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Introducción
Physalis ixocarpa es una especie originaria de México, se conoce como tomatillo, tomate verde, tomate de cáscara, tomate de fresadilla. En 2014 fue la quinta hortaliza en superficie más sembrada, con 46 524.96 ha y un rendimiento promedio nacional de 14.94 t ha-1 (SIAP-SAGARPA, 2014). La importancia de esta hortaliza se debe a su alto consumo en México y a su exportación a los Estados Unidos de América y Canadá. A pesar de existir amplia variabilidad genética tanto en el tomate silvestre como en el domesticado en México (Santiaguillo et al., 2004), el rendimiento medio nacional es considerado bajo.
La autopoliploidía es un estado biológico inducible caracterizado por la duplicación del número de genomas de un mismo individuo, con lo cual se logra incrementar la variabilidad genética, que puede ser aprovechada por los fitomejoradores. La autopoliploidía incrementa el tamaño efectivo de la población e incrementa la flexibilidad genómica, facilitando así el manejo de la selección artificial. La redundancia genética puede permitir la divergencia adaptativa de genes duplicados (Parisod et al., 2010). En este sentido Robledo et al., (2011) desarrollaron una población autotetraploide 2n=4x=48, mediante la utilización de colchicina en la variedad Rendidora.
El material resultante es prometedor para obtener nuevas variedades o híbridos de alto crecimiento y calidad (Robledo et al., 2011) y de acuerdo con lo que mencionan Tang et al., (2010) de que la poliploidización es una tendencia importante en la evolución de las plantas, que tiene muchas ventajas sobre los diploides y debido a que se desconoce el impacto de la auto poliploidización artificial a nivel histológico y morfológico en tomate de cáscara, se planteó el siguiente objetivo; estudiar la histología y morfología de plantas autotetraploides y diploides (Rendidora) de tomate de cáscara previamente formados por la acción de colchicina, ya que el conocimiento anatómico de los autotetraploides artificiales de tomate de cáscara aportará datos para el entendimiento básico de la inducción de autopoliploidía en esta especie.
Materiales y métodos
Establecimiento en campo
El experimento se llevó a cabo en 2011 en General Cepeda Coahuila y Laboratorio de Citogenética de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Saltillo, Coahuila. El material vegetal utilizado consistió de tres autotetraploides (11,16 y 20) seleccionados en base a rendimiento y calidad de fruto y el diploide (19) rendidora. Las poblaciones fueron sembradas depositando de dos a tres semillas por cavidad, en charolas de poliestireno de 200 cavidades, utilizando como sustrato turba y perlita en una proporción de 1:1. Las charolas se llevaron a invernadero donde se desarrollaron las plántulas y cuando alcanzaron de 10 a 12 cm de altura y dos pares de hojas verdaderas, las plántulas fueron trasplantadas a campo abierto a surcos con acolchado plástico de color negro, de 5 m de largo y 1.8 m de ancho y con una separación de 60 cm entre plantas y dos hileras por surco con una separación de 30 cm entre hileras. Diez días después del trasplante se realizó un aclareo dejando solamente una plántula por punto. Los tratamientos se establecieron bajo un diseño experimental de bloques al azar, con cuatro repeticiones, cada tratamiento constituido por 10 plantas. La nutrición se aplicó vía riego, tres veces por semana, los riegos fueron diarios, se aplicaron dos litros por día por planta hasta los 45 días después del trasplante, posteriormente se incrementó a cuatro litros por día por planta.
Caracterización morfológica
A los 60 días después del trasplante, se evaluaron las siguientes variables morfológicas en diploides y tetraploides: ancho (AH) y largo (LH) de hoja, diámetro de tallo en cm (DT), diámetro de flores en cm (DF), altura de planta en cm (AP), estas variables se midieron en tres plantas tomadas al azar de cada tratamiento en cada una de las cuatro repeticiones, dando un total 12 plantas de cada población. Las mediciones fueron con un vernier digital de precisión marca AutoTEC®, la altura de planta fue medida mediante una cita métrica en cm. Estas variables se evaluaron con la finalidad de caracterizar a las poblaciones tetraploides e identificar cambios morfológicos inducidos por la poliploidización en plantas de tomate de cáscara.
Estudio histológico
Se tomaron muestras a los 60 días después de la siembra, tres plantas por tratamiento de cada repetición fueron llevadas al laboratorio, se cortó un fragmento de tejido (2 cm) de la raíz principal a 3 cm bajo la superficie del suelo, fragmento de tejido (2 cm) del tallo a 10 cm sobre la superficie del suelo, además de la base de la primera hoja se obtuvo un fragmento de tejido (aproximadamente 1 cm2) tomando como referencia la nervadura central y un fragmento de pecíolo (2 cm) de la primera rama de cada planta, los tejidos fueron procesadas por la técnica histológica de la parafina como sigue: Para conservar los tejidos con un mínimo de alteraciones fueron colocados en frasco de vidrio de 15 ml con fijador FAA (Formaldehído (36-40%) 5 cc, alcohol etílico al (70%) 90 cc y ácido acético glacial 5 cc). Posteriormente las muestras fueron deshidratadas en concentraciones de alcohol etílico al 50, 60, 70, 85 y 96%, más eosina, continuando con alcohol etílico absoluto I, alcohol etílico absoluto II, alcohol etílico absoluto más xilol en proporciones volumen de 3:1, alcohol etílico absoluto más xilol en proporciones de 1:1, alcohol etílico absoluto más xilol en proporciones de 1:3 por último los tejidos pasaron a xilol puro y permanecieron en cada solución por espacio de 2 h, y embebidas en parafina con punto de fusión en 58 °C posteriormente se sustituyó el alcohol con xilol (Hernández, 1990; Jáuregui, 2003; Cañizares et al., 2005).
Se realizaron cortes transversales de tejidos a 20 micras con un microtomo rotatorio, los cuales se montaron en porta objetos. Para la tinción se usó la doble coloración de safranina-fast green, donde pasaron por diferentes soluciones de alcohol y xilol, se sacaron las preparaciones del último xilol y se escurrieron. Se sellaron con una gota de bálsamo de canadá y un cubreobjetos del tamaño del tejido.
Así las preparaciones se pusieron a secar en un horno a 30 ºC una semana. Posteriormente los tejidos fueron analizados con la ayuda de un microscopio con cámara digital integrada Pixera Wiender Pro, se seleccionaron las mejores muestras y se fotografiaron con los objetivos 10X y 40X (Wilkinson, 1979). Las mediciones fueron a partir de imágenes digitales, con un software de medición Axion Vision Rel. 4.8. Las variables evaluadas fueron área de vasos de xilema de la nervadura central de la hoja (AXH), vasos de xilema del pecíolo (AXP), vasos de xilema de raíz principal (AXR), y vasos de xilema del tallo (AXT), parénquima en empalizada (LPEH) y parénquima lagunar en hojas (APLH).
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza en un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones, la significancia para variables morfológicas: ancho (AH) y largo (LH) de hoja, diámetro de tallo (DT), diámetro de flores (DF), altura de planta (AP), e histológicas: área de vasos de xilema de la nervadura central de la hoja (AXH), vasos de xilema del pecíolo (AXP), vasos de xilema de raíz principal (AXR), y vasos de xilema del tallo (AXT), parénquima en empalizada (LPEH) y parénquima lagunar en hojas (APLH), fue considerada en función del nivel de plodía, donde el factor de variación fueron tres poblaciones de autotetraploides y una población diploides de tomate de cáscara, para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey (p≤ 0.05). Se utilizó el programa estadístico de SAS versión 9.0.
Resultados y discusión
Caracterización morfológica
La población diploide tuvo en promedio 6.81 cm de ancho de hoja (AH) mientras que las tres poblaciones autotetraploides presentaron en promedio 8.51 cm, la población autotetraploide 11 presentó el mayor valor con 9.21 cm y fue estadísticamente igual (p> 0.05) a las otros dos poblaciones tetraploides, pero diferente (p< 0.05) del diploide rendidora (Cuadro 1), se observó que las hojas de las plantas autotetraploides fueron de un color verde más obscuro que las plantas diploides, además el ciclo de vida de las plantas autotetraploides fue más largo (aproximadamente 15 días) que las diploides, estos resultados coinciden con los encontrados por Chen et al. (2011) en plantas tetraploides de Anthurium andraeanum "Arizona" inducidas con colchicina ya que las plantas tetraploides presentaron peciolos firmes, hojas gruesas y de un verde más obscuro además vivieron más tiempo en comparación con las plantas diploides. En lo que respecta a la longitud de hoja (LH) en este trabajo no se encontraron diferencias significativas (p> 0.05) entre la poblaciones diploide y las autotetraploides.
AH= ancho de hoja, LH=largo de hoja; DF= diámetro de flor; DT= diámetro de tallo; AP=altura de planta; *Letras diferentes dentro de las columnas indican diferencias significativas a nivel (P≤ 0.05); DMS= Diferencia mínima significativa.
Cuadro 1 Valores medios de características morfológicas de diploides y autotetraploides de tomate de cáscara.
En diámetro de flor (DF) se encontraron diferencias significativas entre las poblaciones autotetraploides y el diploide, las poblaciones tetraploides presentaron entre 2.47 y 2.68 cm, siendo el tetraploide 16 el que presentó el valor más alto y fueron estadísticamente iguales (p>0.05) entre ellas. La población que presentó las flores de menor diámetro fue el diploide 19 (2.07 cm), coincidiendo con Liu et al. (2007) quienes encontraron diferencias morfológicas entre diploides y tetraploides de Platanus acerifolia desarrolladas con el uso de la colchicina, en Gerbera jamesonii Bolus cv. Sciella los tetraploides mostraron un crecimiento lento, pero tuvieron mayor vigor, hojas anchas y engrosadas, además desarrollaron flores más grandes, tallos más largos, y mejoraron la vida de florero (Gantait et al., 2011).
En diámetro de tallo (DT) no se encontraron diferencias significativas entre las poblaciones autotetraploides y el diploide, la población tetraploide 11 (2.53 cm), presentó el mayor valor y fue estadísticamente igual (p> 0.05) a todas las demás, incluyendo a la población diploide 19.
En cuanto a la altura planta (AP) el diploide 19 (82.2 cm) presentó el mayor valor y fue estadísticamente diferente (p< 0.05) a las poblaciones autotetraploides que presentaron los valores más bajos de (58.6 cm a 67.13cm) y fueron estadísticamente iguales (p>0.05). Los autotetraploides de tomate de cáscara presentaron valores más altos de ancho de hojas y diámetro de flores en comparación con los diploides, coincidiendo con Cequea (2000), quien menciona que los autopoliploides tienen una tolerancia ecológica más amplia y tamaños celulares más grandes, por su parte Imery y Cequea (2001) encontraron que los nuevos genotipos tetraploides de A. vera producían mayor acumulación de biomasa foliar, debido especialmente al incremento en el ancho y espesor de sus hojas, además, en este sentido Rêgo et al. (2011) encontraron que con la formación de autotetraploides de Passiflora edulis Sims. (2n= 2x= 18) mediante el uso de colchicina y oryzalin lograron plantas (2n= 2x= 36) más vigorosas.
En este trabajo se observó que el crecimiento en los tetraploides fue más lento por que a 60 días que se tomaron las variables de las plantas diploides que superaron a las tetraploides en altura de planta; sin embargo, las tetraploides al final del ciclo superaron a las diploides, por lo que se recomienda tomar estas variables a diferentes etapas del desarrollo y así poder coincidir con lo observado por Molero y Matos (2008) quienes encontraron que con la duplicación cromosómica en Aloe vera se incrementó la altura de las plantas, la longitud, ancho, espesor y volumen foliar con respecto a las plantas diploides, por lo que se estima que la poliploidización podría constituir una alternativa para aumentar la producción de biomasa celular en esta especie. El área foliar es una variable importante debido a que se relaciona directamente con la actividad fotosintética y ésta con la acumulación de reservas (Poehlman y Allen, 2005). Una variable que normalmente está relacionada con el tamaño de fruto es el tamaño de la flor y en este caso de acuerdo a los valores observados se puede afirmar que se indujo un incremento en los autotetraploides con respecto a ésta característica.
Estudio histológico
Las variables histológicas área de células de parénquima lagunar en hoja (APLH) la poblaciones autotetraploides presentaron en promedio 6 912.67 µm2 siendo superada por la población diploide que presentó un valor de 7 398.97 µm2, en área de vasos de xilema de la nervadura central de la hoja (AXH) el diploide presentó 655.08 µm2 mientras que los autotetraploides presentaron en promedio de 602.81µm2, en longitud de células de parénquima en empalizada (LPEH) los autotetraploides exhibieron 100.61 µm con un valor que superó al diploide, ya que éste presentó 97.361 µm (Figura 1), en área de vasos de xilema en peciolos (AXP) las poblaciones autotetraploides tuvieron en promedio 604.54 µm2 mientras que las plantas diploides presentaron un valor de 714.56 µm2; sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre plantas diploides y autotetraploides ya que fueron estadísticamente iguales (p≥ 0.05).
Figura 1 Vasos de xilema de la nervadura central de la hoja; A) Diploide; B) Autotetraploide. Parénquima en empalizada de la hoja; C) Diploide; D) autotetraploide en tomate de cáscara 10X.
El hecho de que en el presente estudio no se presentaran diferencias estadísticamente significativas en cuanto a estas variables, puede indicar que a pesar de la duplicación de cromosomas y genes, las características de hojas y peciolos resultaron poco afectadas por la poliploidización en tomate de cáscara, esto también quizás se deba a que en los autotetraploides son de crecimiento más lento y el ciclo es más largo que los diploides y para este trabajo las muestras de diploides y autotetraploides fueron tomadas en la misma fecha.
Los análisis de varianza aplicados a plantas diploides y autotetraploides exhibieron diferencias significativas (p< 0.01) entre diploides y autotetraploides en lo que se refiere a área de vasos de xilema del tallo (AXT) donde las tres poblaciones autotetraploides (1 842.66 µm2) superaron al diploide (748.4 µm2) en 146.17%, para el área de vasos de xilema de raíz (AXR) las plantas autotetraploides presentaron en promedio 1 309.68 µm2 mientras que las diploides tuvieron 738.4 µm2 y fueron superados por los tetraploides en un 77.36%, por lo tanto se encontró que al duplicar el genoma de tomate de cáscara, se incrementó el área de los vasos de xilema del tallo y de la raíz (Figura 2 y 3), estos resultados podría ser positivos para esta especie de acuerdo a lo reportado por Zahng y Cao (2009) quienes asumen que se ha probado que la estructura del sistema vascular del tallo en varias especies, tiene una fuerte influencia en la estructura y funcionamiento de las hojas, la asimilación bióxido de carbono, la eficiencia en el uso de nutrientes y la tasa de crecimiento.
Figura 2 Área vasos de xilema en raíz y tallo de la población diploide y población autotetraploide de tomate de cáscara.
Conclusiones
En los autotetraploides de tomate de cáscara se modificaron variables morfológicas como el ancho de hoja y diámetro de flor siendo mayor que en los diploides, dando apariencia de mayor vigor en las plantas autotetraploides, además en las autotetraploides el área de vasos de xilema de tallo y raíz fue más grande que el diploide rendidora, características importantes en la conducción de agua y sales minerales.
