Artículos

 

Inducción in vitro de raíces de Carica papaya mediante Agrobacterium rhizogenes y ácido 3-indolbutírico*

 

In vitro induction of Carica papaya roots through Agrobacterium rhizogenes and 3-indolebutyric acid

 

Manuel de Jesús Bermúdez Guzmán¹, Pedro Valadez Ramírez², Marco Tulio Buenrostro Nava², Gilberto Manzo Sánchez² y Salvador Guzmán González^2§

 

¹ Campo Experimental Tecomán- INIFAP. Autopista Colima-Manzanillo, km 35. Tecomán, Colima, C. P. 28100, México. Tel: (313) 32 29405 Ext-52250.

² Universidad de Colima, Laboratorio de Biología Molecular y Cultivo de Tejidos Vegetales. Autopista Colima-Manzanillo, km 40. Tecomán, Colima, C. P. 28100, México. ^§Autor para correspondencia: sguzman@ucol.mx.

 

* Recibido: enero de 2013
Aceptado: agosto de 2013

 

Resumen

El enraizamiento de plántulas in vitro es una de las etapas más importantes en el proceso de micropropagación y en C. papaya ha sido una de las principales limitantes, obteniéndose porcentajes de sobrevivencia inferiores al 50%. El presente trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Colima en 2009. Con el propósito de inducir un sistema radicular eficiente, se evaluaron brotes de papaya var. "Maradol" de aproximadamente 3 cm de longitud que fueron inoculados con A. rhizogenes a concentraciones de 1x10⁷, 1x10⁸ y 1x10⁹ células mL^-1 y establecidos en medio MS con acetosiringona (100 mM) y floroglucinol (25 mg/L). Para el experimento con la auxina, los brotes se subcultivaron en medio líquido MS con 0, 1, 2, 3, 4 y 5 μM de AIB; se incubaron en oscuridad durante 126 h, seguido del subcultivo en sustrato BM2+sales minerales del MS. Ninguno de los brotes inoculados con las concentraciones bacterianas formó raíces; en contraste, 100% de los brotes tratados con AIB a una concentración de 3 μM formaron raíces. Con lo anterior se demuestra que las plántulas de C. papaya posiblemente no son susceptibles a la cepa A4 de A. rhizogenes, mientras que el empleo de AIB resultó ser la opción más viable y efectiva para la inducción in vitro de raíces en brotes de papaya.

Palabras clave: C. papaya, A. rhizogenes, auxina, enraizamiento, micropropagación.

 

Abstract

In vitro rooting of seedlings is one of the most important steps in the process o f micropropagatio n and in C. Papaya has been one of the major limiting, having survival percentages below 50%. The present research was conducted in the laboratory of Biotechnology of the University of Colima in 2009. In order to induce an efficient root system, evaluated papaya shoots var. "Maradol" of approximately 3 cm length, inoculated with A. rhizogenes at concentrations of 1x10⁷, 1x10⁸ and 1x10⁹ cells ml^-1 and established on MS medium with acetosyringone (1 00 mM) and phloroglucinol (25 mg / L). For the experiment with auxin shoots were subcultured in MS liquid medium containing 0, 1, 2, 3, 4 and 5 μM IBA; incubated in the dark for 126 h, followed by subculture in substrate BM2 + MS mineral salts. None of the inoculated shoots with bacterial concentrations formed roots; in contrast, 100% of the treated shoots with IBA to a concentration of 3 μM formed roots. With the above demonstrates that seedlings of C. papaya may not be susceptible to strain A4 A. rhizogenes, while the use of IBA proved to be the most viable and effective option for in vitro root induction in shoots of papaya.

Palabras clave: C. papaya, A. rhizogenes, auxin, rooting, micropropagation.

 

Introducción

A nivel mundial México es el quinto productor de papaya con una producción aproximada de 616 215 toneladas por año (FAOSTAT, 2010); en el estado de Colima aporta una importante derrama económica para el desarrollo de la comunidad productora, por lo que se ha ido incrementando su extensión y producción, convirtiéndose este cultivo en uno de los tres principales después del limón y el plátano (COEPAPAYA, 2008). Debido a lo anterior se ha incrementado la demanda de plantas con características homogéneas deseables; por esta razón, como alternativa de producción masiva de plantas de papayo, se han hecho diversos estudios sobre la micropropagación de la misma (Yu et al., 2000; Guzmán-González et al, 2005;Ascencio-Cabral et al, 2008; Kaity et al, 2009); sin embargo, la etapa de enraizamiento representa la principal limitante (Guzmán-González et al, 2005; Kaity et al, 2009), aún mediante la aplicación de hormonas de crecimiento (Damiano et al., 1991).

En plantas de papaya, se ha logrado la inducción de raíces in vitro exponiendo brotes en ácido 3-indolbutírico (AIB) a 10 μM durante 3 días, seguido de un subcultivo sin auxinas (Guzmán-González et al, 2005), así como a la exposición de 2.5 μM de AIB en completa oscuridad durante una semana y posteriormente en medio sin la hormona (Yu et al., 2000). Sin embargo, se obtienen sistemas radiculares deficientes, lo que origina una baja tasa de sobrevivencia (menor a 60%) (Guzmán-González et al, 2005).

Como estrategia a este problema, en muchas especies vegetales se ha empleado a A. rhizogenes, un patógeno natural del suelo que infecta principalmente a plantas dicotiledóneas herbáceas o leñosas, en el proceso de enraizamiento de la micropropagación para obtener un sistema radicular eficiente (MacRae y Van Staden, 1993; Rugini et al, 1993; Damiano et al, 1995; Caro et al, 2000; Martins et al, 2003).

En el caso de la papaya no se tienen reportes sobre la eficiencia en la inducción de raíces utilizando A. rhizogenes, con base en las experiencias antes mencionadas este trabajo tiene como propósito evaluar el efecto de la inoculación de distintas concentraciones de la agrobacteria (1x10⁷, 1x10⁸ y 1x10⁹ células mL^-1) y ácido 3-indolbutírico (0, 1, 2, 3, 4 y 5 μM de AIB) sobre la formación de raíces in vitro en brotes de papaya.

 

Materiales y métodos

La presente investigación se realizó en el laboratorio de Biología Molecular y Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad de Colima, ubicado en el km 40 de la autopista Colima-Manzanillo, en el municipio de Tecomán. Se muestrearon papayas inmaduras colectadas de la comunidad de "Los Asmoles", Tecomán. El municipio se encuentra entre los paralelos 18° 40' y 19° 08' de latitud norte y los meridianos 103° 37' y 103° 59' de longitud oeste. La altitud oscila entre 0 y 1 200 msnm con una temperatura de entre 22-28 °C y un clima cálido subhúmedo y semiseco con lluvias en verano con una precipitación de 600 a 1 100 mm.

Generación de brotes de papaya. Las plántulas fueron generadas mediante embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos (Cai et al, 1999) obtenidos de semillas de frutos inmaduros de plantas de papaya hermafroditas de tres meses de crecimiento. La desinfección superficial de los frutos se realizó durante 1 h en una solución de cloro comercial al 20% (v/v) con dos gotas de Tween 20/L; se enjuagaron con etanol al 70% y se partieron con un cuchillo estéril. Se extrajeron las semillas, se les retiró la sarcotesta con pinzas y bisturí y el embrión cigótico fue extraído con un corte de bisturí evitando su daño.

Posteriormente, los embriones (tipo torpedo) fueron colocados en cajas de petri conteniendo medio MS al 50% de la concentración de sales, 10 mg L^-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a pH 5.8 y 0.8% de fitagel.

Se incubaron durante ocho semanas en oscuridad a 27 °C hasta la aparición de los embriones somáticos y se subcultivaron por periodos de cuatro semanas para inducir su multiplicación en medio de maduración compuesto por las sales MS a 80%, 0.9 μM de bencilaminopurina (BA) y 0.1 μM de ácido naftaleno acético (ANA). Se incubaron a 27±1 °C y un fotoperíodo de 16 h luz al día. Después de cuatro semanas, las masas embriogénicas diferenciadas (color verde) se colocaron en medio de regeneración, compuesto por sales MS, 0.32 μM de BA, 0.06 μM de kinetina (KIN) y 0.16 μM de ANA y solidificado con 0.8% de fitagel. Se incubaron a las condiciones de luz y temperatura antes mencionadas hasta obtenerse plántulas de 3 cm de longitud aproximadamente.

Cepa de Agrobacterium rhizogenes. Se utilizó la cepa A4 de A. rhizogenes, ésta bacteria es de tipo agropina y contiene el plásmido silvestre Ri que confiere el fenotipo de raíces pilosas y el vector binario pESC4, que contiene el gen marcador de selección de la neomicina fosfotransferasa (nptII) bajo el control del promotor y terminador nos y el gen reportero de la β-glucuronidasa (gus) bajo el control del promotor cab y el terminador ocs. Las bacterias se mantuvieron en cajas de Petri, conteniendo medio YM sólido complementado con 50 mg L^-1 de rifampicina y 50 mg L^-1 de kanamicina. Se incubaron durante 72 h a 27 °C y se almacenaron a 4 °C. Posteriormente, fueron subcultivadas cada mes para mantener las generaciones bacterianas frescas al momento de la inoculación (Serna-Pérez y Pérez-Molphe, 2002).

Verificación de la presencia del plásmido Ri y el vector binario ESC4 en A. rhizogenes.

Se purificó DNA plasmídico de la cepa A4 de A. rhizogenes con el kit de extracción QIAGEN. Este DNA fue utilizado como molde para la amplificación de los genes rolB, gus y nptII mediante PCR. El primer gen se encuentra en la región vir del plásmido Ri y los otros dos genes marcadores se encuentran contenidos en el plásmido ESC4. La reacción de PCR se llevó a cabo de acuerdo a Serna-Pérez y Pérez- Molphe, 2002, y consistió de 100 μM de dNTPs, 1 μM de cada iniciador específico para cada gen (Cuadro 1), 1.5 U de Taq DNA polimerasa, 1.5 mM de MgCl₂ y amortiguador de reacción 1X. La mezcla se llevó a un volumen final de 25 uL con agua desionizada estéril.

Las condiciones de reacción fueron: desnaturalización inicial por 3 min a 94 °C, desnaturalización durante 1 min a 94 °C, alineamiento durante 1 min a 55°C y extensión durante 3 min a 72 °C con 30 ciclos y una extensión final por 5 min a 72 °C (Serna-Pérez y Pérez-Molphe, 2002). Luego, los productos de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio (10 mg mL^-1) y finalmente capturado con un fotodocumentador.

Inoculación de brotes de papaya con A. rhizogenes. Una masa pequeña de bacterias fue tomada de un cultivo en medio sólido e inoculada en medio YM líquido, complementado con 50 mg L^-1 de rifampicina y 50 mg L^-1 de kanamicina. Se incubó durante 72 h a 27 °C con agitación orbital a 120 rpm (Serna-Pérez y Pérez-Molphe, 2002) y se determinó la concentración de las células bacterianas utilizando la cámara de Neubauer. Se prepararon diluciones a concentraciones de 1x10⁷, 1x10⁸ y 1x10⁹ células mL^-1.

Las plántulas de papaya de aproximadamente 3 cm de longitud fueron heridas con bisturí en la parte basal, luego se sumergieron durante 45 min en las suspensiones bacterianas a concentraciones de 0, 1x10⁷, 1x10⁸ y 1x10⁹ células mL^-1; se eliminó el exceso de líquido con una gasa esterilizada. Después de la inoculación, los brotes se transfirieron a medio de cultivo MS libre de hormonas y complementado con 0, 50 y 100 mM de acetosiringona y uno más con 100 mM de acetosiringona combinado con 25 mg L^-1 de floroglucinol, utilizando como soporte el sustrato BM2. Luego, se incubaron a 25 ± 1 °C en la oscuridad durante 72 h y posteriormente a la misma temperatura pero con 16 h luz (Serna-Pérez y Pérez-Molphe, 2002).

Como control positivo se utilizaron segmentos de zanahoria (Blanco et al, 2003), los cuales se enjuagaron con agua corriente, se les eliminó la cáscara con ayuda de un cuchillo y se desinfectaron mediante la inmersión en etanol al 95% (v/v) durante 10 s, seguido de la inmersión en solución de NaOCl al 1% durante 15 min. Los cortes transversales fueron de aproximadamente 0.5 cm de grosor y se colocaron en cajas de Petri conteniendo medio M (Becard y Fortin, 1988). Los explantes de zanahoria se inocularon mediante incisiones en el floema, el xilema y el cámbium vascular con un bisturí previamente sumergido en la suspensión bacteriana a 1x10⁸ células mL^-1. Se incubaron en oscuridad a 27 °C.

Expresión de la β-glucuronidasa (GUS) en brotes de C. papaya y raíces de zanahoria. Para la prueba histoquímica de la expresión del gen gus se preparó una solución X-glcA, compuesta por 1 mL de amortiguador 2X (0.1M de citrato de sodio y 0.2 N de HCl) a pH 7.0, 0.02 mL de 0.1M de K4Fe(CN)6 3H2O, 0.02 mL 0.1M de ^Fe(CN)6, 1 mg de 5-bromo-4cloro-3-indoxil β-D-glucurónido (X-glcA) disuelto en 0.1 mL de metanol, 0.01 mL de Triton X-100 10% (p/v) y 0.85 mL de agua destilada desionizada estéril. La solución final se esterilizó mediante filtros de 45 um de tamaño de poro. Se colocaron los brotes de papaya en tubos Eppendorf hasta cubrirlos por completo con la solución preparada y se incubaron durante 12 h a 37 °C (Vitha et al, 1993). De manera similar se cortaron las raíces transformadas de zanahoria con ayuda de un bisturí y se procedió de la misma forma.

Inducción de raíces en brotes de papaya utilizando AIB.

Se utilizaron brotes de papaya de aproximadamente 3 cm de longitud con cuatro a cinco hojas bien desarrolladas; éstos se transfirieron a tubos de 1.5 x 19 cm conteniendo 4 mL de medio de maduración complementado con 0, 1, 2, 3, 4 y 5 μM de AIB e incubados en oscuridad durante 126 h. Posteriormente, los brotes se cultivaron en frascos con sustrato BM2, sales al 100% del medio MS y libre de hormonas, e inmediatamente se incubaron en una cámara de crecimiento a condiciones de temperatura de 27 ± 1 °C y fotoperíodo de 16 h, durante cuatro semanas.

Arreglo experimental y análisis estadístico. El experimento con inoculación de A. rhizogenes fue bifactorial (factor A= tres concentraciones de A. rhizógenes y factor B= cuatro concentraciones de inductores: tres de acetosiringona y uno de acetosiringona combinado con floroglucinol) con arreglo combinatorio y distribución completamente al azar, lo que dio un total de 12 tratamientos y cuatro repeticiones tomando como unidad experimental tres frascos con tres explantes cada uno. Para el experimento utilizando AIB a concentraciones de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 μM, los tratamientos fueron distribuidos completamente al azar con cuatro repeticiones y la unidad experimental fue la anteriormente descrita.

Para la medición de las variables en ambos experimentos se cuantificó el porcentaje de brotes que formaron raíces, número de raíces primarias, número de raíces secundarias y longitud de raíces primarias. Los datos se sometieron a análisis de varianza y prueba de medias de Duncan al 0.05% de probabilidad mediante el paquete estadístico SAS (1998) (Montgomery, 2004).

 

Resultados y discusión

El comportamiento observado sobre la no formación de raíces in vitro en tejido de brotes de papaya inoculadas con A. rhizogenes (cepa A4) posiblemente se debió a que la especie C. papaya empleada en este estudio no sea compatible con la agrobacteria, no activándose el mecanismo de reconocimiento y establecimiento de infección entre planta-bacteria (Valderrama-Fonseca et al, 2005). Por otra parte Serna-Pérez y Pérez Molphe (2002), en plantas de toronja y lima inoculadas con la misma cepa bacteriana, reportan porcentajes de explantes que formaron raíces del 78% en toronja Duncan, 68% en toronja Río Red y 60% en lima dulce. También, es posible que la cepa empleada no haya tenido la capacidad de infectar células de papaya, ya que esta reportado que otras cepas de A. rhizogenes como la LBA9402, inoculada en hojas de C. papaya variedad "yellow-large", induce formación de raíces pilosas hasta 74.8% en un periodo de 1 a 4 semanas (Cabrera-Ponce et al, 1996).

Con base en lo anterior, se evaluó el tipo de tejido de papaya inoculado y se observó que tallo y hoja no mostraron formación de raíces en respuesta a la inoculación de la cepa A4 de A rhizogenes; en contraste, los resultados obtenidos por Rodríguez-Hernández et al. (2007), en Agave salmiana, obtuvieron formación de raíces pilosas en hoja, tallo y raíz, a cualquiera de las concentraciones bacterianas empleadas (1x10⁷-1x10⁹ células mL^-1) y con la misma cepa (A4). De igual manera el hecho observado en explantes de cotiledón de rubia (Rubia tinctorum) inoculados con la cepa2 628, solo formaron callo, mientras que los inoculados con las cepas 15 834, R1 000 y 9 365, mostraron la formación de raíces pilosas (Ercan et al, 1999). Con lo anterior se demuestra que el tipo de cepa es un factor importante para la infección del explante y lo más probable es que C. papaya no es susceptible a la cepa A4 de A. rhizogenes empleada.

Verificación de la presencia del plásmido Ri y el vector binario ESC4 en la cepa A4 de A. rhizogenes. Los productos de PCR separados en geles de agarosa por electroforesis muestran que la bacteria contiene el plásmido Ri y el vector binario ESC4, ya que luego de analizar el gel en transiluminador, se observaron las bandas correspondientes a los genes rolB (780 pb) en los carriles 1 y 2, gus (1200 pb) en los carriles 3 y 4 y nptII (517 pb) en los carriles 5 y 6 con sus respectivos pesos moleculares (Figura 1), evidenciándose la presencia de los plásmidos Ri y ESC4 contenidos en la cepa A4 de A. rhizogenes.

Inoculación de brotes de papaya con A. rhizogenes. Después de dos semanas de la inoculación evaluando el tipo de explante (tallo y hoja) con la solución bacteriana a una concentración de 1x10⁸ células mL^-1 de A. rhizogenes, no se obtuvo evidencia de formación de raíces pilosas en ninguna parte del explante. Además, el tejido vegetal presentó necrosis y amarillamiento, mientras que los explantes utilizados como control (sin inocular) permanecieron verdes.

La funcionalidad de A. rhizogenes se comprobó utilizando cortes de zanahoria empleados como control positivo; aproximadamente 100 raíces por segmento de zanahoria crecieron por la parte superior del explante brotando de las incisiones que se hicieron con el bisturí (Figura 2). También se inocularon los segmentos de zanahoria con bacterias tomadas directamente de la placa con asa bacteriológica; sin embargo, no hubo presencia de raíces pilosas en los segmentos de zanahoria inoculados de esta forma.

Expresión de la β-glucuronidasa (GUS) en tejido de C. papaya y raíces de zanahoria.

Brotes de papaya inoculados con A. rhizogenes con 2-3 semanas se les realizó la prueba histoquímica; dos horas después fue visible el color azul característico de la expresión del gen gus en el tejido de papaya (Figura 3). Lo anterior indica que las agrobacterias están presentes en el tejido vegetal, sin embargo, el hecho de no observarse raíces pilosas probablemente se deba a una expresión transitoria (Chávez-Camacho et al, 2002) o que se trate de residuos bacterianos adheridos a la superficie del tejido. Por otra parte, como se esperaba, los controles no presentaron expresión del gen gus en el tejido.

Los resultados de la expresión del gen gus en las raíces de zanahoria contenidas en la solución X-glcA mostraron de 4 a 5 raíces que se tornaron color azul; es decir, aproximadamente 20%, por lo que se confirma con esta prueba la eficiencia de la cepa A4 de A. rhizogenes para infectar y producir raíces pilosas (Figura 4).

Enraizamiento de brotes de C. papaya utilizando AIB. El mejor tratamiento fue 3 μM de AIB, con el cual se obtuvo 100% de enraizamiento, una longitud de las raíces de 4.9 mm y 7.5 raíces primarias por explante, pero no hay diferencias estadísticas con otros tratamientos, mientras que la mayor longitud de raíces (9 mm) se obtuvo con 5 μM de AIB (p= 0.05). En relación al número de raíces laterales, el tratamiento con 3 y 4 μM de AIB produjeron el valor más alto (2).

Todas las raíces presentaron anatomía gruesa y de 3 a 4 hojas verdes bien desarrolladas. De manera similar Yu et al, 2000, utilizaron 2.5 μM de AIB, y reportaron porcentajes de enraizamiento de 90 y 94.5% en brotes de C. papaya cultivados en vermiculita como sustrato en condiciones de aireación y no aireación, respectivamente; sin embargo las raíces que se formaron tienen una constitución gruesa, lo cual dificulta el proceso de aclimatación.

Por otra parte, nuestros resultados son similares a Kaity et al, 2009, quienes obtuvieron 100% de enraizamiento en brotes de papaya, utilizando AIB a una concentración de 10 μM y como sustratos fitagel y vermiculita, con lo cual reportan que los brotes indujeron raíces pilosas de buena calidad y estructura, lo que facilita la aclimatación de las plántulas de C. papaya (Cuadro 2).

 

Conclusiones

La formación del sistema radicular in vitro en brotes de C. papaya var. Maradol fue más eficiente mediante el tratamiento con AIB a una concentración de 3 μM en comparación con la inoculación de A. rhizogenes cepa A4 a concentraciones de 1x10⁷-1x10⁹ células mL^-1. Ninguna parte de tallo y hojas de brotes generados in vitro de C. papaya mostró susceptibilidad a la infección con la cepa A4 de A. rhizogenes.

 

Agradecimientos

El presente trabajo de investigación es producto de una tesis de licenciatura con la cual el primer autor obtuvo el grado de Licenciado en Biología. Un amplio agradecimiento a la Universidad de Colima y al Dr. Salvador Guzmán González, Director del Laboratorio de Biotecnología, por la prestación de la infraestructura necesaria y al Ing. Pedro Valadez Ramírez por el apoyo técnico.

 

Literatura citada

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