El chile es uno de los cultivos hortícolas más importante en México; se consume preferentemente en estado fresco (^{Valadez, 2001}). Desde el punto de vista económico C. annuum es la especie más cultivada en América Latina y en todo el mundo, seguida de C. chinense. La mayoría de la producción de semillas hibridas de este cultivo se producen en países como China, India y Tailandia con mano de obra barata y calificada (^{Berke, 2008}). Existen genotipos tan costosos que el precio de la semilla en el mercado oscila entre 1 000 a 1 200 dólares las mil semillas.

La producción y rendimiento de semilla híbrida depende de varios factores, como, la técnica de emasculación, receptividad del estigma, momento adecuado de la polinización, viabilidad del polen, número de polinizaciones necesarias para la producción de semilla número de frutos por planta (^{Kivadasannavar, 2008}). La apertura de la flor ocurre con mayor frecuencia en las primeras horas del día y permanece abierta por un periodo variable, en promedio 24 h. Las anteras se abren después de la apertura de las flores, variando de 1 a 8 h en C. annumm. El estigma puede ser receptivo en la etapa de botón, en la víspera de la antesis, ó 2 a 3 h después de la apertura de la flor (protoginia) (^{Vallejo et al., 2004}). La técnica utilizada en el cultivo de chile es la emasculación manual pero es un procedimiento laborioso y poco rentable (^{Bosland et al., 2012}).

Algunas alternativas actuales de emasculación usadas en la eliminación del polen son: por medio de calor, frio o etanol, polinización sin emasculación y androesterilidad génico-citoplasmática (^{Kato, 1989}; ^{Chávez, 1993}; ^{Aloni, 1999}). ^{Hirose y Fujime (1973)} estudiaron la influencia de Dalapon^® para inducir esterilidad masculina en chile y reportaron que 6 aplicaciones semanales a bajas concentraciones (hasta 300 ppm) suprimió la dehiscencia de las anteras.

El objetivo de la presente investigación fue evaluar dos técnicas de emasculación, en dos genotipos de chile jalapeño (Euforia e Invicto), y dos de chile Bell (Canon y Darsena) y comparar la emasculación con etanol y la emasculación manual y la calidad de semilla considerando el estado de maduración del fruto para su extracción.

El trabajo se desarrolló bajo condiciones de invernadero en la región de Celaya, Guanajuato, a una altura de 1 765 msnm. Los materiales evaluados fueron dos genotipos de chile jalapeño (Euforia e Invicto) y dos de chile Bell (Canon y Darsena). La germinación de las plántulas de los cuatro genotipos se llevó a cabo en charolas. Se aplicó solución nutritiva de Steiner en el agua de riego diariamente (^{Castañeda, 2001}). Cuando las plántulas alcanzaron una altura de 15-20 cm, se trasplantaron en el invernadero; se establecieron cuatro bloques, con surcos de 3 m de longitud; cada bloque estuvo constituido por 10 surcos, a una distancia de 1 m entre ellos. Cada surco tenía nueve plantas a una distancia de 40 cm, a doble hilera con una densidad de 2.2 plantas m².

Se evaluaron dos métodos de emasculación: con etanol y manual. Para el primero, se seleccionaron botones entreabiertos, con presencia de anteras inmaduras. Se evaluó etanol al 47.5% (V/V) durante 5, 10, 30 y 45 s; después de la inmersión, los botones se cubrieron con papel delgado para evitar la contaminación, se utilizaron cinco botones florales por tratamiento con tres repeticiones.

Variables evaluadas: se realizó en forma cuantitativa y cualitativa. Presencia de polen (PP), se observó si la antera después de la aplicación de etanol presentaba dehiscencia y desprendimiento de polen mediante observación visual. Caída de la flor (CF), se contabilizo el número de flores que se cayeron después de la aplicación del método. Porcentaje de flores abortadas (PFA), se contabilizó el número de flores que no presentaron amarre de fruto. Porcentaje de amarre y frutos caídos (PA), (PFC). El porcentaje de amarre se midió contando el número de flores fertilizadas y frutos cuajados. Se contó el número de frutos caídos, evaluándose como total de frutos. Viabilidad del polen. En los genotipos de chile Bell, se hicieron emasculaciones con etanol y las flores se dejaron un día en la planta.

Posteriormente se cortaron las anteras para extraer el polen y realizar la prueba de viabilidad. Para esta se empleó: sacarosa en solución al 20%, 100 ppm de H ₃BO₃, 300 ppm de Ca(NO₃)₂, 200 ppm de MgS0₄, 100 ppm de KNO₃ y Tween 80 al 0.4%, pH 5.5. Se colocaron dos gotas del medio en un portaobjetos, después se colocaron muestras de polen de las flores sometidas a los tratamientos con etanol. Estas se mantuvieron a una temperatura de 20 °C por 2 h. La observación del polen se realizó mediante un microscopio estereoscopio Leica Zoom 2000^®. Granos de polen viable (GPV). Se consideraron viables los granos de polen que contaban con presencia del tubo polínico de longitud mayor o igual al diámetro del polen (µm) (^{González et al., 2002}).

La emasculación manual se realizó entre las 08:00 y 10:00 am, debido a que la polinización requiere de una temperatura promedio de 20 °C, para que la antera presente la dehiscencia y adecuada viabilidad del polen. Se realizaron cruzas directas y recíprocas; se etiquetó y cubrió la flor con papel de china. La evaluación se realizó mediante características cuantitativas usando el progenitor como hembra y después como macho, con 10 repeticiones por cada tratamiento, dando un total de 20 unidades experimentales; la evaluación se hizo en forma descriptiva, estimando la media del porcentaje de amarre (número de frutos logrados). Los frutos se cosecharon cuando estos tenían color rojo o rayando a rojo, lo cual es un indicador de madurez fisiológica del fruto y de la semilla. Para evaluar la fase de maduración más adecuada para la extracción de semilla y asegurar la calidad de la misma se consideraron tres grados de madurez, a los 30, 45 y 60 días, con 8 repeticiones.

Tiempo de extracción de semilla: inmediata, la semilla se extrae al momento de la cosecha; tardía, la semilla se extrae después de 14 días de cosechado el fruto. La extracción se realizó por fruto y se pesó de modo individual; se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron secar por 14 días; se guardaron en bolsas herméticas. Calidad fisiológica de la semilla. Se realizó la prueba de germinación estándar en papel germinador. Se colocaron 25 semillas en el papel previamente humedecido; se roció captan a 1g L^-1. Se enrolló el papel para formar los “tacos” y se colocaron en bolsas de plástico y posteriormente se introdujeron a la cámara de germinación Conviron^® a 25 °C. Se realizaron dos conteos: el primero a los siete días y el segundo a los 14 días.

La emasculación con etanol al 47.5% (v/v); en genotipos de chile jalapeño Euforia e Invicto, durante 10 s, dañó en grado intermedio 80% de las flores. La inmersión durante 30 s afectó 60% de las flores con daño intermedio. El tratamiento de 45 s ocasionó un daño muy severo 100% de las flores. El tratamiento durante 10 s ocasionó más daño debido al efecto de la tensión superficial generada por la morfología del botón floral y el tiempo de exposición, al no permitir que la solución escurriera. El tratamiento de 30 s fue suficiente para que la solución se acumulara y cayera por gravedad. En cuanto a la caída de las flores, los tratamientos de 10 y 30 s presentaron 10% de desprendimiento. El tratamiento de 45 s ocasionó 100% de desprendimiento de las flores.

La inmersión del botón floral de Euforia e Invicto en etanol al 50% (v/v) durante 10 s, mostró que 40% no presentó daños visibles en el estigma. El tratamiento durante 5 s observó que 40% tuvo un daño intermedio, 20% un daño leve y 40% no tuvo daño. Este tiempo de inmersión pareciera adecuado para la emasculación en estas variedades. Durante la inmersión de 5 s en 50% de etanol (v/v), se observó que 40% de los estigmas presentaron una coloración amarilla, 40% una coloración café claro y 20% una coloración café oscuro. La inmersión por 10 s provocó que 60% tomara una coloración amarilla, 20% café claro y 20% una coloración café. La Inmersión en etanol al 52% (v/v) durante 5 s, de Euforia e Invicto, presentaron 60% de flores sin daños visibles en el estigma y un 40% con daño intermedio. El tiempo de inmersión de 10 s mostró 40% de flores sin daño, 40% con daño intermedio y 20% con daño severo en el estigma.

A esta concentración de 5 a 10 s de tiempo de exposición ocasionó 20% de daño severo. La aplicación de etanol al 52% (v/v) durante 5 s ocasionó un daño intermedio y una coloración café claro en el estigma. De acuerdo con los resultados de la aplicación de etanol al 50 y 52% (v/v) durante los tiempos de inmersión de 5 y 10 s, muestran que el tratamiento de etanol al 50% (v/v) durante 5 s presentó mayor daño en el estigma, comparado con la inmersión en 52%. Esto creemos que se debe a la disposición de los órganos florales. En este sentido se puede señalar que cuando los estigmas tienen mayor longitud que las anteras, los daños son más severos. En pruebas de envejecimiento acelerado de semilla de híbridos de maíz ^{Santipracha et al. (1997)} encontraron que el tratamiento de 43 °C por 96 h provoca una disminución en el porcentaje de germinación de hasta 26.5%, en tanto que el tratamiento de 44 °C por 96 h lo reduce en 67.5%, en uno de sus híbridos. En términos fisiológicos una pequeña diferencia en concentración o temperatura puede tener efectos marcados.

El daño causado por la inmersión del botón floral en la concentración de etanol al 50% (v/v) durante 5 y 10 s, en los genotipos de chile Bell, Canon y Dársena, el tratamiento de 5 s, presentó el 48% de flores sin daño visible en el estigma. En el tratamiento durante 10 s, se observó que 68% no mostró daños visibles. El daño causado en el estigma fue más severo cuando los estambres eran más largos que el pistilo (flores brevistilas). La inmersión del botón floral de chile Bell Canon y Darsena en etanol al 52% durante 5 s, no ocasionó daño visible en 68% de las flores. El tratamiento durante 10 s, no tuvo daño visible 60% de las flores. En esta fase se observó el mayor número flores que no presentó daño en tiempos de inmersión de 5 y 10 s. El tipo de morfología floral ayuda a evitar daños en el estigma (flor longistila).

En todos los tratamientos con etanol al 47.5% (v/v) se observó la dehiscencia de las anteras y el desprendimiento de polen con coloración normal. El tratamiento de 45 s ocasionó daños similares a quemaduras en las anteras. El método de emasculación con etanol no interrumpió la dehiscencia de las anteras.

El análisis estadístico de los tratamientos con etanol al 50 y 52% durante los tiempos de inmersión de 5 y 10 s, no detectó diferencias estadísticas significativas. En el ensayo realizado en chile Jalapeño se observó que el éxito de la aplicación del método de emasculación con etanol depende de la disposición de los órganos florales, lo que coincide con los resultados hallados en los genotipos de chile Bell.

En la Figura 1 se observa el porcentaje de flores abortadas; este resultado coincide con ^{Luna (2010)} quien señala que las flores no polinizadas se desprenden (^{Jaimez, 2010}). Un factor importante en el amarre de fruto es la posición de las flores en la planta. La FAO (2002) señala que en chile, cada planta produce varios centenares de flores que pueden cuajar al 100% cuando es la primera etapa de floración y están sobre el tallo principal; este porcentaje baja hasta 80% para las flores posteriores del mismo tallo y reduciéndose hasta un 20-30% e incluso a 10% para las flores de las ramas laterales. El 80% de las flores amarraron con polinización manual, mientras que el tratamiento con etanol fue solo de 20%.

Figura 1 Porcentaje de flores abortadas en los tratamientos con etanol al 50 y 52% durante los tiempos de inmersión de 5 y 10 s. 

^{García (2011)} trabajando con Capsicum flexuosum encontró que al evaluar plantas en invernadero de poblaciones diferentes, la longitud del fruto estuvo influenciada por el origen de la polinización; la mayor cantidad de frutos pequeños se encontró en la polinización al azar y la polinización manual presentó valores intermedios y mayor variabilidad.

Figura 2 Porcentaje de flores amarradas en los tratamientos de etanol al 50 y 52% durante los tiempos de inmersión de 5 y 10 s. 

De los tratamientos a 30, 45 y 60 días de maduración del fruto, se obtuvo que a 30 días presentó un promedio de 5.5 ± 0.51 cm, a 45 días tuvo 7.7 ± 0.73 cm y a 60 días el promedio fue de 8.0 ± 0.68 cm. En chile Bell, se observa que a los 45 días el fruto ya había alcanzado el diámetro del de 60 días. En el periodo de 30 a 60 días el diámetro del producto se incrementó 69%.

Con el tratamiento de etanol al 50% durante 5 s se obtuvieron 235 semillas por fruto; con 10 s de tratamiento, 304 semillas y con etanol al 52% durante 5 s se cosecharon 374 semillas; con 10 s se obtuvieron 296 semillas por fruto.

En el número de semillas por fruto de chile Bell, emasculado manualmente, de los tratamientos de maduración a 30, 45 y 60 días se observó que a los 60 días se obtuvo un promedio de 170 semillas, a los 45 días, 238 semillas y el de 30 días 192 semillas. En investigaciones en chile habanero (^{Puente et al., 1991}) observaron que al avanzar el estado de madurez del fruto hubo un incremento en el porcentaje de germinación. En el trabajo realizado en chile Bell (^{Sánchez et al., 1993}) reportaron que las semillas extraídas de frutos de 30 días no germinaron, mientras que el mayor porcentaje de germinación se presentó en los tratamientos de 50 y 60 días. Este resultado coincide parcialmente con ^{Edwards et al. (1987)} quienes evaluaron el efecto de la madurez del fruto y del tiempo de cosecha y posmaduración en la germinación de chile tabasco. Obtuvieron porcentajes de germinación de 81% al haber cosechado frutos rojos; además, el porcentaje de germinación se elevó a 86% después de un período de posmaduración.

Análisis de varianza (Cuadro 1) de las variables maduración de fruto a 30, 45 y 60 días y extracción de semilla inmediata y tardía. Hubo diferencias altamente significativas entre las épocas de cosecha para las variables de longitud de tallo y raíz. Para tiempo de extracción solo hubo diferencias significativas en la variable longitud de tallo; esto nos indica que al menos un tratamiento es diferente.

Cuadro 1 Cuadrados medios, significancia estadística y coeficientes de variación del análisis de variancia de madurez de fruto cosechado y extracción de semilla para variables de calidad fisiológica. 

FV= fuente de variación; GL= grados de libertad; Rep. Repeticiones; C= cosecha; E= extracción; CV= coeficiente de variación; *, ** indican significancia estadística al nivel 0.05 y 0.01 de probabilidad, respectivamente.

De acuerdo con lo anterior, en la comparación de medias (Cuadro 2) se observa que el tratamiento de maduración de fruto a cosecha de 60 días fue superior al tratamiento de 45 días en las variables longitud de raíz y tallo; este resultado era esperado ya que a medida que transcurre el tiempo se incrementa la longitud de raíz y tallo porque la planta no ha llegado a madurez; los resultados de ^{Carrillo et al. (2009)} coinciden pues mencionan que entre los factores que pueden tener efecto en la calidad de la semilla están el grado de madurez y tiempo de maduración de la misma.

Cuadro 2 Comparación de medias del tratamiento de maduración de fruto a cosecha para variables de calidad fisiológica. 

Medias con la misma literal son estadísticamente iguales (Tukey p< 0.05).

En la comparación de medias del tiempo de extracción de semilla, el tratamiento de extracción tardía fue superior en la variable de longitud de raíz; no hubo diferencias estadísticas en la variable longitud de tallo. Este resultado coincide parcialmente con ^{Randle et al. (1981)} quienes mencionan que la semilla de chile completa su madurez fisiológica en un período de reposo que varía de una a seis semanas después de que los frutos fueron cosechados, dependiendo del tipo de chile.

El Cuadro 3 muestra el análisis de la covarianza de la época de maduración de fruto a 30, 45 y 60 días y extracción de semilla inmediata y tardía. Hubo significancia estadística en ambas variables, lo que indica que por lo menos uno de los tratamientos es diferente.

Cuadro 3 Cuadrados medios, significancia estadística y coeficientes de variación del análisis de variancia de la covarianza de la madurez de fruto cosechado y extracción de semilla para variables de calidad fisiológica. 

FV= fuente de variación; GL= grados de libertad; Rep. repeticiones; CoCE= covariancia de cosecha y extracción; C.V.= coeficiente de variación; ** indica significancia estadística al nivel 0.01 de probabilidad.

El Cuadro 4 presenta la comparación de medias de la covarianza de la madurez de fruto cosechado y extracción de semilla. El tratamiento de 60 días en ambos tiempos de extracción fue superior al de 45 días, para ambas variables.

Cuadro 4 Comparación de medias de la covarianza de la madurez de fruto cosechado y extracción de semilla para variables de calidad fisiológica. 

Medias con la misma literal son estadísticamente iguales (Tukey p< 0.05).