Artículos

 

Efecto de la inoculación con bacterias rizosféricas en dos variedades de trigo. Fase I: condiciones controladas*

 

The effect of innoculation with rhizospheric bacteria on two varities of wheat. Phase1: controlled conditions

 

Carlos José Bécquer Granados^1§, Danielle Prévost², Christine Juge², Carole Gauvin² y Sandra Delaney²

 

¹ Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus. Apdo 2255. Z. P. 1, Sancti Spíritus, Cuba. ^§Autor para la correspondencia: pastossp@yayabo.inf.cu.

²Agriculture and Agri-Food Canada, Sainte-Foy Research Centre, Québec, Québec, Canada.

 

* Recibido: diciembre de 2011
Aceptado: julio de 2012

 

Resumen

Se llevó a cabo un experimento bajo condiciones controladas para determinar la respuesta de dos variedades de trigo a la inoculación simple y combinada realizada con Sinorhizobium y Azospirillum. Se utilizó una cepa de A. zeae, y dos cepas pertenecientes a S. meliloti. Los materiales y métodos aplicados correspondieron a lo descrito en las metodologías prestablecidas en este campo de estudio. Diseño experimental: completamente aleatorizado, con 20 tratamientos y 4 réplicas. No se utilizó tratamiento fertilizado. Se evaluaron diferentes variables agronómicas, relacionadas con la arquitectura radical y la biomasa aérea. Análisis de varianza bifactorial. En caso de aparecer diferencias, se aplicó análisis de varianza de un factor a la interacción en primera instancia, o a los factores probados. Diferencias entre medias por LSD de Fisher. Se transformaron datos de conteo de dígitos por √x. Se calculó correlación y regresión múltiple entre variables. Se concluye que la inoculación combinada de Sinorhizobium con Azospirillum, así como la inoculación simple con Sinorhizobium, resultaron de alta importancia en las alternativas de inoculación que se realizaron en el experimento. Existió una alta diferenciación entre las dos variedades de trigo en determinadas variables agronómicas, lo que indica una influencia marcada de las características varietales de las plantas. Se observó una fuerte relación estadística entre las variables peso seco aéreo y variables de la raíz para los tratamientos inoculados con A2 y A2+N7, respectivamente.

Palabras clave: Triticum aestivum, cepas, inoculación combinada, variedades,

 

Abstract

The experiment was carried out under controlled conditions to determine the response of the two wheat varieties to the simple inoculation and the combined inoculation which was carried out with Sinorhizobium, and Azospirillum. A strain of A. zeae and two strains belonging to S. meliloti were used. The materials and methods that were applied corresponded to what was described in the already established methodologies in this field of study. Experimental design: completely randomized, with 20 treatments and 4 replicas. Fertilizing treatment was not used. Different Agronomic variables were evaluated, related to the radical architecture and the biomass area. Analysis of the biofactorial variance. In the event that differences appeared, the variance analysis of a factor of first instance interaction or of approved factors was applied. Differences between methods by LSD of Fisher. Count data of digits by √x were transformed. The correlation and multiple regressions between variables were calculated. It is concluded that the combined inoculation of Sinorhizobium with Azospirillum, just like the simple inoculation with Sinorhizobium resulted to be of high importance in the inoculation alternatives that were carried out in the experiment. There was a great difference between the two wheat varieties in certain agronomical variables, which indicates a marked influence of the varietal characteristics of the plants. A strong statistical relation was observed between the variables dry air weight and the root variables for the treatments of inoculation with A2 y Av2+N7, respectively.

Key words: Triticum aestivum L., strains, combined inoculation, varieties.

 

Introducción

El efecto positivo de las bacterias rizosféricas, en plantas no pertenecientes a la familia de las leguminosas, como las gramíneas, es un hecho científico demostrado por diferentes autores (Chabot et al., 1996; Antoun y Prévost, 2005; Anya etal., 2009). La primera zona del vegetal que comúnmente enfrenta la colonización de dichas bacterias está constituida por las raíces, y al respecto, varios autores (Harari et al., 1988; Martin et al., 1989) demostraron que la inoculación con Azospirillum brasilense incrementa la longitud de la raíz, número de raíces secundarias y de pelos radiculares en plantas de trigo.

Entre las bacterias con efecto estimulador del crecimiento vegetal, Azospirillum constituye una de las más prometedoras, ya que esta bacteria coloniza la rizosfera de numerosos cultivos en zonas tropicales y subtropicales. Diferentes mecanismos, como la producción de fitohormonas, reducción de nitratos, y la fijación del dinitrógeno, se le han atribuido a la misma para explicar su efecto positivo en las plantas (Steenhoudt y Vanderleyden, 2000). En el presente trabajo se utilizó una cepa de A. zeae conocida por incrementar el rendimiento de maíz en experimentos de campo (Mehnaz et al, 2010). Aunque no se cuenta con antecedentes de inoculación de A. zeae en trigo, los datos obtenidos en maíz se consideran muy promisorios también para otros cereales, además del hecho a tomar en cuenta de que esta especie es de más rápido crecimiento que otras especies de Azospirillum (Lazarovits, George, com. pers.).

Otros géneros bacterianos, como los rizobios, pueden colonizar no sólo las raíces de las leguminosas, sino también las de plantas pertenecientes a otras familias. Según Matiru y Dakora (2003), la infección rizobiana en dichas especies probablemente sea más común en la naturaleza que lo que se consideraba anteriormente. Según Dakora (2003), los rizobios producen diversos metabolitos como auxinas, citoquininas, riboflavinas y vitaminas, las cuales pueden actuar como sustancias promotoras del crecimiento vegetal. En el presente experimento se utilizaron dos cepas de Sinorhizobium meliloti, el cual se conoce como altamente eficiente por su efecto estimulador del crecimiento vegetal en trigo bajo condiciones de campo de Sancti Spiritus, Cuba (Bécquer et al., 2007; Bécquer et al., 2008).

Por otra parte, se conocen trabajos sobre la coinoculación con bacterias pertenecientes a diferentes géneros, capaces de producir sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal y de lograr un efecto positivo en diversos cultivos de forma sinérgica (Carolina y Lorda, 2009; Rodríguez et al., 2009).

Es por ello que el objetivo general de esta investigación se centró en determinar la influencia de la inoculación simple y combinada con Azospirillum y Sinorhizobium, en la arquitectura radical y en la biomasa aérea de plántulas de trigo, cultivadas bajo condiciones controladas.

 

Materiales y métodos

Procedencia de la cepa de Azospirillum: se utilizó la cepa N7, perteneciente a Azospirillum zeae y donada por Agriculture and Agri-Food Canada (London).

Procedencia de las cepas de rizobios: se utilizaron las cepas A2 y NRG34, pertenecientes a Sinorhizobium meliloti y donadas por Agriculture and Agri-Food Canada (Quebec).

Variedades de trigo y procedencia: se evaluaron las variedades de trigo (Triticum aestivum): Barrie y Hoffman, donadas por Agriculture and Agri-Food Canada (Quebec).

Procedimiento experimental: se efectuó acorde a metodologías de evaluación de leguminosas (Somasegaran y Hoben, 1994) ya que no se tenían antecedentes para experimentos con cereales: todas las cepas crecieron en medio solido Levadura-Manitol (Vincent, 1970) y se resuspendieron en medio líquido Levadura-Manitol hasta lograr una concentración de células viables de 10⁷-10⁸ UFC/mL. Se utilizaron bolsas estériles que se sembraron inicialmente con 4-5 semillas y se les añadió 25 mL de la solución nutritiva Hoagland (Prévost et al., 1987). Las plantas fueron raleadas hasta dejar 1 planta por bolsa, a los tres días de siembra. Posteriormente se aplicó el inóculo bacteriano en cantidad de 1 mL/semilla, el cual originalmente presentaba una concentración celular de 10⁷10⁸ UFC/mL y diluido en proporción de 1:10 mediante una solución salina estéril (0.85% NaCl). Las plantas crecieron en una cámara de condiciones controladas, sometidas a un régimen de periodicidad luminosa de 16 h-luz (300 μE/m²/s) a 26 ºC durante el día y 22 ºC durante la noche.

La humedad relativa fue ajustada a 75/85% (Somasegaran y Hoben, 1994). La cosecha y evaluación fueron realizados a las tres semanas de siembra con la utilización de técnicas de evaluación agronómicas convencionales para ensayos bajo condiciones controladas (Somasegaran y Hoben, 1994), así como con un escáner LA2400 y el programa computarizado WinRHIZO (Regent Instruments Canada), para la medición de las variables longitud promedio de las raíces, diámetro promedio de las raíces y número de raíces laterales.

Diseño experimental y análisis estadístico: se usó un diseño experimental bifactorial, completamente aleatorizado, con el objetivo de evaluar dos variedades (Hoffman y Barrie), con 6 tipos de inoculaciones diferentes, un control absoluto (no-inoculado) y 4 réplicas (Somasegaran y Hoben, 1994). Factor 1: Inoculación. Factor 2: variedad. Para cada variedad de trigo, se aplicaron los siguientes tratamientos: control absoluto (no-inoculado), NRG34, A2, N7, NRG34+N7, A2+N7 (factor inoculación). Los datos fueron estadísticamente procesados con el uso de análisis de varianza bifactorial y modelos generales lineales, mediante el programa estadístico MINITAB (MINITAB Inc., v.13 para Windows). Las medias se compararon mediante LSD de Fisher (p< 0.001). En el caso de las variables longitud del tallo y diámetro promedio de la raíz, al aplicar el análisis de varianza, se observaron diferencias solo para el factor variedad, por ello se aplicó la prueba t-Student para varianzas iguales. Se localizó el análisis de correlación entre diámetro promedio de la raíz y longitud promedio de la raíz, así como regresión múltiple para describir el posible impacto de factores concernientes a la parte radical de la planta sobre la biomasa aérea (Ostle, 1984). Se evaluaron las variables: peso seco aéreo (g/planta), peso seco radical (g/planta), longitud del tallo (cm), longitud promedio de las raíces (cm), diámetro promedio de las raíces (mm) y número de raíces laterales/planta.

 

Resultados y discusión

En el análisis de varianza, se observaron diferencias significativas (p< 0.001) para el factor variedad.

En el Cuadro 1 se observó que para longitud del tallo existieron diferencias significativas entre variedades (p<0.001), donde Hoffman presentó los más altos valores (3.62 cm). También esta misma variedad presentó valores estadísticamente superiores (p< 0.001) en peso seco radical, con 0.034 g/planta. El diámetro promedio de las raíces fue, así mismo, superior en Hoffman, con 0.46 mm.

Con respecto al número de raíces laterales, la variedad Hoffman resultó estadísticamente superior (p< 0.05), con 17.36 un/planta (valores transformados).

Si tenemos en cuenta la superioridad estadística de la variedad Hoffman en estas variables, pudiéramos inferir que existió una alta diferenciación entre los representantes de las dos variedades. Esta diferencia de significación estadística pudiera indicar una influencia marcada del genotipo vegetal en determinadas variables agronómicas de la planta. Dóbbelaere et al. (2002) y Pecina-Quintero et al. (2005) consideraron que la respuesta de la planta a la inoculación depende de factores diversos, como los componentes físico-químicos del suelo, genotipo de la planta y microflora autóctona del suelo. Aunque el presente experimento se realizó bajo condiciones controladas, es obvio notar que el genotipo de las plantas marcó diferencias en los resultados de algunas variables. Askary et al. (2009) encontraron que la coinoculación de trigo con Azospirillum brasilense y Sinorhizobium meliloti influyó favorablemente en determinados parámetros de crecimiento de la planta, pero que esos resultados dependieron también de las variedades de trigo utilizadas.

Como complemento sólido a las observaciones anteriores, se pueden considerar los resultados obtenidos en la combinación de los factores variedad e inoculación con las variables número de raíces laterales (Cuadro 2), donde la interacción entre estos dos factores en el análisis de varianza mostró una diferencia altamente significativa (p< 0.001).

Los valores estadísticamente más altos se encontraron entre el tratamiento Hoffman+A2 (18.55), seguido por el tratamiento Barrie+NRG34+N7 (18.13) y Hoffman-Control (17.87), tratamientos que entre ellos compartieron letras comunes. A su vez, Hoffman+A2 fue superior al resto de los tratamientos, excepto a los anteriormente mencionados. El hecho de que Hoffman-Control compartiera letras comunes con los tratamientos que resultaron estadísticamente superiores, puede deberse precisamente, a la influencia notable del factor variedad en algunas variables, como en el número de raíces laterales, ya visto en el Cuadro 1. Es de destacar que fue precisamente la combinación de NRG34+N7, lo que permitió obtener resultados superiores en Barrie, mientras que la misma combinación en Hoffman (16.86), situó estadísticamente a esta variedad muy por debajo de los dos primeros tratamientos (Cuadro 2). Es posible que para la variable estudiada, la cepa NRG34 ejerciera mayor efecto en la planta que A2, a pesar de pertenecer ambas al mismo género y especie (Sinorhizobium meliloti). Esa influencia de la bacteria en la planta, al parecer responde a variaciones en la secreción de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal a un nivel interespecífico. Según Biswas etal. (2000), la inoculación con determinadas cepas de rizobios puede inducir un número mayor de pelos radicales y raíces laterales en arroz, lo cual favorece, por lo tanto, una mayor extracción de nutrientes por la planta.

El factor inoculación presentó diferencias significativas (p< 0.005) en el análisis de varianza para las variables peso seco aéreo, longitud promedio de la raíz, diámetro promedio de la raíz y número de raíces laterales.

Se observó que en peso seco aéreo existieron diferencias significativas (p< 0.005) con valores superiores en los tratamientosA2 (0.036 g/planta) yA2+N7 (0.036 g/planta), con respecto al control absoluto (0.029 g/planta). Asimismo, existieron incrementos de 24.14 % en esos dos tratamientos, en comparación con el control absoluto (Cuadro 3). Hilali et al. (2001) informaron aumentos de 24% en el peso seco aéreo de trigo sembrado en Arcilla Merchouch, al inocularlo con Rhizobium leguminosarum. Askary et al. (2009) aseguraron que la coinoculación de trigo con A. brasilense y S. meliloti ejerció mayor efecto en el rendimiento y contenido de macroelementos de la planta, que las inoculaciones simples con esas mismas bacterias. Bonilla et al. (2009) dieron a conocer resultados que fueron estadísticamente superiores en la biomasa aérea de maíz y sorgo coinoculados con Azospirillum y Azotobacter, en condiciones de invernadero.

Por otra parte, en longitud promedio de las raíces se observó que los tratamientos A2 (0.036 g/planta) y A2+N7 (0.036 g/planta) también resultaron estadísticamente superiores (p< 0.005) al resto de los tratamientos (Cuadro 3). Estos resultados pudieran explicarse por el efecto de las fitohormonas segregadas por estas cepas con una influencia directa en el desarrollo radical, con énfasis en el alargamiento longitudinal. La producción de la auxina indol-3-acido acético (AIA), está reconocida como un factor importante en las habilidades directas de Azospirillum brasilense en su efecto promotor del crecimiento vegetal (Dóbbelaere et al., 2001). Asimismo, Ilyas y Bano (2010) encontraron que la inoculación de trigo con A. brasilense desarrolló el sistema radical con mayor longitud de las raíces, mayor número de raíces laterales y mayor alargamiento de los pelos radicales, y se correlacionaron las cepas más eficientes con las de mayor producción de fitohormonas. Existen evidencias que los rizobios pueden ejercer un efecto positivo en el alargamiento del sistema radical en arroz (Biswas et al., 2000). Si tenemos en cuenta que la coinoculación de cultivos con el empleo de diferentes géneros bacterianos ha conllevado a efectos positivos (Tejeda et al, 2009), resulta lógico inferir que en la actual variable que se analiza, la combinación de cepas ante s mencionada ejerciera el mayor efecto sinérgico.

Sin embargo, en diámetro promedio de las raíces, el control absoluto (0.45 mm) fue estadísticamente superior (p< 0.005) a los tratamientos inoculados A2 (0.42 mm) y A2+N7 (0.41 mm), aunque presentó letras comunes con el resto de los tratamientos (Cuadro 2). Este resultado pudiera deberse a que la acción de las auxinas, supuestamente segregadas por las bacterias inoculadas, está primariamente encaminada al alargamiento celular y no al de la multiplicación celular (Fruton y Simmonds, 1963). A tal efecto, el análisis de correlación realizado entre diámetro promedio de las raíces y longitud promedio de las raíces (-0.91), indica una interrelación negativa entre éstas. Por otra parte, Vázquez y Torres (1981) plantearon que las auxinas, al realizar cambios en la plasticidad de la pared celular, primero provocan el alargamiento de la misma, y posteriormente, su engrasamiento.

Se observó que el número de raíces laterales fue estadísticamente superior (p< 0.005) en A2 (307.50 un/ planta) y NRG34+N7 (17,49 un/planta), con respecto al control absoluto (15.71 un/planta) y presentó superíndices comunes con el resto de los tratamientos (Cuadro 3). El valor estadísticamente más bajo correspondió al control absoluto (251.91 un/planta).

En el presente experimento, la inoculación simple con Azospirillum no arrojó resultados estadísticamente superiores en ninguna de las variables estudiadas, pero si lo mostró en la aplicación simple de Sinorhizobium, o en la combinación de los dos géneros bacterianos. Yanni et al. (2001) afirmaron que los rizobios pueden inducir cambios en el sistema radicular, en cuanto a número de raíces, entre otras variables. Según Biswas (1998), la inoculación con rizobios con capacidad de promover el crecimiento vegetal, conlleva a cambios morfológicos en las raíces, especialmente en número, diámetro y longitud de las mismas. Torres et al. (2003) encontraron que en Phaseolus vulgaris, los tratamientos coinoculados con A. brasilense y Rhizobium leguminosarum, presentaron mayor número de raíces laterales. Como se evidencia de estos resultados, la presencia de Sinorhizobium en las combinaciones realizadas, fue un factor importante en el efecto positivo de la inoculación sobre la planta.

Al efectuar un análisis de regresión múltiple para los tratamientos inoculados, donde se tomó como variable dependiente (Y) la variable peso seco aéreo, y como variables independientes (X₁, X₂ y X₃) a longitud promedio de las raíces, diámetro promedio de las raíces y número de raíces laterales, se obtuvo un coeficiente de determinación de R²= 0.80 (p< 0.001), el cual hace inferir de que en general, la aplicación de los inóculos, de forma simple o combinada, fue capaz de influir en el desarrollo de la biomasa aérea, a partir del desarrollo del sistema radical. Al respecto, los autores del presente trabajo tomaron como fundamento científico, lo informado por Fallik y Okon (1999), Dalla-Santa et al. (2004), Mostajeran et al. (2002) y Wu et al. (2005); de que el incremento de raíces laterales y pelos radicales por la inoculación con rizobacterias, conlleva a un aumento de la superficie radical y a una mayor capacidad de absorción de nutrientes, lo que se convierte en el factor principal para el crecimiento de la planta.

Ya que los análisis de regresión siempre presuponen la intervención de errores involucrados en la medición de las variables independientes, o de factores relacionados con dichas variables, difíciles de identificar (Castillo, 2005), los autores del presente experimento sólo pueden inferir discretamente en la interpretación de los resultados obtenidos. En este trabajo se tomó en cuenta la inoculación como factor causal. Este factor indudablemente conllevó a cambios en el sistema radical, y posiblemente a variaciones en el peso seco aéreo de la planta. También es conveniente tener en cuenta que las variables independientes analizadas no presentaban una alta interrelación entre sí, o la misma fue negativa, aunque Sigarroa (1985) consideró que dichas variables no tienen necesariamente que estar no correlacionadas. Una investigación más profunda es altamente recomendable para hallar las causas específicas de las variaciones en la variable dependiente que se estudia.

 

Conclusiones

La inoculación combinada de Sinorhizobium con Azospirillum, así como la inoculación simple con Sinorhizobium, resultaron de alta importancia en las alternativas de inoculación que se realizaron en el experimento.

Existió una alta diferenciación entre las dos variedades de trigo en determinadas variables agronómicas, lo que indica una influencia marcada de las características varietales de las plantas.

Se observó una alta relación estadística entre las variables peso seco aéreo y las variables longitud promedio de la raíz, diámetro promedio de la raíz y número de raíces laterales, para todos los tratamientos inoculados de forma simple, o combinada.

 

Agradecimientos

El autor principal agradece el apoyo de la beca concedida por el Centro de Desarrollo Internacional, Ottawa, Canadá.

 

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