Artículos

 

Callogenesis de Heliconia collinsiana GRIGGS in vitro: establecimiento, inducción y proliferación*

 

Callogenesis of Heliconia collinsiana GRIGGS in vitro: establishment, induction and proliferation

 

Eleodoro Hernández-Meneses¹, María Cristina Guadalupe López-Peralta^2§ y Andrés Adolfo Estrada-Luna³

 

¹Postgrado en Recursos Genéticos y Productividad (PREGEP)-Fisiología Vegetal. (doromeneses@colpos.mx).

²PREGEP-Genética. Colegio de Postgraduados. 56230, Montecillo, Texcoco, Estado de México. Tel. (595) 9520200 Ext. 1540. cristy@colpos.mx.

³CINVESTAV-Unidad Irapuato. Departamento de Ingeniería Genética. (aestradaluna@yahoo.com). ^§Autora para correspondencia: cristy@colpos.mx.

 

* Recibido: marzo de 2013
Aceptado: octubre de 2013

 

Resumen

Las heliconias son plantas ornamentales cultivadas como flor de corte y maceta. En México se cultivan cada vez más en Estados que disponen de condiciones climáticas tropicales. Si bien ya es posible la propagación in vitro de heliconias mediante organogénesis directa, aún no se han podido establecer protocolos tanto de organogénesis como embriogénesis somática indirecta para la propagación masiva de genotipos élite. La finalidad de ésta investigación fue desarrollar un protocolo para la inducción y proliferación de callos in vitro en Heliconia collinsiana. Explantes de ápices de raíz, hoja, pecíolo y secciones transversales basales de pseudotallo se cultivaron en el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962) suplementado con 13.6, 27.1, 54.3, 81.4, 108.6 y 135.7 μM de 2,4-D, dicamba y picloram combinadas con carbón activado (0 y 0.5 g L^-1). Los cultivos se mantuvieron en oscuridad y a las cuatro, ocho y 12 semanas se evaluó el porcentaje de inducción de callos. Únicamente las secciones transversales basales de pseudotallo indujeron callos a las 12 semanas con 81.4 (100%) y 135.7 (90%) μM de 2,4-D y picloram, respectivamente, combinados con 0.5 g L^-1 de carbón activado. Éstos callos al subcultivarlos en 0, 4.5 y 9 μM de 2, 4-D en la etapa de proliferación respondieron diferente. Después de 16 semanas, sólo continuaron creciendo los callos inducidos con 81.4 μM de 2, 4-D en fotoperiodo de 16 h. Los callos generados con 135.7 μM de picloram se ennegrecieron a las cuatro semanas de cultivo en todos los tratamientos evaluados.

Palabras clave: carbón activado, dicamba, picloram, platanillo.

 

Abstract

Heliconias are grown as ornamental plants and cut flower pot. In Mexico is increasingly grown in States with tropical climatic conditions. While it is possible in vitro propagation of Heliconia by direct organogenesis, it has not yet been able to establish protocols for both indirect organogenesis and somatic embryogenesis for mass propagation of elite genotypes. The purpose of this research was to develop a protocol for callus induction and proliferation in vitro in Heliconia collinsiana. Explants of root tips, leaf, petiole and basal cross sections of pseudostem were cultivated in the culture medium of Murashige and Skoog (1962) supplemented with 13.6, 27.1, 54.3, 81.4, 108.6 and 135.7 μM of 2,4-D, dicamba and picloram combined with activated carbon (0 to 0.5 g L^-1). The cultures were kept in the dark and four, eight and 12 weeks were evaluated percentage of callus induction. Only cross sections calluses induced pseudostem at the baseline at 12 weeks with 81.4 (100%) and 135.7 (90%) μM of 2,4-D and picloram, respectively, combined with 0.5 g L^-1 of activated carbon. This callus by sub-cultivating them in 0, 4.5 and 9 μM of 2, 4-D in the proliferation stage responded differently. After 16 weeks, only the calluses induced continued to grow with 81.4 μM of 2, 4-D in photoperiod of 16 h. The callus generated with 135.7 μM of picloram got blackened at four weeks of culture in all the treatments.

Key words: activated carbon, dicamba, picloram, platanillo.

 

Introducción

Las heliconias son plantas ornamentales tropicales cultivadas comercialmente para la producción de flores para corte, o bien, como plantas de maceta, por sus colores brillantes y formas exóticas (Criley, 2000; Loges et al, 2007). El cultivo de estas plantas ornamentales en México se ha incrementado principalmente en los estados del Sur-Sureste que cuentan con las condiciones tropicales propicias para ello (Murguía et al, 2007). El problema principal que presentan las heliconias para obtener plantaciones clonales es que sólo se pueden propagar mediante división de rizomas ya que sexualmente (semillas) se genera variabilidad genética, especialmente cuando se trata de variedades.

Helicona collinsiana es una especie cultivada en México como flor de corte y al igual que otras especies y variedades presentan alto grado de hibridación natural que limita su propagación por semillas. Su inflorescencia es tipo colgante y la floración ocurre en los meses de julio a noviembre. Alcanza una altura de 3 a 4.5 m y se adapta muy bien para su cultivo en áreas con 50% de sombreado. La inflorescencia consta de 12 a 18 brácteas de color rojo brillante y cubiertas de cera blanca; el raquis es de color rojizo y su hábito de crecimiento es tipo musoide (Berry y Kress, 1991).

El uso de las técnicas del cultivo de tejidos vegetales in vitro representa una herramienta eficiente para propagar genotipos élite mediante la organogénesis directa; además, las plantas obtenidas están libres de enfermedades (Marulanda-Ángel et al, 2011). Los primeros estudios con esta técnica en heliconias fueron Nathan et al. (1992) quienes a través de yemas laterales lograron la regeneración de manera indirecta in vitro de H. psittacorum y encontraron que las plantas obtenidas produjeron más vástagos que las propagadas de forma convencional. Este mismo tipo de explante también fue eficiente para la propagación de H. standleyi (Sosa et al, 2008). Además de estos estudios, que se han enfocado a la propagación masiva de variedades de heliconias altamente comerciales disponibles para su cultivo en campo, también se ha explorado la posibilidad de inducir embriones somáticos; sin embargo, hasta la fecha no se ha logrado el establecimiento de un protocolo eficiente que permita propagar estas ornamentales mediante esta ruta morfogénica (Ulisses et al., 2007).

En esta especie ornamental, así como en otras relacionadas filogenéticamente, no se ha podido obtener la embriogénesis somática de manera directa; es por ello, que en esta investigación se buscó la inducción de callos de forma indirecta porque esta fase constituye la de diferenciación del tejido somático y la adquisición subsecuente de competencia embriogénica. Con base en éstos antecedentes, el presente trabajo tuvo como finalidad desarrollar un protocolo para la inducción y proliferación de callos en Heliconia collinsiana mediante el cultivo in vitro a partir de diferentes explantes en presencia de varias auxinas y carbón activado.

 

Materiales y métodos

Material vegetal y tipos de explante

A partir de plántulas asépticas desarrolladas in vitro de H. collinsiana se obtuvieron explantes de hoja, pecíolo, ápices de raíz y secciones transversales [thin cell layer (capas finas de células)] de la base del pseudotallo. Para los explantes de hojas se cortaron segmentos de 1 cm² de la lámina central con la nervadura principal mientras que de los pecíolos se usaron secciones longitudinales de 1 cm. En los explantes de raíz se obtuvieron secciones longitudinales de 1 cm incluyendo el ápice. Para obtener las secciones transversales de pseudotallo se cortaron segmentos basales de plántulas de 10 mm de diámetro con 1-2 mm de grosor (Figura 1).

Medio de cultivo

El medio de cultivo básico empleado estuvo constituido por las sales inorgánicas del medio de Murashige y Skoog (MS, 1962) suplementado con sacarosa (30 g L^-1), modificando las cantidades de: agar (Merck^®, 9 g L^-1), mio-inositol (200 mg L^-1) y tiamina (2 mg L^-1). El pH del medio se ajustó a 5.7 y se sirvieron 10 mL en frascos de cultivo de 45 mL, los cuales fueron esterilizados en autoclave vertical (AESA^® 300) a 121 °C y 1.5 kg cm^-2 de presión durante 20 min.

Inducción de callos

Se sembraron secciones de hoja, pecíolos, ápices de raíz y secciones transversales basales de pseudotallo en medio básico MS (1962) suplementado con 13.6, 27.1, 54.3, 81.4, 108.6 y 135.7 μM de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético Merck^®), dicamba (ácido 3-6-dicloro-o-anisico, Sigma^®) y picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico, Sigma^®). La siembra de los explantes se hizo sumergiéndolos en el medio de cultivo y conservando su polaridad. Se evaluaron 144 tratamientos, resultado de la combinación de cuatro tipos de explantes y 18 concentraciones de auxinas y carbón activado (0 y 0.5 g L^-1). Los frascos de cultivo se mantuvieron en condiciones de oscuridad a 26 ± 2 °C durante 12 semanas y se hizo un subcultivo a medio fresco a las seis semanas. A las cuatro, ocho y 12 semanas se hicieron observaciones para determinar el porcentaje de inducción de callos.

Proliferación de callos

Una vez definidas las condiciones hormonales óptimas y el mejor tipo de explante para la inducción de callos in vitro se probaron tres concentraciones de 2, 4-D para evaluar su efecto en la proliferación de los callos. Como explantes se usaron masas de callos (aproximadamente 400 mg) que se sembraron en medio MS (1962) suplementado con 0, 4.5 y 9.0 μM de 2, 4-D y 0.5 g L^-1 de carbón activado. Los cultivos se incubaron a 26 ± 2 °C en condiciones de fotoperíodo de 16 horas e intensidad luminosa de 45 μmol m^-2 s^-1 durante 16 semanas haciendo subcultivos a medio fresco cada cuatro semanas. A las 4, 8, 12 y 16 semanas se contabilizó el peso fresco de callo (g).

Análisis estadístico

Los experimentos se condujeron en un diseño completamente al azar en arreglo factorial. Cada tratamiento tuvo diez repeticiones (un explante por frasco). El análisis de varianza se realizó con el paquete de Análisis Estadístico SAS (SAS Institute, 2003) y la prueba de Tukey (p< 0.05) se usó para comparar las medias.

 

Resultados y discusión

Inducción de callos

Los explantes de secciones transversales basales de pseudotallo fueron los únicos que emitieron callos. Los explantes de hoja, pecíolo y raíz se ennegrecieron y murieron a las cuatro semanas de cultivo. Las diferencias estadísticas (p< 0.05) detectadas revelaron que el tipo y dosis de auxina unida al carbón activado, así como su interacción, tuvieron efectos significativos en el porcentaje de inducción de callos a las cuatro, ocho y 12 semanas de cultivo. Sin embargo, el mayor efecto sobre la inducción de callos fue producido por el tipo de auxina en los tres períodos de evaluación (40.1% de la variación total).

Capacidad morfogénica del tipo de explante para la inducción de callo

Las secciones transversales de pseudotallo fueron los únicos explantes que generaron callos por lo que mostraron capacidad morfogénica para responder a la inducción de callo a las 12 semanas de cultivo cuando se cultivaron con 2,4-D (81.4 μM) y picloram (135.7 μM) (Cuadro 1). Esta capacidad para formar callos se debe a que en este tipo de tejido es posible encontrar células epidérmicas, corticales, cambiales, tejido perivascular y medular así como células de parénquima que pueden conducirse a un programa morfogénico in vitro específico si reciben las condiciones de cultivo adecuadas (Teixeira da Silva, 2003). Éstas mismas células son las que pueden tener la capacidad para responder a las concentraciones de 2,4-D y picloram y continuar con la percepción y transducción de señales dentro de una ruta morfogénica deseada (Fehér, 2005). Por el contrario, los explantes de hoja, pecíolo y ápices de raíz se ennegrecieron totalmente después de cuatro semanas de su establecimiento in vitro en todos los tratamientos evaluados, por lo que resultaron ineficaces para la generación de callos (Figura 2).

La nula respuesta obtenida con explantes de hoja y pecíolo se debe a que en estos tejidos las células no fueron capaces de adquirir actividad meristemática y por tanto no respondieron a ninguna de las concentraciones de auxinas y perecieron. A pesar de que cualquier parte de la planta es factible de emplearse como explante, no todos los tejidos tienen la totipotencia celular para responder a estímulos externos que disparan la competencia para generar callos, en un inicio, y posteriormente, la organogénesis o embriogénesis somática (Fehér et al., 2003). Otro aspecto a considerar es que los explantes se deben utilizar en la etapa de desarrollo correcta. En general se deben usar tejidos jóvenes porque pueden ser más susceptibles de responder a las señales externas de inducción y reprogramación celular (Deo et. al., 2010). En el caso de los explantes de ápices de raíz, hoja y pecíolo utilizados en el presente estudio se observó que no tuvieron esa capacidad intrínseca para responder a las concentraciones utilizadas 2,4-D, dicamba y picloram por lo que se descartaron para futuros estudios.

Efecto del tipo de auxina y dosis en la inducción de callo

El 2,4-D y picloram fueron las auxinas que indujeron la formación de callos cuando se combinaron con 0.5 g L^-1 de carbón activado mientras que con el dicamba la respuesta fue nula (Cuadro 1). En todas las concentraciones de dicamba los explantes se ennegrecieron y por ello se descartó como auxina inductora de callo. Los callos generados con el 2,4-D fueron de consistencia compacta y de coloración blanca mientras que los producidos con el picloram fueron friables y de color amarillento. El picloram per se ha sido una auxina eficaz para la inducción de callo embriogénico en algunas especies como Manihot esculenta (Atehnkeng et al, 2005) pero en otras como Phyla nodiflora debe ser combinado con otras auxinas (2,4-D) u otros componentes del medio de cultivo (Ahmed et. al., 2011).

Incluso, en Musa spp., especie relacionada filogenéticamente con Heliconia, el picloram es eficiente para la inducción de callo embriogénico en ápices de brote, superando la acción del 2,4-D (Filippi et al., 2001). Por su parte, el dicamba también es una auxina que se usa en la inducción in vitro de callos. Aunque en el presente estudio esta auxina no promovió la inducción de callos, sí ha resultado útil en explantes de secciones longitudinales de yemas de Musa spp., (grupo AAA) donde 10 μM indujeron callos que después se convirtieron en estructuras embriogénicas (Filippi et al., 2001). También se ha demostrado que esta auxina ha sido más eficiente para la proliferación de callos en explantes de flores masculinas inmaduras de Musa spp., (grupo AAA), de las variedades Lalkela y Grande Naine, más que en la inducción de los mismos (Sidha et al., 2007).

La eficacia del 2,4-D en la inducción de callos radica en que puede actuar directamente como auxina o indirectamente modificando el metabolismo intracelular del AIA. También se le considera como un ''agente estresante'' inductor de respuesta (Feher et al, 2003). Además, el 2,4-D es más efectivo en la inducción de la embriogénesis somática que el AIA endógeno, debido a que la auxina artificial no se puede metabolizar en las células vegetales (Stasolla et al., 2004). Es por ello que en muchas especies de Musa ésta auxina ha sido la que mejores resultados ha brindado para el establecimiento de callos a partir de yemas florales y ápices de brotes (Jalil et al, 2003; Strosse et al, 2006; Smitha y Ashalatha, 2010).

Respecto al papel del carbón activado en la respuesta morfogénica, cuando se omitió del medio de cultivo la inducción de callo fue nula en todas las concentraciones y fuentes de auxinas evaluadas. Todos los explantes probados se tornaron de color café oscuro hasta ennegrecerse totalmente al término de cuatro semanas (Cuadro 2, Figura 2). Ésta respuesta dejó de manifiesto que el carbón activado es un compuesto indispensable debido a que inhibe los ácidos fenilacético y benzoico así como sus derivados y otros compuestos tóxicos incoloros (Srangsam y Kanchanapoom, 2003).

Además, juega el papel como adsorbente irreversible de compuestos inhibidores del crecimiento de los explantes en el medio de cultivo (Thomas, 2008). La nula respuesta obtenida en los explantes cultivados sin carbón activado se debe a que muchas especies vegetales son ricas en compuestos fenólicos y las heliconias no son la excepción. Después de las heridas hechas por los cortes durante la disecación de los explantes. Beyl (2005) ha señalado que, los compuestos fenólicos se oxidan por acción de polifenol oxidasas y no sólo tornan color café el tejido sino que también inhiben la actividad de varias proteínas que afectan negativamente la inducción de callo.

Un aspecto que es importante resaltar es el tiempo que tomó la inducción de callo (12 semanas) que es un lapso considerablemente superior al que se puede observar en algunas especies relacionadas filogenéticamente con Heliconia como Musa sp., y Zingiber officinale donde la inducción ocurre en las primeras cuatro semanas de cultivo en oscuridad (Jalil etal., 2003; Strosse et al, 2006; Lincy et al, 2009). Éste consumo de tiempo se debe a que las heliconias son especies de hábito de crecimiento lento. En Heliconia chartacea, variedad ' Sexy pink', Ulisses et al. (2007) indujeron la formación de callos en secciones de ovarios después de casi 13 semanas de cultivo en oscuridad con 45.5 μM de 2,4-D pero los callos fueron de apariencia friable y de color amarillento y no prosperaron en estructuras embriogénicas.

Interacción fuente y concentración de auxina mezcladas con carbón activado en la inducción de callo

La mejor respuesta de inducción de callos se obtuvo en secciones transversales de pseudotallo cultivadas con 81.4 μM de 2,4-D y 0.5 g L^-1 de carbón activado. Los porcentajes fueron 40% a las cuatro semanas, 80% a las ocho semanas y 100% a las 12 semanas. Las dosis de 108.6 y 135.7 μM de 2,4-D también indujeron callos pero en proporción decreciente por lo que probablemente resultaron tóxicas para el explante. En contraste, el picloram promovió la inducción de callos de forma directamente proporcional conforme se incrementó la dosis. Alcanzó el máximo porcentaje de inducción (90%) con 135.7 μM combinado con el carbón activado después de 12 semanas de cultivo (Cuadro 2, Figura 3).

En el presente estudio el 2,4-D fue la mejor auxina para la inducción de callo en secciones transversales basales de pseudotallo de plántulas in vitro de H. collinsiana combinado con carbón activado (0.5 g L^-1) superando al picloram y dicamba. Ello se debe a que esta auxina se considera una molécula de señalización que juega un papel importante en la reactivación del ciclo celular y la división en células diferenciadas indispensables para la iniciación de los procesos del desarrollo. Esta reactivación del ciclo celular se alcanza por la expresión de ciertos genes de respuesta a auxina (Karami y Saidi, 2010).

Proliferación de callos

Los callos obtenidos bajo las condiciones óptimas definidas en la etapa de inducción de callo a las 12 semanas se pasaron a condiciones de fotoperíodo normal durante dos semanas manteniéndolos en el medio de cultivo suplementado con 81.4 μM de 2, 4-D y 135.7 μM de picloram. En seguida se pasaron a medio MS (1962) sin fitohormonas con la finalidad de promover la proliferación del callo. Sin embargo, todos los callos se ennegrecieron y no continuaron su crecimiento después de cuatro semanas de cultivo. Por esta razón, se evaluaron callos provenientes de 2,4-D y picloram en otras dosis de 2, 4-D (0, 4.5 y 9 μM) que se adicionaron al medio de cultivo MS (1962) y se cuantificaron sus efectos en la proliferación de los callos.

El análisis estadístico (p< 0.05) de los tres tratamientos evaluados reveló que la proliferación de callos fue afectada significativamente por las concentraciones de 2,4-D a las ocho, 12 y 16 semanas. El crecimiento de los callos a las cuatro semanas no fue significativo entre tratamientos. El mayor crecimiento de callo se obtuvo con 4.5 y 9.0 μM de 2, 4-D a las 16 semanas de cultivo. La cantidad de callo registrada hasta este tiempo con estas concentraciones de auxina fue en promedio más de 18 veces superior a la cantidad inicial sembrada (Cuadro 3). Los callos inducidos con 81.4 μM de 2,4-D y subcultivados en medio sin hormonas se tornaron de color café hasta ennegrecerse, mientras que con 4.5 y 9.0 μM de 2, 4-D se volvieron de color verde claro y continuaron creciendo después de cuatro semanas de cultivo en fotoperiodo (Figura 4). En contraste, los callos procedentes de 135.7 μM picloram se ennegrecieron y no prosperaron en ninguna de las concentraciones de 2, 4-D donde se subcultivaron.

Si bien, en la mayoría de los protocolos en los que las auxinas actúan como un inductor eficaz de los callos, su proliferación se logra con la reducción o eliminación de la auxina del medio de cultivo. En los callos de heliconia no se observó este comportamiento. En algunas especies de plantas se requieren de las auxinas para continuar la proliferación de los callos (Jiménez y Thomas, 2005) y este fue el comportamiento observado en los callos de Heliconia collinsiana, donde la eliminación del 2, 4-D del medio de cultivo provocó el ennegrecimiento de los callos.

Aunque en los callos obtenidos con el 2,4-D sólo fue posible observar masas compactas sin el desarrollo de nódulos, que podrían ser indicadores de embriones somáticos como sucede en Musa (Jalil et al. 2008), con este protocolo se sientan las bases para, en un futuro y controlando las condiciones de fotoperiodo y componentes del medio de cultivo y hormonas, se pueda inducir la embriogénesis somática en esta especie ornamental o establecer algún programa de transformación genética.

 

Conclusiones

En el presente estudio fue factible inducir la formación de callos in vitro en explantes de secciones transversales basales de pseudotallo de Heliconia collinsiana cultivados en medio MS (1962) adicionado con 2,4-D (81.4 μM) y picloram (135.7 μM) combinado con 0.5 g L^-1 de carbón activado durante 12 semanas en oscuridad. Con estas concentraciones hormonales se obtuvieron 100% y 90% de inducción, respectivamente. En la etapa de proliferación, los callos generados con 81.4 M de 2, 4-D continuaron su crecimiento cuando se subcultivaron en medio MS (1962) suplementado con 4.5 y 9 μM de 2, 4-D a las 16 semanas en fotoperiodo de 16 h. Los explantes de ápices de raíz, segmentos hoja y pecíolo fueron incapaces de generar callos en ninguno de los tratamientos probados.

 

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