Artículos

 

Fenoles totales y capacidad antioxidante estimada con los ensayos DPPH/ABTS en rosas en soluciones preservantes*

 

Total phenols and antioxidant capacity estimated with DPPH/ABTS assays in roses on preservative solutions

 

Nadia Zenil Lugo¹, Ma. Teresa Colinas León^1§, Cecilio Bautista Bañuelos², Tito Roque Vázquez Rojas¹, Héctor Lozoya Saldaña¹ y Ma.Teresa Martínez Damián¹

 

¹ Instituto de Horticultura-Universidad Autónoma Chapingo. Carretera México-Texcoco km. 38.5. 56230, Chapingo, Estado de México. Tel. 9521500. Ext. 5224. (zeluna@hotmail.com; cecilio_bautistaver@hotmail.com; tvazro@correo.chapingo.mx; picti87@gmail.com; teremd13@gmail.com). ^§Autor para correspondencia: lozcol@gmail.com.

 

* Recibido: enero de 2014
Aceptado: junio de 2014

 

Resumen

Tallos de rosa 'Freedom' se evaluaron en dos soluciones preservantes: 8-citrato de hidroxiquinoleina (HQC) y Chrysal CLEAR Professional 2^® T-bag (CHRYSAL) en un pulso de 24 h a temperatura ambiente (24 ± 2 °C, 75 % HR) y agua como testigo. Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones, la unidad experimental fue un tallo floral. Se evaluó la vida de florero, el contenido de fenoles totales con el método colorimétrico de Folin-Ciocalteauy la capacidad antioxidante total (caT) con los ensayos DPPH y ABTS tanto en hoja como en pétalo. Se realizó el ANOVA y correlaciones simples entre la caT y el contenido de fenoles, y entre ambos ensayos. Los resultados muestran que las soluciones preservantes promueven un aumento en la caT y contenido de fenoles totales en hoja, pero no en pétalo. Las hojas de los tallos florales tratados con CHRYSAL presentaron los mayores contenidos de fenoles totales y caT, mientras que el testigo los menores. La vida media de florero fue de: 13, 11 y 9 días para los tratados con CHRYSAL, HQC y el testigo, respectivamente. El contenido de fenoles totales presentó una estrecha relación positiva (α≥ 0.01) con la caT: 0.87 y 0.85 medida con el ABTS y 0.92 y 0.85 con el DPPH en hoja y pétalo respectivamente y también ambos métodos se correlacionaron entre sí positiva y significativamente (r= 0.91) en hoja y (r= 0.93) en pétalo.

Palabras claves: Rosa hybrida L., estrés oxidativo, vida de florero 'Freedom'.

 

Abstract

Rose stems 'Freedom' were evaluated in two preservative solutions: 8-hydroxyquinoline citrate (HQC) and Chrysal CLEAR^® Professional 2 T-bag (CHRYSAL) in a pulse of 24 h at room temperature (24 ± 2 °C, 75% HR) and water as control. A completely randomized design with four replications was used; the experimental unit was a flower stem. Vase life, total phenolic content with the colorimetric method Folin-Ciocalteauy, total antioxidant capacity (caT) with DPPH and ABTS assays in both leaf and petal was evaluated. ANOVA and simple correlations between caT and content of phenols and between both assays was made. The results show that preservative solutions promote an increase in caT and total phenolic content in leaf, but not in petal. The leaves of the flowering stems treated with CHRYSAL had the highest contents of total phenols and caT, while control the lowest. The average vase life was 13, 11 and 9 days for those treated with CHRYSAL, HQC and control, respectively. The total phenolic content showed a strong positive relation (α ≥0.01) with caT: 0.87 and 0.85 measured with ABTS and 0.92 and 0.85 with DPPH in leaf and petal respectively and also both methods were correlated positively and significantly with each other (r= 0.91) in leaf and (r= 0.93) in petal.

Keywords: Rosa hybrida L., oxidative stress, vase life 'Freedom'.

 

Introducción

Como resultado del proceso natural de senescencia, así como de los diferentes tipos de estrés a los que están sometidas las rosas de corte durante su almacenamiento y/o transporte, se presenta un incremento de las especies reactivas de oxígeno (ERO) y una pérdida de la capacidad antioxidante (Zimmermann y Zentgraf, 2004). Las ERO son altamente dañinas para la célula, ya que al reaccionar con lípidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos, estos modifican su estructura y función y ocasionan alteraciones metabólicas que conducen a la muerte celular (Sato et al., 2001), lo cual merma la calidad, vida de anaquel y valor comercial de las rosas (Hodges et al., 2004).

La vida de florero de las rosas (Rosa hybrida L.) es generalmente corta (Ichimura et al., 1999), para incrementarla se han desarrollado soluciones preservantes de gran aceptación comercial, los más efectivos en lograrlo son los que se usan a nivel consumidor (Ichimura et al., 2006). En clavel (Dianthus caryophyllus) y crisantemo (Dendratema morifolium) se ha demostrado que la utilización de soluciones preservantes por tiempos cortos entre 3 y 24 h con compuestos que actúen como secuestradores de radicales libres disminuyen los niveles de ERO e incrementan la vida de florero (Baker et al., 1977; Zheng y Guo, 1998) ya que aumentan los niveles de antioxidantes y enzimas implicadas en la defensa antioxidativa (Zheng y Guo, 1998).

Los antioxidantes son compuestos que retardan o previenen la oxidación de otras moléculas y su papel principal es terminar con las reacciones de oxidación e inhibir otras reacciones oxidándose ellos mismos. Con el fin de proteger a las membranas y organelos celulares de los efectos dañinos causados por las ERO, la planta posee mecanismos de defensa antioxidantes tanto enzimáticos como no enzimáticos distribuidos en los organelos celulares. Enzimas tales como la superóxido dismutasa (SOD, EC 1.15.1.1), catalasa (CAT, EC 1.11.1.6), peroxidasa (POD, EC 1.11.1.7), ascorbato peroxidasa (APX, EC 1.11.1.11) y glutatión reductasa (GR, EC 1.6.4.2) son ejemplos de mecanismos enzimáticos; mientras que algunas moléculas de bajo peso molecular tales como: fenoles, ascorbato, glutation, α- tocoferol y β-caroteno, pertenecen a los mecanismos no enzimáticos (Bowler et al., 1994).

Los métodos analíticos utilizados para determinar los niveles de antioxidantes dependen de los tipos de compuestos de interés. Los antioxidantes pueden ser analizados ya sea como un grupo funcional, grupos de antioxidantes o como antioxidantes individuales. Como grupo funcional pueden ser cuantificados como la capacidad antioxidante total (caT) con cualquiera de los siguientes ensayos: ABTS (ácido 2, 2'-azino-bis -3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), DPPH (2, 2- Difenil-1-picrilhidrazilo), DMPD (dicloridrato de N, N-dimetilpfenilendiamina), FRAP (poder antioxidante de reducción ferrica), ORAc (capacidad de absorción de radicales oxígeno), TRAP (potencial antioxidante reactivo total), procedimientos quimioluminiscentes y ensayo antioxidante celular (Lako et al., 2008), siendo los más usados el ácido 2, 2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico y el 2, 2- Difenil-1-picrilhidrazilo (Kuskoski et al., 2005).

Como grupo de antioxidantes, los principales ensayos incluyen la determinación del contenido de fenoles totales por el método Folin-Ciocalteu y el contenido total de antocianinas por diferencia de pH y espectofotometria. Mientras que técnicas como la cromatografía de gases, electroforesis capilar y cromatografía líquida con detección ultravioleta se utilizan para determinar los antioxidantes individuales en frutos, vegetales y otros extractos de plantas (Lako et al., 2008).

En los últimos años se ha incrementado el interés en el campo de la nutrición, salud y medicina en los extractos crudos de frutas, vegetales, semillas, hojas, raíces y corteza ricos en fenoles debido a sus propiedades antioxidantes (Rice-Evans et al., 1995; Kahkönenet al., 1999; Picó, 2012). Sin embargo, en campos como la fisiología y tecnología poscosecha, y en particular las ornamentales, hay pocos estudios. De ahí que esta investigación tuvo por objetivos: evaluar el efecto de dos soluciones preservantes sobre la vida de florero, la capacidad antioxidante total y el contenido de fenoles totales; así como determinar la correlación entre el contenido de fenoles y la caT y entre los métodos ABTS y DPPH en pétalos y hojas de rosa.

 

Materiales y métodos

Material vegetal. Se cosecharon tallos florales de rosa 'Freedom' cultivadas en invernadero en Coatepec Harinas, Estado de México. Las flores se cortaron por la mañana entre las 7:00 y las 8:00 am, se les aplicó Floralife^® 200 como solución pulso en la dosis que recomienda el producto. Se almacenaron en seco en la cámara fría para disminuir el calor de campo y al día siguiente se trasladaron al laboratorio donde se cortaron a una longitud de 70 cm ± 1, se defoliaron 20 cm en la base y se colocaron en agua (pH 8.1, CE 0.28 milimhos) por 2 h para hidratarlos.

Organización experimental: Se aplicaron dos preservantes como soluciones pulso por 24 h a temperatura ambiente (24 ± 2 °C): a) citrato de 8-hidroxiquinoleina (HQC), un germicida efectivo utilizado en flores de corte (Reid, 2002), a 200 mg L^-1 y b) Chrysal CLEAR Professional 2^® T-bag Floralife (CHRYSAL) el cual se preparó según las indicaciones del fabricante y adicionalmente se tuvo el testigo. Una vez aplicados los tratamientos a los tallos se les cortó un centímetro de la base y se colocaron individualmente en probetas graduadas de 250 mL conteniendo agua de la llave y se cambió ésta cada tercer día. Se realizó un muestreo destructivo antes de aplicar los tratamientos y a los 3, 6, 9 y 11 días de aplicados éstos. Las muestras tanto de pétalos como de hojas se guardaron en bolsas de plástico a - 20 °C hasta su análisis. Se midió la vida de florero, la caT y el contenido de fenoles totales.

Obtención del extracto. Los pétalos se liofilizaron. Las hojas se evaluaron al salir de congelación, se les eliminó el margen y la vena central y el resto se trituró finamente. Se pesaron 0.05 g de hoja y 0.005 g de pétalo; en ambos casos se adicionaron 10 mL de una solución etanol: agua destilada al 70%, el extracto de hoja se homogeneizó con un homogeneizador IKAT-25ª y se utilizó inmediatamente, en tanto que el de pétalo se agitó con un agitador Vortex^®, se tapó con parafilm^® y se dejó reposar por 18 h en refrigeración a 4 °C. Se prepararon dos extractos: uno para evaluar la caT y otro para los fenoles totales.

 

Variables evaluadas

Vida de florero. Se contó a partir del día en que las flores se colocaron en probetas hasta que el ≥ 50% de los tallos florales por tratamiento presentaron al menos uno de los siguientes síntomas de senescencia: 1) cabeceo, ruptura y/o ahorcamiento del tallo floral; 2) marchitamiento y caída de pétalos; y 3) abertura del botón floral excesiva o nula (González-Aguilar y Zavaleta-Mancera, 2012 y elaboración propia).

Contenido de fenoles totales. Se utilizó el método descrito por Waterman y Mole (1994). Se tomaron 300 µL del sobrenadante del extracto, 7.7 mL de agua destilada, 0.5 mL de Folin-Ciocalteu, después de 1 min y antes de 8 min se agregaron 1.5 mL de carbonato de sodio al 20%, esta mezcla se agitó, se dejó reposar 2 h en oscuridad y se tomó la absorbancia a 760 nm en un espectrofotómetro (Spectronic Genesys^® UV10). La cuantificación de los fenoles se realizó mediante una curva patrón de 20, 30, 40, 60 y 80 μg de ácido tánico. Los resultados se reportaron en mg de ácido tánico g^-1 de peso fresco (PF).

Capacidad antioxidante total. Se siguió la metodología descrita por Kuskoski et al. (2005), con modificaciones de Ozgen et al. (2006) y Thaipong et al. (2006). Éste método evalúa la actividad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC), se basa en la reducción de la coloración verde/azul producida por la reacción del radical ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS^•+) con el antioxidante presente en la muestra. El radical se obtuvo tras la reacción del ABTS^•+ (7 mM) en buffer acetato de sodio 20 mM (pH 4.5) y persulfato de potasio (2,45 mM, concentración final) incubados a temperatura ambiente (24 ± 2 ºC) y bajo oscuridad por 16 h y diluido en el mismo buffer hasta obtener una absorbancia de 0.70 (± 0.02) a 734 nm. La solución stock se mantiene estable a 4 ºC por varias semanas y la dilución hasta por 72 h (Ozgen et al., 2006).

Para el ensayo se colocaron 100 μL del extracto diluido (1: 5 con etanol agua 70:30) en tubos de fondo plano, se adicionaron 3900 μL del radical ABTS^•+ diluido, se agitaron manualmente y se dejaron reposar 2 h en la oscuridad, ya que según Ozgen et al. (2006) un tiempo de reacción largo provee una mejor estimación que un corto usando cualquiera de los dos métodos. Se dispuso de una curva de calibración donde el antioxidante sintético de referencia Trolox 1500 μM en etanol al 70%, se ensayó a una concentración de 0, 150, 300, 450, 600 y 750 μM (Thaipong et al., 2006) en las mismas condiciones (100 μL de Trolox en 3900 μL del radical ABTS^•+).

Para el método del DPPH se siguió la metodología citado por Kuskoski et al. (2005). Se basa en la reducción de la absorbancia medida a 515 nm del radical 2,2-difeni l-1-picrilhidracilo (DPPH^•) el cual se reduce en presencia de antioxidantes manifestándose un cambio de color. De forma similar al ABTS, se colocaron 100 μL de la muestra sin diluir en tubos de fondo plano, se adicionaron 3 900 μL del radical DPPH 100μM diluido en etanol al 80%, se agitaron y se mantuvieron en oscuridad por 2 h. La solución stock del radical DPPH^• se preparó diariamente. La curva de calibración se realizó usando Trolox 1500 μM como estándar a una concentración de 0, 300, 600, 900, 1200 y 1500 μM en etanol al 70% (Thaipong et al., 2006), en las mismas condiciones (100 μL de Trolox en 3 900 μL del radical DPPH^•). La concentración de DPPH^• en el medio de reacción se calculó por regresión lineal entre la absorbancia (nm) y el porcentaje de inhibición (%) ya que la lectura del radical DPPH^• recién preparado varia ± 40 nm. Para ambos métodos, los resultados se expresaron como actividad antioxidante equivalentes de Trolox (TEAC) en mM de equivalentes de Trolox g^-1 de peso fresco.

Diseño experimental. Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones, la unidad experimental estuvo representada por un tallo floral contenido en una probeta. Para el análisis bioquímico cada muestra se evaluó por cuatriplicado. El análisis de varianza se hizo con el paquete estadístico SAS versión 9, y la comparación de medias con la prueba Tukey (α≤ 0.05). Mediante el coeficiente de correlación de Pearson (r) se realizaron correlaciones simples del contenido de fenoles totales contra la capacidad antioxidante total medida por los ensayos ABTS y DPPH y entre ellos.

 

Resultados y discusión

Vida de florero. La vida de florero de los tallos florales tratados con HQC y Chrysal CLEAR Professional 2^® T-bag, fue de 11 y 13 días respectivamente; mientras que la del testigo fue de 9 días (Figura 1). Esto coincide con los resultados de Lukaszewska (1997) y Juárez et al. (2008), quienes demostraron la efectividad para mantener por más tiempo la vida de florero del HQC 200 mg L^-1 en Nerinebowdinne y del Chrysal RVB^® en rosa 'Black magic', respectivamente.

Capacidad antioxidante total y contenido de fenoles Totales. Como resultado de la aplicación de las soluciones preservantes se obtuvo mayor capacidad antioxidante total y contenido de fenoles totales en hojas, pero no en pétalo (α≤ 0.05), lo anterior se explica debido a que el deterioro de las hojas es más lento y puede ser revertido, como ocurre con la aplicación de algunos preservantes, mientras que la senescencia en pétalos es rápida e irreversible (Arora, 2008). Las hojas de los tallos tratados con Chrysal CLEAR Professional 2^® T-bag presentaron mayor caT medida por ambos métodos y mayor contenido de fenoles totales que el testigo todos los días de medición, mientras que los tratados con HQC únicamente el día 6, pero igual al CHRYSAL (Cuadro 1).

Al día 11, en el cual solo quedaban los tallos tratados con las soluciones preservantes, el mayor contenido de fenoles y de caT se registró en el tratamiento con CHRYSAL, con diferencias significativas en hoja, aunque no en flor, a las vez que duraron 2 días más en florero que lostratados con HQC. Según Howard et al. (2000), el contenido de compuestos fenólicos presentes en los vegetales, está influenciado por el tipo de cultivar, las condiciones agronómicas, estado de madurez, así como el manejo y tratamientos poscosecha a los que son sometidos. González-Aguilar y Zavaleta-Mancera (2012), reportaron que la aplicación de CaCl₂ a la solución de florero de dos variedades de gerbera promovió la acumulación de fenoles y retrasó la senescencia.

De manera similar, en este estudio, se considera que un mayor contenido de fenoles y de la caT en las hojas de las rosas tratadas con las soluciones preservantes (Cuadro 1) pudo proteger las células del daño oxidativo, y retrasó la senescencia. Scandalios (2005), sugiere que un aumento en la síntesis de antioxidantes no enzimáticos como el glutatión, ascorbato, α-tocoferol, carotenoides y fenoles disminuyen los daños oxidativos ocasionados por las ERO lo que se cree retarda el proceso de senescencia. Los compuestos fenólicos contrarrestan el efecto de los radicales libres, ya que poseen un amplio espectro de actividad bioquímica como antioxidantes y secuestradores de éstos (Proestos et al., 2005).

Correlación entre la capacidad antioxidante total y el contenido de fenoles totales. En el Cuadro 2, se observa una relación lineal positiva y significativa entre la caT obtenida por ambos ensayos (DPPH y ABTS) y el contenido de fenoles totales determinado por el método de Folin-Ciocalteu. El coeficiente de correlación (r) entre los fenoles y la caT medida con el ensayo ABTS fue de 0.87 y 0.85 y con el DPPH de 0.92 y 0.85 para hoja y pétalo, respectivamente. Dudonné et al. (2009), en un estudio en 30 especies diferentes de plantas, en las que se incluye R. damasena, encontraron entre la caT y el contenido de fenoles totales un r de 0.94 con DPPH y 0.97 con ABTS. Vinokur et al. (2006), también reportaron una correlación positiva y significativa de 0.79 con DPPH en 12 cultivares de rosa y Youwei y Younghong (2007) de 0.96 con ABTS en R. rugosa. Los compuestos fenólicos son considerados el principal grupo fitoquimico que contribuye a la actividad antioxidante de las plantas (Balasundram et al., 2006), esto explica la relación lineal positiva y significativa entre el contenido de fenoles totales determinado por el método de Folin-Ciocalteu y la caT obtenida por los ensayos DPPH y ABTS encontrada en este experimento (Cuadro 2).

Dicha relación no fue completamente lineal ya que el método de Folin-Ciocalteu es específico para compuestos fenólicos, y la actividad antioxidante también puede ser exhibida por compuestos no fenólicos (MacDonald-Wicks et al., 2006). Además es posible que se presenten interacciones antagonistas o sinergistas entre los compuestos fenólicos y otros metabolitos que pueden afectar la actividad (Odabasoglu et al., 2005).

 

Correlación entre los métodos DPPH y ABTS

A pesar de las diferencias metodológicas, los resultados obtenidos por ambos métodos permiten alcanzar conclusiones prácticamente similares (Kuskoski et al., 2005). Las correlaciones obtenidas por regresión lineal entre ambos ensayos (ABTS y DPPH) fueron altamente significativas en los cuatro días de medición: 0.91 en hoja y 0.93 en pétalo (Cuadro 3). Dudonné et al. (2009), en extractos acuosos de 30 plantas, al correlacionar ambos métodos encontraron resultados similares (r= 0.91). Lo cual indica que la capacidad antioxidante total de extractos de Rosa sp., puede medirse indistintamente con cualquiera de estos ensayos.

Dichos métodos se correlacionan entre si ya que se basan en una de las estrategias más aplicadas en la medida in vitro de la capacidad antioxidante total de un compuesto, mezcla o alimento, la cual consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radical, por lo que el cambio de la intensidad del color ocurre de forma proporcional con la concentración de antioxidantes de la muestra (Kuskoski et al. (2005).

 

Conclusiones

Los tallos florales de rosa tratados con las soluciones preservantes a nivel consumidor tuvieron mayor contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante total en sus hojas, lo cual se reflejó en el mantenimiento por más tiempo de la vida de florero. Tanto en pétalo como en hoja el contenido de fenoles totales y la capacidad antioxidante total, así como los ensayos DPPH y ABTS se correlacionaron positiva y significativamente, indicando que dichos ensayos pueden utilizarse independientemente como métodos analíticos para determinar niveles de antioxidantes.

 

Agradecimientos

Al ingeniero Anselmo Ángel Vázquez de la empresa Flores de Chiltepec SA de CV por su apoyo para la realización de este trabajo y aportación del material vegetal.

 

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