Artículos

 

Regeneración in vitro de híbridos de nochebuena vía organogénesis*

 

In vitro regeneration of poinsettia hybrids via organogenesis

 

Sandra Eloísa Rangel-Estrada^1§, Jaime Canul-Ku¹, Felipe de Jesús Osuna-Canizalez¹, Faustino García-Perez¹, Pilar del Rosario-Montes², Ángel Santiago Baltazar Vences Hernández² y Eleodoro Hernández-Meneses³

 

¹ Campo Experimental Zacatepec-INIFAP. Carretera Zacatepec-Galeana, Zacatepec, Morelos, km 0.5. 62780. Tel: 734 3430230. Ext. 132. (canul.jaime@inifap.gob.mx; osuna.felipe@inifap.gob.mx; garcia.faustino@inifap.gob.mx).

² Ingeniería Bioquímica-Instituto Tecnológico de Zacatepec.

³ Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Postgrado en Recursos Genéticos y Productividad-Fisiología Vegetal. (doromeneses@colpos.mx). §Autora para correspondencia: rangel.sandra@inifap.gob.mx.

 

* Recibido: abril de 2015
Aceptado: julio de 2015

 

Resumen

La nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) es una planta ornamental nativa de México apreciada por la vistosidad de sus brácteas y ampliamente cultivada en muchos países. Anivel mundial se le considera un ícono de la navidad. Las diferentes técnicas del cultivo de tejidos vegetales in vitro han contribuido a los programas de mejoramiento genético de diversos cultivos y otras especies. En esta investigación se desarrolló un protocolo para la propagación in vitro de los híbridos de nochebuena 'Zacatepec 10' y 'Zacatepec 48' del Programa de Mejoramiento Genético de Plantas Ornamentales del INIFAP del Campo Experimental, Zacatepec. La inducción de la organogénesis se logró mediante la activación de yemas axilares de segmentos nodales obtenidos de plantas madre de dos meses de edad. La incubación de los explantes en medio de cultivo MS (1962) suplementado con 8.8 μM de BA durante ocho semanas indujo la activación de la yema axilar y 3.9 nuevos brotes en el híbrido 'Zacatepec 10'y 2.5 en 'Zacatepec 48' con tamaño promedio de 1.02 cm. La multiplicación de brotes fue efectiva con 4.4 μM de BA combinada con 2.2 μM de CIN adicionada con 0.5 μM de AIA, pero se incrementó sustancialmente con 0.23 μM de TDZ; 12.1 brotes en Zacatepec 10' y 11.6 en 'Zacatepec 48' después de ocho semanas de cultivo. En el enraizamiento se obtuvieron en promedio 5.8 raíces de 5.9 cm de longitud en el medio de cultivo a la mitad de concentración de sales adicionado con 5.6 μM de AIA después de seis semanas. La aclimatación de 85% de las plantas de los dos híbridos se logró en mezcla de turba y perlita (1:1) después de seis semanas de plantadas. Este protocolo se aplicará para la propagación clonal de nuevos híbridos de nochebuena que han sido generados en México y que se necesitan multiplicar, porque la propagación convencional limita la cantidad de nuevas plantas y de algunos se disponen de escasos especímenes.

Palabras clave: Euphorbia pulcherrima, micropropagación, mejoramiento genético, segmentos nodales.

 

Abstract

Poinsettia (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) is an ornamental plant native of Mexico prized for their striking bracts and widely cultivated in many countries. Globally it is considered an icon of Christmas. The different in vitro plant tissue culture techniques have contributed to the genetic improvement of various crops and other species. In this study a protocol for in vitro propagation of poinsettia hybrids 'Zacatepec 10' and 'Zacatepec 48' from the Ornamental Plant Breeding program of INIFAP, from the experimental field of Zacatepec was developed. The induction of organogenesis was achieved through the activation of axillary buds from nodal segments obtained from mother plants two months old. Incubation of explants in MS medium (1962) supplemented with 8.8 μM BA for eight weeks, induced the activation of axillary bud and 3.9 new hybrid shoots in 'Zacatepec 10' and 2.5 in 'Zacatepec 48' with average size 1.02 cm. Shoot multiplication was effective with 4.4 μM BA combined with 2.2 μM CIN added with 0.5 μM of AIA, but increased substantially with 0.23 μM TDZ; 12.1 shoots in Zacatepec 10' and 11.6 in' Zacatepec 48 'after eight weeks of culture. In rooting were obtained on average 5.8 roots of 5.9 cm length in culture medium with half salt concentration added with 5.6 μM AIA after six weeks. Acclimatization of 85% of the plants of the two hybrids was achieved with a mix of peat and perlite (1: 1) after six weeks of planting. This protocol will be implemented for clonal propagation of new poinsettia hybrids that have been generated in Mexico and need to multiply, because conventional propagation limits the amount of new plants and some have few specimens.

Keywords: Euphorbia pulcherrima, genetic improvement, micropropagation, Nodal segments.

 

Introducción

La nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch) es una especie ornamental originaria de México y, a nivel mundial, es considerada el símbolo de la navidad (Taylor et al, 2011). Es un cultivo de temporada y en México en el año 2013 fue la principal especie ornamental cultivada, con más de 15 millones de plantas; su valor fue de 416 millones de pesos que representó 6.7% del valor de ventatotal de las ornamentales. Se cultiva en siete estados y Morelos fue el principal productor con 5.9 millones de plantas (40% de la producción nacional) (SIAP, 2014). En México se ofertan cada año más de 100 variedades de nochebuena con el distintivo común que todas han sido generadas en el extranjero. Algunas de ellas permanecen varios años en el mercado y otras no logran consolidarse en el gusto de los consumidores. Destacan las variedades Freedom^®, Prestige^®, Supjibi^®, entre otras (García et al, 2013).

En respuesta a esta dependencia tecnológica de material vegetativo, es de primordial importancia disponer de variedades mexicanas de nochebuena que ofrezcan nuevas características en color, tamaño y forma de bráctea, así como larga vida en maceta. Las nuevas variedades nacionales permitirán a los productores aumentar la rentabilidad del cultivo, diversificar la producción, ampliar las áreas de producción, competir con las variedades extranjeras, reducir costos de producción y evitar fuga de divisas por pago de regalías.

El mejoramiento genético de una especie es un proceso de plazo largo. La Unión Internacional para la Protección de las Obtenciones Vegetales (UPOV) indica que se requieren aproximadamente de 10 a 15 años para liberar una nueva variedad. Sin embargo, este plazo es factible de reducirlo si se aplican algunas de las técnicas del cultivo de tejidos vegetales in vitro donde se induzca y explote la variabilidad genética como por ejemplo el cultivo de anteras para producción de plantas haploides, la hibridación somática, el cultivo de protoplastos, la selección in vitro, entre otras (Srivastava et al, 2013). Además, otras técnicas, como el cultivo de meristemos, permiten obtener plantas genéticamente idénticas a la planta madre, libres de enfermedades y en grandes cantidades (Tigerstedt y Niskanen, 2002; George y Debergh, 2008).

En el Campo Experimental Zacatepec, del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), se lleva a cabo el mejoramiento genético en nochebuena. A partir de colectas de material vegetativo y semillas a nivel nacional se creó un banco de germoplasma y se estableció un programa de mejoramiento genético. Se han generado híbridos que sobresalen por características específicas de vigor, porte, número de nudos y tamaño, color y forma de las brácteas (Canul et al, 2012).

La meta principal de la generación de nuevas variedades es ponerlas a disposición de los productores del sector ornamental. Sin embargo, antes de liberarlas se debe efectuar la evaluación agronómica en ambientes contrastantes hasta que se alcance uniformidad y estabilidad, ya que las zonas productoras de esta ornamental en México se ubican en condiciones ambientales diversas; para ello es necesario propagar estos genotipos avanzados y contar con plantas en cantidades suficientes. Es aquí, donde el cultivo de tejidos vegetales resulta útil mediante la micropropagación, ya que es una de las aplicaciones prácticas que más ha contribuido al mejoramiento genético de especies cultivadas, en peligro de extinción o élites (Thorpe, 2012). Además, es la aplicación que más beneficios ha aportado a la horticultura ornamental en el mundo, principalmente porque ha favorecido la propagación comercial a gran escala y la rápida introducción al mercado de especies y variedades de plantas novedosas (Neumann et al, 2009).

Nataraja et al. (1973) y Nataraja (1975) fueron los primeros en trabajar con la propagación in vitro de nochebuena; en ambos trabajos se logró la germinación de semillas en medio de cultivo de White (White, 1943) sin hormonas y a partir de las plántulas se indujo la formación de nuevas yemas de brotes que se regeneraron en plantas. Estos estudios sentaron las bases del cultivo de tejidos en esta ornamental hasta llegar a la transformación genética (Smith et al, 1997; Clarke et al, 2008).

Si bien, la propagación de la nochebuena es apropiada a partir de esquejes, en el proceso de obtención de nuevos híbridos es necesario desarrollar un esquema para la clonación in vitro donde se pueda incrementar la cantidad de plantas homogéneas, sobre todo de genotipos donde sólo se dispone de pocos especímenes y la cantidad de plantas obtenidas por el método convencional es limitada. Es por ello, que para combinar el mejoramiento genético con las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro es necesario generar un protocolo de propagación clonal específico para cada genotipo de nochebuena. Todo esto con el propósito de incrementar las tasas de multiplicación obtenidas con esquemas convencionales de propagación de plantas. Con base en estos antecedentes, la presente investigación se planteó como objetivo desarrollar un sistema para la propagación in vitro de dos híbridos avanzados de nochebuena, vía organogénesis a partir de segmentos nodales.

 

Materiales y métodos

Material vegetal y fuente de explante

Se utilizaron plantas de los híbridos 'Zacatepec 10' y 'Zacatepec 48', que fueron generados por cruzamiento en el ciclo de cultivo 2010 y seleccionados con base en caracteres morfológicos de interés ornamental en los años 2011 y 2012 en el INIFAP - Campo Experimental Zacatepec, Morelos. Estos híbridos se caracterizan por sus brácteas de color rojo, altura de plantas de 62 cm, 23 nudos y buena ramificación (Canul et al, 2013). Las plantas madre se mantuvieron en condiciones semi-hidropónicas bajo malla sombra y para el manejo agronómico se siguieron las recomendaciones de García et al. (2013). Los explantes fueron los cinco segmentos nodales, contados del ápice hacia la base del tallo, de 5 a 10 mm de longitud.

 

Medio de cultivo y condiciones de incubación

El medio de cultivo básico usado fue el de Murashige y Skoog (MS, 1962) con las sales inorgánicas completas, suplementado con sacarosa (30 g L^-1), mio-inositol (100 mg L^-1), tiamina (1 mg L^-1) y solidificado con agar Merck^® (7 g L^-1). El pH se ajustó a 5.7 con NaOH o HCl 1N y la esterilización se hizo en autoclave vertical (Felisa^® modelo FE405) a 121 °C y 1.5 kg cm^-2 de presión por 20 min. Los cultivos se incubaron a 25 ± 2 °C en fotoperiodo de 16 horas e intensidad luminosa de 45 μmol m^-2 s^-1.

 

Establecimiento del cultivo aséptico

Los explantes se lavaron con detergente comercial (Roma^®) por 5 min y se enjuagaron con agua de la llave; se hicieron seis enjuagues con agua destilada esterilizada y se sumergieron en solución fungicida de Captán (4 g L^-1) durante 15 min en agitación continua. Nuevamente se aplicaron seis enjuagues con agua destilada esterilizada y se sumergieron en alcohol al 70% durante 1 min. Después de otros seis enjuagues con agua destilada esterilizada se sometieron a tratamientos con hipoclorito de sodio (NaOCl, Cloralex^®, 20% v/v) durante 15, 20 y 25 min. A cada tratamiento se le adicionaron 10 gotas de surfactante (Tween^® 20). Se evaluaron plantas madre de dos y seis meses de edad y los explantes se sembraron en frascos de 45 mL de capacidad con 15 mL de medio de cultivo conservando la polaridad. Alas tres semanas se contabilizó la tasa de supervivencia (%), ennegrecimiento del explante (%) y los porcentajes de contaminación por hongos y bacterias. El experimento se condujo en un diseño completamente al azar con arreglo factorial 3 x 2; tres tiempos de inmersión en NaOCl y dos edades de planta madre.

 

Inducción de brotes

Los segmentos nodales de los dos híbridos se incubaron en medio básico MS (1962) suplementado con dosis equimolares de benciladenina (BA) y cinetina (CIN) (2.2; 4.4 y 8.8 μM) y sin hormonas (testigo). Se usaron frascos de 90 mL de capacidad con 30 mL de medio de cultivo. A las ocho semanas de cultivo se cuantificó la brotación (porcentaje de explantes con brotes), número de brotes por explante y longitud de brote (cm). Los subcultivos a medio fresco se hicieron a las cuatro semanas.

 

Multiplicación de brotes

Brotes de1-1.5 cm de longitud de ambos híbridos se transfirieron a medio MS (1962) adicionado con cuatro combinaciones de BA y CIN (2.2+2.2; 2.2+4.4; 4.4+2.2 y 4.4+4.4 μM) y cuatro dosis de thidiazuron (TDZ, 0.23; 0.46; 0.69 y 0.91 μM). A cada tratamiento se le agregó 0.5 μM de ácido indol acético (AIA). Los subcultivos a medio fresco se hicieron a las cuatro semanas. A las ocho semanas de cultivo se cuantificaron el número de brotes por explante y la longitud del brote (cm).

 

Alargamiento de plantas y enraizamiento

Brotes de 3 a 4 cm de longitud de los dos híbridos se cultivaron en medio básico MS (1962) a la mitad de concentración de sales suplementado con dos dosis de AIA (2.8 y 5.6 μM) y sin hormonas (testigo). Se usaron frascos de 250 mL de capacidad con 50 mL de medio de cultivo. Después de seis semanas se cuantificó el porcentaje de enraizamiento, número y longitud de raíces (cm), así como altura de planta (cm).

 

Aclimatación

Plantas de 5-7 cm de altura de ambos híbridos se extrajeron de los frascos y las raíces se lavaron para retirar residuos del medio de cultivo. Se plantaron en macetas de poliestireno de 175 mL de capacidad con tres sustratos artificiales constituidos por turba (100%), perlita (100%) y la mezcla turba + perlita (1:1). Se colocaron en charola de plástico con cubierta transparente durante 25 días en invernadero con riegos semanales de la fórmula 15-2-25 (Peters^®), recomendada para el enraizamiento de esquejes (Cabrera et al, 2006). Después de una semana se levantó un extremo de la cubierta plástica y a la siguiente el otro, para reducir la humedad relativa y favorecer la aclimatación (Castellanos et al, 2010). A las cuatro semanas se retiró totalmente la cubierta plástica y dos semanas después se cuantificaron la tasa de supervivencia (%); el número de hojas y la altura de planta (cm).

 

Análisis estadístico

Todos los experimentos tuvieron un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por tratamiento. La unidad experimental fue un explante por frasco o planta por maceta. El análisis de varianza de los datos obtenidos en los experimentos se hizo para cada híbrido y variable con el paquete de análisis estadístico SAS (SAS Institute, 2003) y la prueba de Tukey (p≤ 0.05) se usó para comparar las medias.

 

Resultados y discusión

Establecimiento del cultivo aséptico

La edad de la planta madre y la interacción con el tiempo de inmersión en NaOCl, fueron los factores que afectaron la supervivencia de los explantes en ambos híbridos (p≤ 0.05). Las mayores tasas de supervivencia se obtuvieron en explantes disecados de plantas de dos meses de edad; en promedio fue de 56% en 'Zacatepec 10' y 46% en 'Zacatepec 48'. En plantas de seis meses los porcentajes fueron de 30 y 10%, respectivamente. En la interacción, la supervivencia fue mejor cuando se combinaron explantes de plantas de dos meses de edad y tiempo de inmersión en NaOCl de 20 min en los dos genotipos (Figura 1).

Las diferencias en la supervivencia de explantes disecados de plantas de dos y seis meses de edad se debieron principalmente a la presencia de bacterias internas que compitieron con el explante por los nutrientes e inhibieron su crecimiento. En plantas de dos meses la presencia de látex fue baja; mientras que, en las de seis meses fue abundante. Como sucede en otras euforbiáceas, el látex limita el establecimiento del cultivo aséptico y en algunos casos es necesario disecar únicamente los meristemos (Airò et al, 2007; Xu et al, 2008; Kondamudi et al, 2009); probablemente la causa de la contaminación interna se deba a que el látex enmascara las bacterias y no hagan efecto los agentes desinfectantes.

Respecto a los tiempos de inmersión de los explantes, el NaOCl resultó poco efectivo para la desinfección superficial en ambos híbridos cuando se sumergieron por 15 minutos; la contaminación causada por bacterias impidió el crecimiento de los explantes. En contraste, con 25 minutos de inmersión los explantes no presentaron contaminación por bacterias, pero la baja tasa de supervivencia lograda fue resultado de la posible toxicidad del NaOCl que ocasionó la muerte de los explantes. El establecimiento del cultivo aséptico es el primer paso en la propagación in vitro, ya que los explantes se transfieren de condiciones in vivo a un ambiente de cultivo libre de microorganismos. El cultivo aséptico se considera satisfactorio si sobrevive una cantidad adecuada de explantes sin contaminación y se inicia el crecimiento (George y Debergh, 2008).

Si bien los tejidos vegetales se pueden desinfectar con diferentes agentes químicos (hipoclorito de calcio, cloruro de mercurio, plata coloidal estable, entre otros), el NaOCl se considera de los más efectivos. Este compuesto tiene una fuerte propiedad oxidante que lo vuelve altamente reactivo con aminoácidos, ácidos nucleicos, aminas y amidas (Smith, 2013). La concentración de NaOCl utilizada en esta investigación fue resultado de varios experimentos preliminares y se apoyó en reportes de trabajos previos efectuados con variedades comerciales de nochebuena (Pickens et al, 2005; Castellanos et al, 2010; Perera y Trader, 2010). También se tomó en cuenta la fragilidad de los explantes nodales de nochebuena porque son tejidos suaves que fácilmente pueden perecer cuando se superan estas dosis y tiempos de exposición.

Diversos trabajos sobre la propagación in vitro de nochebuena (Pickens et al, 2005; Castellanos et al, 2008, 2010; Perera y Trader, 2010) sugieren que el establecimiento del cultivo aséptico es factible sólo con lavado de los explantes con detergente e inmersiones en alcohol al 70% (1 min) y NaOCl 20% (15-20 min). Sin embargo, en ensayos preliminares con los híbridos 'Zacatepec 10' y 'Zacatepec 48' la aplicación de estos métodos fueron poco eficientes para controlar la contaminación, sobre todo la causada por hongos. Por ello, en los tratamientos de desinfección de los explantes del presente estudio se incluyó la inmersión en el fungicida Captán (4 g L^-1) previo al tratamiento de desinfección superficial con NaOCl.

 

Inducción de brotes

El número de brotes producidos por explante y la longitud de los brotes fueron afectados por la concentración de citocininas en ambos híbridos (p≤ 0.05). En todos los tratamientos se indujeron brotes por lo que la brotación fue de 100%. La mayor cantidad de brotes se obtuvo con 8.8 μM de BA; en contraste, la mayor longitud de brote se logró cuando el BAy la CIN se omitieron del medio de cultivo (Cuadro 1).

El alargamiento de la yema pre-existente y la producción de nuevos brotes en los explantes fueron inducidos por el BA y la CIN, pero inhibieron la longitud de los mismos. El tamaño promedio de los brotes en ambos híbridos fue de 1.03 cm. Los brotes generados con el medio de cultivo sin hormona fueron los más largos y principalmente se debió al alargamiento de la yema axilar pre-existente. A pesar de obtenerse la mayor cantidad de brotes con 8.8 μM de BA, éstos se arrosetaron y en los subcultivos posteriores se ennegrecieron. En cambio, la cantidad de brotes obtenidos con las dosis de 4.4 μM de BA y 8.8 μM de CIN resultaron estadísticamente similares y después de los subcultivos se alargaron y continuaron su crecimiento. Por ello, estas dosis hormonales se tomaron como las óptimas en la inducción de nuevos brotes (Figura 2).

Los resultados obtenidos en la etapa de inducción de brotes con 4.4 μM de BA y 8.8 μM de CIN difieren de los obtenidos en variedades comerciales y confirman que no todas las plantas responden igual a la propagación in vitro, aunque se trabaje con variedades dentro de la misma especie (Bhojwani y Dantu, 2013).

En esta investigación, la inducción de nuevos brotes se logró con BA y CIN adicionadas de forma separada al medio de cultivo. La eficiencia del BA ya se ha reportado en la propagación in vitro de nochebuena, pero no la de la CIN. En la variedad Winter Rose^®, Pickens et al. (2005) lograron la inducción mediante el cultivo de ápices en medio de cultivo suplementado con varias dosis de BA (desde 1.8 hasta 6.6 μM) en combinación con 2.8 μM de AIA; con estas dosis hormonales obtuvieron 2.5 brotes por explante. También en nochebuena de brácteas amarillas, Castellanos et al. (2010) lograron la inducción de cinco brotes en promedio con 4.4 μM de BA en combinación de 0.5 μM de ANA.

Por su parte, la CIN ya se había probado en la germinación de semillas de nochebuena, con nula efectividad, (Nataraja et al, 1973) y en la multiplicación efectiva de brotes combinada con el BA (Roy y Jinnah, 2001) pero no en la inducción de nuevos brotes. A pesar de ser una de las citocininas más comúnmente usadas en el cultivo de tejidos vegetales (Gaba, 2005), en nochebuena no se había precisado su eficacia. Por ello, los resultados obtenidos constituyen el primer aporte sobre la efectividad de la cinetina para inducir la brotación de yemas pre-existentes en segmentos nodales de nochebuena y la formación de nuevos brotes.

También se ha reportado la eficiencia del BA combinado con auxinas (AIA y ANA) en la inducción de brotes de nochebuena; sin embargo, también pueden inducir callos y representar un inconveniente cuando se desea la propagación clonal en esta ornamental. Perera y Trader (2010) reportaron que el cultivo de ápices de brote y yemas axilares de la variedad Prestige^® Red con 4 μM de AIA y dosis de BA (4 - 12 μM) indujo la formación de callos en la base de los explantes. Si bien estos callos pudieran ser útiles cuando se desea la organogénesis indirecta, embriogénesis somática o inducir variabilidad genética, en esta investigación se descartó el uso de auxinas porque el objetivo fue la obtención de plantas idénticas a la planta madre.

 

Multiplicación de brotes

En esta etapa, la citocinina afectó el número de brotes producidos por explante en ambos híbridos. En los dos híbridos, el TDZ favoreció la multiplicación de brotes mientras los valores altos de longitud de los mismos fueron promovidos con las dosis combinadas de BA y CIN (p≤ 0.05). La mayor cantidad de brotes se obtuvo con 0.46 μM de TDZ en ambos genotipos; 16.3 brotes en 'Zacatepec 10' y 14.4 en 'Zacatepec 48'. Sin embargo, muchos de estos brotes tomaron la apariencia de rosetas y cuando se subcultivaron a medio sin hormonas se tornaron de color café y no prosperaron. En cambio, los brotes procedentes de 0.23 μM de TDZ continuaron su crecimiento hasta alargarse. Aun así, los valores obtenidos con esta dosis fueron 2.9 veces superior a la mayor cantidad de brotes obtenida en la mejor dosis de BA y CIN (4.4 + 2.2 μM) en el híbrido 'Zacatepec 10' y 2.6 veces la alcanzada en 'Zacatepec 48'. La cantidad de brotes disminuyó conforme se incrementó la dosis de TDZ y ello se debió a que la mayoría de los explantes formaron callos (70%). En contraste, la combinación de 4.4 μM de BA y 2.2 μM de CIN favoreció el mayor tamaño de los brotes con 3.61 cm en 'Zacatepec 10' y 3.85 cm en 'Zacatepec 48' (Cuadro 2, Figura 2).

Un aspecto que resalta en los protocolos de propagación in vitro de nochebuena existentes es la ausencia como tal de una etapa de multiplicación, ya que se aplican las mismas condiciones usadas en la fase de inducción (Pickens et al., 2005; Castellanos et al., 2010; Perera y Trader, 2010). La efectividad del TDZ en la multiplicación de brotes es una nueva aportación para la propagación in vitro de nochebuena y su aplicación superó el efecto combinado del BA y la CIN. La morfogénesis in vitro depende en gran medida del balance de auxinas y citocininas, por lo que se emplean en la proliferación de brotes (Gaba, 2005).

Los resultados en la multiplicación de brotes de los híbridos de nochebuena 'Zacatepec' 10 y 'Zacatepec 48' mostraron la efectividad de la combinación de BA y CIN adicionada con auxina (0.5 μM de AIA) como se ha reportado en la literatura (Roy y Jinnah, 2001). Sin embargo, también se demostró que el TDZ superó la acción del BA y CIN y que este aspecto puede ser útil en la multiplicación de brotes si se usa en dosis adecuadas, ya que es una citocinina cuya acción en la morfogénesis in vitro es efectiva cuando se emplea en concentraciones bajas del orden de 0.01 a 0.4 μM (Lu, 1993). La única evaluación del TDZ reportada en nochebuena se hizo en la etapa de inducción de brotes, donde ninguna de las concentraciones probadas (2.3 - 23 μM) fue efectiva para la formación de nuevos brotes (Pickens et al, 2005). Estas dosis de TDZ superan al menos en 10 veces las probadas en el presente estudio y es probable que hayan resultado tóxicas para el explante y sea la causa de la nula respuesta obtenida.

 

Alargamiento de plantas y enraizamiento

El número de raíces emitidas por planta y la longitud de las mismas fueron afectados por la dosis de AIA en ambos híbridos. La altura de planta no fue significativa (p≤ 0.05). El porcentaje de enraizamiento fue de 100% en los tres tratamientos, pero la mayor cantidad y longitud de raíces se obtuvo con 2.8 y 5.6 μM de AIA (Cuadro 3, Figura 2). El enraizamiento es una de las etapas cruciales en la propagación in vitro. Pocas especies son capaces de emitir raíces en las etapas de inducción y multiplicación de brotes, lo que facilita el enraizamiento de plantas. En otras, como se observó en los híbridos de nochebuena, es necesario reducir la fortaleza del medio de cultivo a la mitad y añadir auxinas, para inducir la formación del sistema radicular (Bhojwani y Dantu, 2013). Las plantas in vitro de los híbridos 'Zacatepec 10' y 'Zacatepec 48' fueron capaces de producir raíces con la reducción del 50% de la concentración de las sales del medio de cultivo y la adición de AIA. En nochebuena de pigmentación amarilla el enraizamiento también fue eficiente con AIA, pero en dosis de 22.8 μM (Castellanos et al, 2010).

 

Aclimatación

El porcentaje de supervivencia, número de hojas y altura de planta fueron afectados por el tipo de sustrato en los dos híbridos (p≤ 0.05). La mayor tasa se logró con la mezcla de turba y perlita con 90% de supervivencia en 'Zacatepec 10' y 80% en 'Zacatepec 48' (Figura 2). En esta misma mezcla se alcanzaron los mayores valores de número de hojas y altura de planta (Cuadro 4). Los porcentajes de supervivencia son aceptables; no obstante lo ideal es que sobrevivan todas las plantas. Sin embargo, no siempre se logra porque las especies responden de forma diferente.Aunque en la producción de nochebuena es factible usar mezclas y sustratos, éstos se recomiendan cuando se trasplantan a macetas definitivas, ya que en el enraizamiento de esquejes es conveniente usar perlita, polvillo de coco o turba, entre otros (Ecke et al., 2004). La mezcla de perlita y turba mejora las propiedades físicas del sustrato; proporciona alta porosidad, buena aireación, alta capacidad de retención de agua, bajo pH, sanidad y estabilidad (Maher et al., 2008). Por ello, la mezcla de turba con perlita o vermiculita es ampliamente en la horticultura y aclimatación de plantas propagadas in vitro (Benton, 2005; Bhojwani y Dantu, 2013).

Este sistema de regeneración in vitro de nochebuena, via organogénesis a partir de yemas axilares de segmentos nodales, es una de las aplicaciones del cultivo de brotes recomendado para la propagación clonal de especies élites como lo son estos nuevos híbridos de nochebuena. Constituye el primer reporte de propagación in vitro de nochebuena que se inserta en un programa de mejoramiento genético de una especie ornamental en México. Este protocolo se integrará en la propagación de otros híbridos valiosos que se encuentran en proceso de evaluación agronómica y también podría utilizarse para propagar otras variedades de nochebuena y euforbiáceas. Además, podría aplicarse en la obtención de plantas in vitro para estudios s de organogénesis indirecta, embriogénesis somática, mutagénesis inducida o transformación genética.

 

Conclusiones

Se desarrolló un protocolo para la propagación in vitro de plantas de los híbridos mexicanos de nochebuena 'Zacatepec 10' y 'Zacatepec 48'. La regeneración de plantas fue vía organogénesis a partir de la brotación de yemas pre-existentes y la formación de nuevos brotes en segmentos nodales disecados de plantas madre de dos meses de edad. La inducción de brotes se logró con el medio de cultivo MS (1962) adicionado con BA y la multiplicación se alcanzó con el mismo regulador de crecimiento combinado con CIN y AIA, pero se mejoró sustancialmente con TDZ. Las plantas regeneradas produjeron raíces cuando se redujo a la mitad la concentración de los componentes del medio de cultivo y se adicionóAIA. La mayor supervivencia y crecimiento de plantas aclimatadas se obtuvo en la mezcla de turba + perlita (1:1 v/v).

 

Agradecimientos

Al INIFAP, a través de los Fondos Fiscales 2013, por el financiamiento otorgado al proyecto 'Generación de tecnologías para la propagación de nochebuena y cactáceas de importancia comercial'.

 

Literatura citada

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