y 6 meses de almacenamiento, donde los valores más altos se obtuvieron con los tratamientos T4, T3 y T2.

El tiempo de almacenamiento (considerado como tiempo de capacitación normal de la semilla de gramíneas tropicales) tuvo efecto positivo sobre la germinación. La semilla con seis meses de almacenamiento mostró la mayor germinación, independientemente del tratamiento de escarificación, los mayores valores (80 y 76%) se registraron a seis meses de almacenamiento, con los tratamientos T4 y T3, respectivamente. Es notorio que el uso de ácido sulfúrico concentrado no superó la utilización de AG₃ y, el hecho de que el cariópside sin tratamiento mostrara la menor germinación indica la ausencia de este estímulo en el embrión, lo que puede interpretarse como latencia impuesta por la condición del embrión en esta especie: presencia de inhibidores y falta de promotores adecuados por inmadurez, para lograr la germinación.

Los porcentajes de germinación de la semilla obtenidos en los diferentes tratamientos de escarificación para el lote 2 con dos, tres, cuatro, cinco y seis meses de almacenamiento mostraron diferencias significativas entre tratamientos p> 0.01; (Cuadro 4). A dos meses de almacenamiento, el mayor valor de germinación (55.6%) se observó con el tratamiento T4, valor que fue similar (p> 0.05) a los obtenidos con los tratamientos T3 yT2 (51 y 46%, respectivamente), pero diferente y superior (p> 0.05) a los demás tratamientos, principalmente con respecto al control; el cual presentó un valor de germinación de 3%. Un comportamiento similar al anterior, se observó a tres, cuatro, cinco y seis meses de almacenamiento, donde los valores más altos de germinación se obtuvieron con los tratamientos T4, T3 y T2; esto es, la respuesta a los promotores de la germinación no se ve afectada por la edad post-cosecha de la semilla. Al igual que en el lote 1 (lote de otoño), se observó un incremento en el porcentaje de germinación, independientemente del tratamiento de escarificación, conforme se incrementa el tiempo de almacenamiento de la semilla. Los valores más altos (92.5, 92.4 y 86.4%) se registraron a los 6 meses poscosecha, con los tratamientos T4, T3 y T2, respectivamente.

Los resultados encontrados en este estudio indican que todos los tratamientos de escarificación evaluados, independientemente del lote, incrementaron el porcentaje de germinación de las semillas de pasto Insurgente, en comparación con el control y, los mejores tratamientos de escarificación fueron la combinación de remoción manual de las estructuras (brácteas accesorias -gluma, lemas y palea) que envuelven al cariópside y la posterior inmersión del cariópside en solución de ácido giberélico a una concentración de 300 y 400 ppm, durante 5 minutos.

El incremento del porcentaje de germinación de las semillas al remover sus estructuras se debió a que se permitió la entrada de agua e intercambio de gases, lo que facilitó la expansión del embrión y la consecuente exerción de la radícula (^{Zulay et al., 1998}; ^{Mérola y Díaz, 2012}). En el caso de la posterior inmersión de las cariópsides en solución de ácido giberélico, ésta promueve la penetración de éste hacia el embrión, a través de la testa agrietada al embrión, promoviendo su crecimiento y, en consecuencia, mayor germinación.

Resultados similares fueron reportados por otros investigadores (^{Meschede et al., 2004}), quienes al evaluar tratamientos para romper latencia en tres lotes de semilla de B. brizantha cv. Marandú, encontraron que la remoción de glumas fue el tratamiento que presentó los mayores valores de germinación, con 60%. Esta misma repuesta fue reportada por otros autores (^{Vieira et al., 1998}), quienes al evaluar diferentes tratamientos de escarificación en cariópsides de B. brizantha cv. Insurgente, encontraron que los tratamientos evaluados siempre fueron superiores al control.

En esta misma especie, otros autores (^{Faria et al., 1996}; ^{Martins y Da Silva, 2003}; ^{Usberti y Martins, 2007}), han reportado que la inmersión de las semillas en ácido sulfúrico, durante 5 a 15 minutos, mejora la germinación en más de 30% en comparación con el testigo. Por otra parte, se utilizaron semillas de Brachiaria brizantha cv. Marandú, sometidas a inmersión durante 4 min en H₂SO₄ diluido al 50% encontrando 34% de germinación, siendo el tratamiento de mejor respuesta comparado contra otros siete tratamientos (^{Martínez et al., 2013}). El incremento en la germinación fue debido al hecho de que el ácido disolvió parte de la palea y lema de la espiguilla, causo grietas y debilitó dichas cubiertas de la espiguilla, lo cual permitió la entrada de agua e intercambio de gases, facilitando la expansión del embrión y salida de la radícula (^{Ramos, 1975}; Sulay et al., 1998). Se ha indicado que, en semillas del género Brachiaria, la presencia de lema y palea coriácea unida al cariópside dificulta la germinación (^{Quero et al., 2007}), ya que impide la absorción de agua ocasionando fallas en ésta que resultan en recalcitrancia de la semilla (^{Jiménez, 1990}).

Se observó, en ambos lotes de semilla, que las diferencias en porcentajes de germinación obtenidos con los diferentes tratamientos de escarificación, en comparación con el control, fueron más amplias a dos (lote 1) y cuatro (lote 2) meses de almacenamiento de la semilla, lo que indica una clara efectividad de los tratamientos de escarificación evaluados para incrementar la germinación de las semillas recién cosechadas de B. brizantha cv. Insurgente y, similarmente, una respuesta diferente entre semilla cosechada en otoño y la cosechada en invierno.

La efectividad de los tratamientos de escarificación fue menor a medida que se aumentó el periodo de almacenamiento de semilla. Lo anterior, ha sido reportado para B. humidicola, donde la escarificación con ácido sulfúrico concentrado tuvo mayor efecto durante los primeros nueve meses de almacenamiento de la semilla (^{Costa et al., 2011}). Por ejemplo; en el lote 1, con el mejor tratamiento de escarificación (inmersión de cariópsides en solución de ácido giberélico a una concentración de 400 ppm) de cuatro a cinco meses de almacenamiento, se obtuvo un incremento de la germinación de 33%; mientras que, de cinco a seis meses de almacenamiento, el aumento fue tan solo de 4%. Un comportamiento similar al anterior se observó para el Lote 2, donde en el periodo de dos a tres meses de almacenamiento, el incremento de germinación fue de 179%; mientras que, de cinco a los seis meses de almacenamiento, el aumento fue de tan solo el 1%. Lo anterior confirma el proceso de maduración del embrión y la menor necesidad de estímulos externos como el ácido giberélico y/o tratamientos agresivos de ácido sulfúrico más allá de la apertura del intercambio de gases y el debilitamiento de estructuras para la exerción de radícula y plúmula. Por otra parte, los bajos porcentajes de germinación (11.5 y 3%) obtenidos con el tratamiento control a cuatro meses de almacenamiento (lote 1) y dos meses de almacenamiento (lote 2) respectivamente, corroboran los altos niveles de latencia de semilla en esta especie forrajera, misma que es impuesta por el embrión.

Se ha indicado que la semilla de B. brizantha presenta elevada latencia (^{Humphreys y Riveros, 1986}; ^{García y Cícero, 1992}; ^{Enríquez y Quero, 2006}, Ascorra y Lara, 2003), la cual se elimina en forma natural durante el almacenamiento de dos a ocho meses; o bien, de manera artificial, mediante aplicación de tratamientos de escarificación mecánica y química (Enríquez y Quero, 2006). ^{Azcorra y Lara (2003)}, al evaluar el efecto del tiempo del almacenamiento en la germinación de la semillas de B. brizantha encontraron valores de germinación de 2, 3 y 48% a 0, 3.5 y 6.5 meses de almacenamiento, respectivamente.

La baja germinación de las semillas en los primeros meses, después de ser cosechadas, se debe a que ésta bloqueada por las estructuras vigorosas que cubren el cariópside (palea y lemas); similarmente, por la condición de presencia de inhibidores y/o falta de respuesta a condiciones de germinación y a estimuladores de ésta por parte del embrión inmaduro o con exceso de inhibidores. ^{Vieira et al. (1998)}, indicaron que la latencia no es solo por las estructuras duras de las semillas, si no que existe otro mecanismo de latencia atribuido a la presencia de sustancias inhibidoras de la germinación presente en el embrión, o bien, por la ausencia de sustancias promotoras del crecimiento, lo que implica que, para que las semillas germinen, es necesario eliminar los componentes inhibidores presentes por medio de la separación manual de las cubiertas o mediante el uso de sustancias químicas como ácido sulfúrico y sustancias promotoras del crecimiento como el ácido giberélico.

El presente estudio también reveló una mejor germinación en el lote 1 (otoño) comparado con el lote 2 (invierno). En el Lote 1, las semillas sin tratamiento de escarificación a cuatro meses de almacenamiento presentaron una germinación de 11.5%; mientras que, para el lote 2, en el mismo periodo de almacenamiento, el porcentaje de germinación fue de 22.9 %. Lo anterior, es respuesta al ambiente de maduración de la semilla en la planta madre y dos aspectos son notoriamente diferentes en estas épocas: temperaturas nocturnas decrecientes y escotoperiodos mayores, los cuales son difíciles de documentar sin estrategias adecuadas para su discernimiento.

Asimismo, para el lote 1 (cosecha de otoño), con el mejor tratamiento de escarificación (inmersión del cariópside en solución de ácido giberélico a 400 ppm de concentración) y a cuatro meses de almacenamiento, se obtuvo una germinación de 58%; mientras que para el lote 2 (cosecha de Invierno), a cuatro meses de almacenamiento se observó una germinación de 90%. Este resultado se atribuye a la mejor calidad física y fisiológica de las semillas del lote 2, como respuesta a las condiciones ambientales de fertilización, desarrollo y maduración en la planta madre. En este sentido, se ha indicado que la baja germinación de las semillas recién cosechadas se debe a la presencia de embriones que no se han desarrollado completamente (^{Hopkinson et al., 1998}; ^{Enríquez y Quero, 2006}).

Otro factor implicado puede ser la velocidad del desarrollo del callo de abscisión que se encuentra por debajo de las glumas (^{Enríquez et al., 2005}), el cual puede ser más lento a menor temperatura; lo anterior, permitiría la mejor nutrición del embrión por fotosintatos de la planta madre, durante su desarrollo, dado que la calosa (carbohidrato que forma una barrera entre la planta madre y la semilla en desarrollo) que reduce la comunicación entre la semilla y la planta madre, provoca la caída de la semilla y ésta se formaría con mayor lentitud a menor temperatura y en respuesta a las horas luz. La mejor nutrición por un periodo mayor puede resultar en embriones mejor desarrollados, resultando en semillas con embriones más resistentes al ambiente y responsivos a condiciones o promotores de la germinación, mejor relación embrión: endospermo, entre otros aspectos.

Conclusiones

Los tratamientos de escarificación mejoraron la germinación de la semilla del pasto Insurgente, respecto a la espiguilla completa. Los mayores valores de germinación se obtuvieron con la eliminación de brácteas florales (gluma, lema y palea) con inmersión de las cariópsides en solución de ácido giberélico a concentración de 300 y 400 ppm, durante 5 min. La eliminación de brácteas accesorias de la cariópside y el efecto del ácido giberélico mejoran la germinación en Brachiaria brizantha. La semilla de mejor calidad germinativa fue la cosechada en invierno; por tanto, el manejo de inducción f loral puede programaras para que la maduración de la misma ocurra durante la segunda quincena de diciembre. Se sugiere continuar con este estudio, con la finalidad de determinar con mayor precisión el mejor método de promoción de la germinación en semillas del género Brachiaria.