Artículos

 

Germinación in vitro de cactáceas, utilizando zeolita como sustrato alternativo*

 

Cacti in vitro germination by using zeolite as alternative substrate

 

Lidia Rosaura Salas-Cruz^1§, Rahim Foroughbackch-Pournabav¹, María de Lourdes Díaz-Jiménez³, María Luisa Cárdenas-Ávila² y Alfredo Flores-Valdes³

 

¹ Departamento de Botánica. Universidad Autónoma de Nuevo León. Av. Universidad s/n. San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México. C. P. 66451. Tel. 01 818 3159880, 3598158 y 3598158. (rahimforo@hotmail.com). ^§Autora para correspondencia: biolidiasalas@yahoo.com.mx.

² Departamento de Biología Celular y Genética. Universidad Autónoma de Nuevo León. (cardenasavila@ yahoo.com).

³ Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Unidad Saltillo. Carretera Saltillo-Monterrey, km 13.5. Ramos Arizpe, Coahuila, México. C. P. 25900. Tel. 01 844 4389600. Ext. 8520. (lourdes.diaz@cinvestav.edu.mx), (alfredo.flores@cinvestav.edu.mx).

 

* Recibido: enero de 2011
Aceptado: julio de 2011

 

Resumen

Se evaluó la germinación in vitro de seis especies de cactáceas usando zeolita como alternativa de sustrato. Se realizó la siembra in vitro de: Astrophytum capricorne A. Dietr. Britton & Rose, A. myriostigma Lem., Echinocereus reichenbachii Terscheck ex Walp. Haage, Escobaria dasyacantha Engelm Britton & Rose, Mammillaria prolifera Mill. Haw. y Sclerocactus scheeri Salm-Dyck N. P. Taylor. Para ello se aplicaron tres granulometrías de zeolita: fina (de 0.71 a 1 mm), mediana (de 1.1 a 2 mm) y gruesa (de 2.1 a 3.36 mm de calibración). En total se aplicaron nueve tratamientos a las estructuras de granulometrías de zeolitas: fina, mediana y gruesa + agua destilada (tratamientos 1, 2 y 3), tres tipos de zeolitas + medio Murashige y Skoog (MS) (tratamiento 4, 5 y 6); tratamiento 7 agar + MS + sacarosa, tratamiento 8 agar + MS; y tratamiento 9 agar. Se analizaron estadísticamente los resultados sobre la tasa de germinación y se determinaron diferencias altamente significativas para las variables porcentaje (F= 7.036, p< 0.01), velocidad (7.767, p< 0.01) e índice de germinación (4.298, p< 0.01). Los valores de germinación más altos se obtuvieron con el tratamiento agar + MS con un valor promedio de 63.3%; seguido del tratamiento zeolita mediana + MS (58%). La especie con mejor respuesta germinativa fue E. dasyacantha (92.6%), seguida de A. myriostigma (54.07%). Este protocolo indica la conveniencia de usar como sustrato zeolitas sustituyendo al agar, favoreciendo así acciones de conservación in vitro de cactáceas, aprovechando lo redituable del sustrato debido a su abundancia y fácil obtención.

Palabras clave: agar, cactáceas, germinación in vitro, zeolita natural.

 

Abstract

By using zeolite as an alternative substrate, in vitro germination of six cacti species was evaluated. In vitro seeding was performed for: Astrophytum capricorne A. Dietr. Britton & Rose, A. myriostigma Lem., Echinocereus reichenbachii Terscheck ex Walp. Haage, Escobaria dasyacantha Engelm Britton & Rose, Mammillaria prolifera Mill Haw. and Sclerocactus scheeri Salm-Dyck N. P. Taylor. In order to do this, three particle sizes of zeolite were applied: thin (from 0.71 to 1 mm), medium (from 1.1 to 2 mm) and coarse (2.1 to 3.36 mm of calibration). A total of nine treatments were applied to zeolite's structures of the following granulometric sizes: fine, medium and coarse + distilled water (treatments 1, 2 and 3), three types of zeolites + Murashige and Skoog (MS) (treatment 4, 5 and 6) treatment 7 agar + MS + sucrose, treatment 8, agar + MS; and treatment 9 agar. The germination index evaluation results were statistically analyzed identifying highly significant differences for the variables percentage (F= 7.036, p< 0.01), speed (7.767, p< 0.01) and germination index (4.298, p< 0.01). The highest germination values were obtained with agar + MS treatment. The species with the highest germination response was E. dasyacantha (92.6%), followed by A. myriostigma (54.07%). This protocol calls for the convenience of using zeolites as a replacement for agar substrate, thus promoting the cacti in vitro conservation, taking advantage of such profitable substrate because of its abundance and easy acquisition.

Key words: Agar, cacti, in vitro germination, natural zeolite.

 

INTRODUCCIÓN

La familia Cactaceae contiene entre 1 500 y 2 000 especies (Hunt, 1999; Guzmán et al., 2007; Velazco, 2009). Para México esta familia es considerada de gran importancia en cuanto a su diversidad biológica. Se estima que las cactáceas en la flora de México alcanzan alrededor de 700 especies, que corresponde al 40% de la familia, siendo el país más diverso para este grupo de plantas, con más 84% de endemismo a nivel de especie (Arias, 1993). Sin embargo, sus poblaciones naturales han sido diezmadas por el cambio de uso de suelo y la extracción ilegal de especies de alto valor ornamental. El empleo de cactáceas como plantas de colección u ornamentales es quizá el más demandado a nivel internacional, por su rareza y belleza y sobre todo por su lento crecimiento y hermosa floración (Carmona et al., 2008). Alrededor de 300 especies de cactos están disponibles como ornamentales.

Usualmente los cactus son propagados por semilla y esquejes; sin embargo, estos métodos convencionales, aunados a la falta de metodologías más eficientes de propagación, no siempre resultan satisfactorios, especialmente en aquellas especies en peligro de extinción, de lento crecimiento y que producen pocas semillas. Otros métodos usuales para la propagación de cactáceas son: hijuelos, yemas e injertos (Reyes et al., 2001). Por lo tanto, es inminente la necesidad de establecer técnicas de producción de cactáceas eficientes y de bajo costo, para satisfacer la alta demanda que ha vuelto vulnerables a las poblaciones naturales de este llamativo grupo de plantas.

Al respecto, Bunt (1988) señala que la calidad de las plántulas depende del tipo de sustrato donde se desarrollan, en particular de sus características físico-químicas, ya que el desarrollo y el funcionamiento de las raíces están directamente ligados a las condiciones de aireación, contenido de agua, además de tener influencia directa sobre la disponibilidad de los nutrientes. Por su parte, Andrade et al. (2008), consideran necesario usar en los sustratos algún componente que aporte nutrimentos para el crecimiento de las plantas, además del soporte adecuado.

Una opción para cubrir dichas necesidades específicas lo constituyen las zeolitas naturales que son minerales del grupo de los aluminosilicatos hidratados con estructura porosa, que presentan alta capacidad de retención de humedad y de intercambio catiónico. Estas características físicas y químicas las hacen un sustrato atractivo en la agricultura (Allen y Ming, 1995; Urbina et al., 2006) y para el cultivo de cactáceas entre otras plantas; sin embargo, en México, la información sobre las zeolitas como sustrato natural, abundante y económico es mínimo para las especies en general, y nulo para el caso de la producción y propagación de las cactáceas.

Las técnicas de cultivo in vitro permiten la propagación masiva y comercial de especies de interés hortícola (Thorpe, 1981); por lo tanto, la germinación in vitro de cactáceas con alta demanda ornamental puede llegar a tener un gran impacto a nivel industrial y en la conservación in situ (Molina et al., 2005), abasteciendo la alta demanda en el mercado (Manzo, 2010), lo cual reduciría el saqueo ilegal en las poblaciones silvestres. El propósito del presente estudio es desarrollar una nueva estrategia, mediante la aplicación de metodologías para acelerar el proceso de germinación in vitro de cactáceas, aprovechando las propiedades físicas y químicas de zeolitas naturales, como una buena alternativa de sustrato que ayudaran a incrementar la tasa de germinación de las especies de cactáceas.

En base a este objetivo se planteo la siguiente hipótesis: los tratamientos aplicados a zeolitas naturales incrementan en forma significativa la tasa de germinación de las especies de cactáceas en el estudio.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Las especies de cactáceas evaluadas fueron: Astrophytum capricorne (A. Dietr.) Britton & Rose, Astrophytum myriostigma Lem. (ambas endémicas y bajo estatus amenazada de acuerdo a la NOM-ECOL-059-2001-SEMARNAT), Echinocereus reichenbachii (Terscheck ex Walp.) Haage, Escobaria dasyacantha (Engelm) Britton & Rose, Mammillaria prolifera (Mill.) Haw. y Sclerocactus scheeri (Salm-Dyck) N. P. Taylor. Las semillas fueron proporcionadas por el Dr. Alfredo Flores Valdés (Profesor investigador del CINVESTAV, Unidad Saltillo), procedentes de su colección registrada bajo el Núm. MX/VIV-CO-132/COAH.

Criterio de la selección de especies

La selección de especies para el estudio fue efectuado en base su adaptabilidad, su potencial e importancia ecológica y ornamental. Además las especies mencionadas se encuentran presentes dentro de las áreas naturales protegidas de zonas desérticas del noreste de México consideradas de gran riqueza y diversidad de cactáceas, de acuerdo a lo reportado por Carmona et al. (2008), tomando en cuenta las siguientes características: a) mínimo nodricismo; b) asociación a sustrato rocoso; c) alta tasa de crecimiento; d) valor ornamental; e) endemismo; f) especies en peligro de extinción; y g) valor ecológico.

Sustratos y tratamientos

Se evaluó el tamaño de las partículas de sustrato para establecer una relación con la eficiencia en la toma de nutrientes por la planta, expresado en el porcentaje, velocidad e índice de germinación. Para esto se tamizó la zeolita a tres granulometrías de sustratos: fina (de 0.71 a 1 mm), mediana (de 1.01 a 2 mm) y gruesa (de 2.01 a 3.36 mm de calibración). Se realizó la siembra en cada granulometría.

En total se aplicaron nueve tratamientos. Los tratamientos 1 a 3 consistieron en 10 g de zeolita de cada una de las respectivas granulometrías, más 10 mL de agua destilada. En el caso de los tratamientos 4 al 6, se usaron 10 g de zeolita de cada una de las respectivas granulometrías y fue humedecida con 10 mL de sales básicas del medio Murashige y Skoog (MS), señalado como MS al 50% de su concentración original. Se ajustó el pH del medio a pH 5.7. Para los tratamientos 7 y 8, se usaron las sales básicas del medio MS al 50% y agar (4 g L-¹) con y sin sacarosa (10 g L-¹) respectivamente (10 mL por frasco). Finalmente, para el tratamiento 9 se usó agar-agua (4 g L-¹) a razón de 10 mL por frasco (Cuadro 1). Todos los tratamientos fueron esterilizados a 121 °C y 15 libras de presión por 15 min.

Antes de la siembra, las semillas fueron sumergidas en agua destilada estéril por 10 min, seguido de alcohol etílico absoluto por 30 s. A continuación fueron desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio comercial (Cloralex®) diluido al 20% (v/v), conteniendo 0.1% de Tween 20 por 15 min. Posteriormente y bajo condiciones asépticas, las semillas se enjuagaron nuevamente con 500 mL de agua destilada estéril y fueron colocadas para su germinación en frascos de vidrio (35 mL). Las condiciones de cultivo fueron: fotoperiodo de 12 h luz y 26 ±1 °C en cámara de crecimiento (SEV modelo INLC 297).

Para llevar a cabo el proceso de germinación, cada tratamiento consistió de cinco repeticiones cada uno con 5 semillas. El 2 de marzo de 2009 se realizó la siembra y diariamente se registró la germinación durante 20 días, posteriormente se determinó el porcentaje final, índice y velocidad de germinación, de acuerdo con González y Orozco (1996).

Diseño experimental y análisis estadístico

El mecanismo de germinación se efectuó bajo la aplicación de un diseño factorial en bloques completamente al azar, donde el factor A esta conformado por 6 especies y el factor B por 9 combinaciones de sustratos como tratamientos.

Para poder realizar el análisis de varianza (ANOVA) bajo un modelo factorial, los resultados sobre el porcentaje de germinación fueron transformados en arcoseno de la raíz cuadrada, de acuerdo con Zar, (2010). Los efectos principales de los factores fueron determinados, así mismo que los valores promedios fueron comparados.

Las variables de respuesta evaluadas fueron: porcentaje final de germinación, velocidad de germinación (M) e índice de germinación (IG); la velocidad e índice de germinación se calcularon de acuerdo con González y Orozco (1996), mediante las siguientes ecuaciones:

a) IG = Σ (n_it_i)/N y b) M= Σ (n_i)/t

Donde: IG= índice de germinación, definido como la medida del tiempo de germinación en relación con la capacidad germinativa; n_i= número de semillas germinadas en el día i; t_i= número de días después de la siembra; N= total de semillas sembradas; M= velocidad de germinación, definida como la relación del número de semillas germinadas con el tiempo de germinación; t= tiempo de germinación desde la siembra hasta la germinación de la última semilla. De acuerdo con este índice, entre mayor es el valor calculado, mayor es la velocidad a la que ocurre la germinación de las semillas.

Los resultados sobre porcentaje, velocidad e índice de germinación se sometieron a un análisis de varianza (en un diseño de bloques completamente al azar) y comparación múltiple de medias por el método de Tukey (Zar, 2010), mediante el paquete estadístico SPSS, (2006), vers. 15.0. El nivel de significancia para los análisis fue de 5%.

 

RESULTADOS

Los resultados obtenidos sobre el proceso de germinación, indican que la especie E. dasyacantha fue la de mayor porcentaje de germinación (92.5 9%) en comparación conM. prolifera con 22.96%. Esta última especie fue considerada de muy baja tasa de germinación. El análisis de varianza mostró diferencias altamente significativas (F= 7.036, p< 0.01) para porcentaje, velocidad (F= 7.767, p< 0.01) e índice de germinación (F= 4.298, p< 0.01).

De acuerdo al ANO VA y comparación múltiple de medias de Tukey, las semillas del tratamiento con agar + MS, obtuvieron altos valores en porcentaje (63.33 ±3.95%), velocidad (0.48) e índice de germinación (5.46) para las seis especies, seguido del tratamiento con zeolita granulometría media + MS, donde se obtuvo 57.78% de germinación; asimismo, los tratamientos de zeolitas + MS y los 3 tratamientos con agar conformaron un grupo estadísticamente similares (p< 0.05). Por otro lado, los 3 tratamientos de zeolitas + agua destilada establecieron un grupo estadísticamente diferente; el tratamiento con zeolita gruesa + agua destilada arrojó el porcentaje de germinación más bajo con 25.56% (Cuadro 2 y Figura 1).

En cuanto a la comparación múltiple de medias por especie, se formaron cuatro grupos diferentes para la variable porcentaje, el primero conformado sólo por E. dasyacantha; la cual obtuvo la mejor respuesta germinativa (92.59%) y velocidad de germinación (1.09); el segundo lo integraron A. myriostigma con 54.07% y 0.34 para las respectivas variables, y A. capricorne (47.41 y 0.24 respectivos porcentaje y velocidad de germinación); sin embargo, el índice de germinación mostró valores estadísticamente iguales para 5 especies (A. capricorne, A. myriostigma,S. scheeri, E. dasyacantha y E. reichenbachii) (Cuadro 3).

 

DISCUSIÓN

Los resultados evidencian la conveniencia del uso de zeolita natural en sustitución del agar, lo anterior debido que se obtuvieron resultados estadísticamente similares en la germinación de las seis especies de cactáceas con 63.33% y 57.78% con agar y zeolita, respectivamente; al respecto Martínez et al. (2006), mencionan la existencia de alternativas viables para la sustitución del agar en el cultivo in vitro, mediante el uso de sustratos inertes como agrolita, vermiculita, y tezontle en la obtención de patrones de cítricos, los autores mencionan además, que la incorporación de dichos sustratos incrementa la sobrevivencia 50% y en algunos casos hasta 100% al pasar las plantas a macetas, ya que sus raíces no se dañan. Resultados similares fueron reportados por Izquierdo et al. (2002), quienes evaluaron diferentes sustratos en la aclimatación de vitroplantas y microbulbillos de ajo; resultando la utilización de la zeolita mezclada con materia orgánica un sustrato óptimo que favoreció la supervivencia de las plantas, al parecer, ligado con las propiedades químicas y físicas de este mineral.

Las especies M. prolifera y E. reichenbachii mostraron los valores más bajos para las variables evaluadas; al respecto, factores internos de las semillas, como su viabilidad (Enríquez et al., 2004) o tamaño (Sánchez et al., 2006), pueden influir en su respuesta germinativa (Venable y Pake, 1999); aún y cuando la semilla obtenida para la realización del presente experimento fue colectada poco antes de la siembra, para algunas semillas de cactáceas la viabilidad es limitada en semillas frescas o recién colectadas y aumenta a los dos o tres años, así lo mencionaron Trejo y Garza (1993), quienes reportaron que las semillas de Mammillaria heyderi de cero años de edad tiene un porcentaje de germinación menor, a diferencia de las de dos y tres años, por lo que es posible que las semillas de E. reicheinbachii y M. prolifera, tuvieran embriones inmaduros durante la prueba, ya que se colectaron 3 meses antes.

El tamaño de partícula del sustrato o granulometría con los mejores resultados fue la de textura media (1 - 2 mm), lo que coincide con lo reportado por Ansorena (1994), quien menciona que el tamaño óptimo de partículas para sustratos hortícolas está entre 0.25 y 2.5 mm y con Gislerød (1997), quien menciona que el desarrollo de las raíces primarias y secundarias se ve favorecido al mejorar el suministro de oxígeno con sustratos de partículas de tamaño uniforme, tal como se observó en la presente investigación, en relación con mezclas de partículas de diferentes tamaños.

La zeolita en textura gruesa (2.01-3.36 mm) fue el tratamiento con el menor porcentaje de germinación. Al respecto, Santos et al. (2004), mencionan que la textura fina es importante para permitir buen contacto entre las semillas (especialmente si son pequeñas) y la humedad de la mezcla, fomentando la germinación. No obstante, la zeolita en textura fina (0.71-1 mm) retuvo en exceso el agua aplicada, por lo que se observó un decremento en la germinación de las semillas de cactáceas debido a la saturación del sustrato, puesto que se necesita una mezcla o sustrato que sea permeable, que absorba el agua pero que no retenga los excesos como su característica más importante (Santos et al., 2004).

Estos estudios han sido considerados por algunos autores como importantes contribuciones en la conservación de especies vegetales en peligro de extinción, así lo refieren Molina et al. (2005), al realizar la conservación in vitro de cinco especies de cactáceas de Guatemala en peligro de extinción. Además, se genera información valiosa para aquellas personas que quieran dedicarse a su cultivo y exportación, evitando con ello la extinción de las especies.

 

CONCLUSIONES

Los tratamientos conformados por Agar + medio Murashige Skoog (MS) y zeolita en granulometría media + medio MS, fueron los que obtuvieron mejores resultados en cuanto a porcentaje, velocidad e índice de germinación para las seis especies de cactáceas; asimismo, de las granulometrías evaluadas, la zeolita con granulometría media (de 1 a 2 mm) proporcionó los mejores resultados para la germinación de las cactáceas.

Con estos resultados se muestra la conveniencia de usar zeolitas naturales como alternativa de sustrato en la germinación de cactáceas, al lograr resultados estadísticamente similares en ambos medios de cultivo, ya sea zeolita o agar (medio convencional de cultivo in vitro), destacando además, que se trata de un recurso natural de bajo costo, poco aprovechado a la fecha, abundante y relativamente fácil de extraer y con las características ideales de un sustrato, para el óptimo establecimiento y desarrollo de las plántulas. Además se facilita la implementación de acciones de conservación in vitro de cactáceas y de otras especies vulnerables o en peligro de extinción, aprovechando lo redituable de las zeolitas debido a su abundancia y fácil obtención.

Finalmente, los resultados obtenidos demuestran que la incorporación de sustratos alternativos al agar, para el cultivo in vitro es una buena opción para la germinación de especies de cactáceas, por lo que se sugiere realizar futuros estudios del uso de zeolita en otras especies de importancia ornamental, ecológica e industrial. Así mismo, es necesario desarrollar estudios puntuales acerca de las propiedades físicas y químicas de las zeolitas naturales, con la finalidad de comprender los efectos sobre la germinación y desarrollo de dichas especies.

 

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), a través del proyecto 51739 y al proyecto de PAICYT Proyecto CN-427-10, por el apoyo económico para la realización de esta investigación.

 

LITERATURA CITADA

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