Artículos

 

Obtención de plantas haploides en chile miahuateco (Capsicum annuum L.)*

 

Obtaining haploid plants from miahuateco chili pepper (Capsicum annuum L.)

 

Marcelina Vélez Torres¹, Alejandrina Robledo Paz^2§, Tarsicio Corona Torres¹, Víctor Heber Aguilar Rincón¹, Porfirio Ramírez Vallejo¹ y Javier Suárez Espinosa³

 

¹ Posgrado en Genética. Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco, km 36.5. Montecillo, Texcoco, Estado de México. C. P. 56230. Fax. 01 595 9520262. (velez@colpos.mx), (tcoronat@colpos.mx), (aheber@colpos.mx).

² Posgrado en Semillas. Colegio de Postgraduados. Fax. 01 595 9520262. ^§ Autora para correspondencia: arobledo@colpos.mx.

³ Posgrado en Estadística. Colegio de Postgraduados. Fax. 01 595 9520262. (sjavier@colpos.mx).

 

* Recibido: agosto de 2009
Aceptado: abril de 2010

 

Resumen

La regeneración de plantas haploides, es una herramienta importante en los programas de mejoramiento y estudios genéticos, ya que permite obtener líneas puras más rápido que los métodos convencionales a través de la duplicación de plantas haploides. El objetivo de este trabajo fue establecer una metodología que permita la regeneración de plantas haploides de chile tipo miahuateco (Capsicum annuum L.). Las anteras se cultivaron en los medios basales de Murashige y Skoog (1962); Chu et al. (1975), suplementados con 6-furfurilaminopurina (0.1-1 mg L^–1), ácido naftalenacético (0.1 mg L^–1), ácido indolacético (1 mg L^–1) y ácido 2-4 diclorofenoxiacético (1 mg L^–1). La embriogénesis se indujo hasta en 2.23% de anteras cuando se cultivaron en una combinación de 6-furfurilaminopurina con 2-4, diclorofenoxiacético (1 mg L^–1 de ambos) o de ácido indolacético con 6-furfurilaminopurina (0.1 mg L^–1 de ambos). El análisis cromosómicos de las plantas regeneradas mostró que eran haploides con número cromósomico 2n= x= 12.

Palabras clave: Capsicum annuum, anteras, embriogénesis somática, haploides.

 

Abstract

Haploid plant regeneration is an important tool in breeding programs and genetics studies, since it helps obtain pure lines faster than conventional methods by the duplication of haploid plants. The aim of this study was to establish a methodology to regenerate haploid Miahuateco chili pepper plants (Capsicum annuum L.). Anthers were grown on Murashige and Skoog (1962); Chu et al. (1975) basal media, supplemented with 6-furfurylaminopurine (0.1-1 mg L^–1), naphthaleneacetic acid (0.1 mg L^–1), indolacetic acid (1 mg L^–1), and 2-4 dichlorophenoxyacetic acid (1 mg L^–1). Embryogenesis was induced in 2.23% of anthers grown in a combination of 6-furfurylaminopurine with 2-4 dichlorophenoxyacetic acid (1 mg L^–1, of each), or indolacetic acid with 6-furfurylaminopurine (0.1 mg L^–1 of each). Chromosome analysis of regenerated plants showed that they were haploids with a chromosome number of 2n= x= 12.

Key words: Capsicum annuum, anthers, haploids, somatic embryogenesis.

 

INTRODUCCIÓN

La obtención de líneas puras u homocigotas puede requerir al menos seis ciclos de autofecundación usando las técnicas convencionales (Polci et al., 2004). El empleo de herramientas como la producción in vitro de haploides y doble haploides, permite obtener líneas homocigotas hasta en una generación, reduciendo tiempo y costo de producción de estas líneas (González y Jouve, 2003; Polci et al., 2004; Maraschin et al., 2005). Además, la regeneración de plantas haploides tiene aplicación en estudios citogenéticos y genómicos (Jauhar, 1993; Aleza et al., 2003), para la construcción de mapas genéticos (Oliver et al., 2000) y en la evaluación de diversidad genética (Maraschin et al., 2005). En varias especies hortícolas se han regenerado plantas completas a partir del gametofito masculino (granos de polen) con un número haploide de cromosomas el cual se diploidiza para generar líneas puras doble haploides (Dolcet-Sanjuan y Clavería, 2003).

En Capsicum annuum L. el método más empleado para la obtención de haploides es el cultivo in vitro de anteras; se han desarrollado varios protocolos para la inducción de embriogénesis a partir de microsporas y la regeneración de plantas haploides en diferentes variedades (Dolcet-Sanjuan et al., 1997; Bárany et al., 2001; Kim y Jang, 2001; Kim et al., 2004; Supena et al., 2006); no obstante, no se conocen reportes sobre la generación de haploides de genotipos de chile cultivados en México.

Entre los tipos de chile más importantes en nuestro país se encuentran los denominados anchos, y dentro de éstos sobresalen los subtipos mulato, ancho y miahuateco (Laborde y Pozo, 1982). El chile miahuateco difiere de los otros por la ausencia de cajete y por tener un fruto más delgado, además es apreciado en la región comprendida entre los Municipios de Tehuacán y Tecamachalco del estado de Puebla, por sus características culinarias. Este tipo de chile es susceptible a la incidencia de enfermedades presentes en el suelo y han reducido el área de producción. También, su cultivo mezclado con otros tipos de chile como ancho y copi, ha ido ocasionando la pérdida de su identidad morfológica (Aguilar et al., 2006).

En el Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas (CP) se tienen varias recolectas de chile miahuateco, algunas de las cuales han mostrado resistencia a Phytophthora capsici (Morán, 2008), pudiendo utilizarse como fuente de variación en programas de mejoramiento genético. Una forma de estudiar la herencia de estos caracteres en menor tiempo es con la formación de líneas homocigotas mediante la producción de plantas haploides y su posterior duplicación. Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue establecer una metodología para generar haploides de chile miahuateco a partir del cultivo de anteras.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se emplearon las accesiones CP631, CP633, CP634 y CP643 provenientes de los Municipios de Tepanco de López y Tlacotepec, Puebla, proporcionadas por el proyecto: Los recursos genéticos del chile (Capsicum spp.) en México: estudio, conservación y utilización; financiado por el Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura (SINAREFI). Dichas accesiones se encuentran resguardadas en el banco de germoplasma de chile del CP, ubicado en el Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México (Cuadro 1).

Con la finalidad de obtener anteras para su establecimiento in vitro, 15 plantas de cada una de las accesiones de chile crecieron en los invernaderos del CP, ubicado en la carretera México-Texcoco, km 36.5, Montecillo, Texcoco, Estado de México; situado a una altitud de 2 250 m, latitud norte 19° 29' y longitud oeste 98° 53', con temperaturas promedio máximas y mínimas de 25 y 12 oC respectivamente.

Establecimiento in vitro de anteras

Todos los medios empleados para el cultivo de anteras contenían sales y vitaminas del medio de Murashige y Skoog (MS) (1962), con excepción del medio A2 que se componía de las sales del medio N6 de Chu et al. (1975) y de las vitaminas del MS (Cuadro 2). El pH de los medios se ajustó a 5.7 ± 0.1 y éstos se esterilizaron 15 min en autoclave a 1.05 kg cm^–2.

Desinfestación y siembra

Las anteras utilizadas para el cultivo in vitro se obtuvieron de botones florales de 3 mm de diámetro, dado que en el estudio citológico que se llevó a cabo previamente, el mayor número de células en la fase de tétrada (uninucleadas) se presentaron en botones de este tamaño. La desinfestación de las anteras se realizó con etanol al 96% (v/v) durante 2 min, seguido de 10 min en una solución de hipoclorito de sodio al 1.8% de ingrediente activo.

Las anteras se sembraron de dos maneras, en una de ellas se colocaron intactas sobre el medio de cultivo y en la otra se les hizo una incisión longitudinal en la parte media.

Inducción de la embriogénesis somática

Las anteras de las cuatro accesiones se cultivaron como explantes en frascos de 50 mL de capacidad con 10 mL de los medios A1, A2, A3, A4 y A5 (Cuadro 2). Estas se mantuvieron en obscuridad a 26 ± 2 °C durante cinco semanas para inducir la formación de callo embriogénico. No se cultivaron anteras de las accesiones CP634 y CP643 en el medio A5.

Desarrollo de los embriones somáticos

Para promover la diferenciación y germinación de los embriones somáticos formados en las anteras que permanecieron durante cinco semanas en los medios de inducción, éstas se transfirieron a frascos con 10 mL de medio MD1, en el que se cultivaron por dos semanas en oscuridad y dos semanas en un fotoperiodo de 16 horas de luz (lámparas de luz blanca fría fluorescente, con intensidad lumínica de 25 µmol m^–2 s^–1). Las plántulas obtenidas en el medio MD1 se transfirieron a un medio MD2 en condiciones de luz para continuar su desarrollo (Cuadro 2).

Multiplicación de plantas haploides

Los ápices de vástago de las plantas haploides obtenidas a partir de las anteras, se cultivaron durante cuatro semanas en el medio MM (Robledo-Paz y Carrillo-Castañeda, 2004). Los brotes adventicios regenerados en el medio MM se transfirieron al medio MD2 por cuatro semanas para promover su crecimiento; posteriormente; éstos se individualizaron y se colocaron en el medio ME durante dos semanas para promover la formación del sistema radical (Cuadro 2).

Análisis cromosómico

Para observar cromosomas mitóticos, se colocaron los ápices radicales de las plantas regeneradas a partir de anteras en una solución acuosa de colchicina (0.05%) (p/v) por 3.5 h, a temperatura ambiente y en oscuridad. Después, los ápices se transfirieron al fijador Farmer 3:1 (etanol: ácido acético) (v/v) por 12 h; se hidrolizaron 10 min en HCl 1 N a 60 °C y se tiñeron con una solución de Feulgen, preparada de acuerdo a García (1990) a 60 °C por 5 min. Los ápices coloreados se maceraron en solución enzimática (pectinasa 2%, celulasa 5% y buffer citrato, pH 4.5) y después, se llevó a cabo el aplastado de los mismos sobre portaobjetos agregando una gota de orceína propiónica al 2% para luego cubrirlos con cubreobjetos. El conteo y toma de fotografías de los cromosomas se hizo utilizando un microscopio óptico Karl Zeiss modelo 4700801-9099.

Duplicación cromosómica

Las plantas haploides regeneradas se extrajeron del medio de cultivo, se lavaron las raíces con agua corriente para eliminar residuos del mismo y se sumergieron hasta el cuello de la raíz en una solución acuosa de colchicina al (0.05%) (p/v) durante 6 h, a temperatura ambiente.

Transferencia al suelo

Después del tratamiento con colchicina, las plantas se colocaron en macetas con una mezcla de agrolita y tierra de monte (1:1) y se cubrieron con bolsas de plástico transparente con dos perforaciones en los extremos para evitar deshidratación. Después de siete días se retiraron las bolsas y las plantas se llevaron al invernadero para continuar su crecimiento; durante este tiempo se aplicaron riegos con agua normal de acuerdo al requerimiento de las plantas y a cada una se le agregó 200 ml de fertilizante triple 17 (1 g L^–1) (Pelícano, Disagro^®, México) cada 15 días.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó el diseño experimental completamente al azar, en el que la unidad experimental consistió de un frasco con una antera, teniendo un número variable de repeticiones por tratamiento. Las variables evaluadas fueron el número de explantes que formaron callo y el número de explantes que diferenciaron embriones.

Los resultados en el presente trabajo consistieron en la presencia o ausencia tanto de callos como de embriones, el análisis de la primera variable se llevó a cabo mediante la metodología de regresión logística, usando el paquete estadístico SAS versión 8.1 con el procedimiento PROC LOGIST con contraste. La comparación del efecto entre los factores (medios de cultivo y accesiones) se hizo mediante contrastes haciendo el ajuste de Bonferroni.

En el caso de la variable formación de embriones, se utilizó la prueba exacta de Fisher para la comparación de dos proporciones independientes, usando el procedimiento PROC FREQ, además de hacer el ajuste de Bonferroni, de la misma forma que en la variable formación de callo, se utilizó para declarar diferencias significativas entre medios y colectas.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cultivo de anteras

La metodología empleada para la desinfestación de las anteras permitió obtener 100% de éstas libres de contaminación. Sembrar las anteras intactas dio los mejores resultados en cuanto a la formación de callo, ya que cuando se les practicó la incisión longitudinal, estas se oxidaron tornándose cafés y aunque produjeron callo, este fue muy pequeño y de corta duración.

Lo anterior indica que la integridad de la antera es importante para la respuesta morfogenética, tal como lo observaron Pacheco-Sánchez et al. (2003) en anteras de Solanum iopetalum. En Lilium, Clément y Audran (1995) encontraron que las capas de la pared de la antera actúan como un amortiguador fisiológico al almacenar nutrimentos en granos de almidón, lo que permite al grano de polen germinar.

Con respecto a la proporción de anteras que formaron callo, las accesiones CP631 y CP633 mostraron los valores más altos (Figura 1). Por otro lado, de los medios de cultivo probados, los que indujeron el mayor porcentaje de anteras con callo fueron el A1, A2 y A4 (Figura 2).

Respecto a la variable formación de embriones de acuerdo a la prueba exacta de Fisher con ajuste de Bonferroni, no se encontraron diferencias significativas entre los cinco medios de cultivo probados, tampoco en las cuatro accesiones utilizadas. Por otro lado, sólo los tratamientos A1-CP634 y A5-CP633 formaron embriones; el A1-CP634 produjo un embrión somático por antera y el A1-CP633 dos.

Dichos embriones se convirtieron en plántulas haploides después de dos semanas de cultivarse en el medio MD1 (Cuadro 3). Solamente se presentaron diferencias a p<0.0911 en la comparación A5-CP633 (90 anteras) en relación a A2-CP643, debido a la mayor información que proporcionó el número de repeticiones (207 anteras) en este último tratamiento. De lo anterior, se podría inferir que, utilizando un mayor número de anteras sería posible encontrar diferencias significativas con respecto a los otros tratamientos.

El hecho de que no todas las accesiones hayan formado embriones aun cuando se cultivaron en un mismo medio, podría deberse a la interacción del genotipo con el medio de cultivo. Este tipo de respuesta diferencial ha sido observado por otros autores (Achar, 2002; Koleva-Gudeva et al., 2007). Asimismo, se encontraron diferencias en la respuesta de las anteras de una misma flor, pues no todas ellas formaron embriones, lo que pudo deberse a que el grado de desarrollo de las anteras del mismo botón floral no era homogéneo, tal como lo observaron Kim et al. (2004) en el cultivar Milyang-jare de chile.

Al respecto, algunos autores han encontrado variación en el desarrollo del polen de una antera, de las anteras de una yema o de anteras de diferentes yemas en la misma estadía. Dicha asincronía también podría explicar la baja frecuencia de embriogénesis en las anteras de chile miahuateco, pues al no estar todas las microsporas de una antera sincronizadas en el mismo estado de desarrollo, posiblemente sólo algunas de ellas se encontraban en condiciones para formar embriones, o bien, pudo haber sucedido que muchos granos de polen murieron en el transcurso del cultivo in vitro, como lo observaron Kim et al. (2004) en anteras de C. annuum del cultivar Milyang-jare.

Un porcentaje de 2.4 en la regeneración de embriones fue obtenido con anteras del cultivar Slatko Luta de C. annuum por Koleva-Gudeva et al. (2007), valor cercano al encontrado en el presente trabajo en la accesión CP633 (2.23%). Por otro lado, Nowaczyk y Kisiala (2006) obtuvieron una frecuencia de androgénesis no mayor a 5% en los genotipos de C. annuum ATZ1, PO y el híbrido F1 de ambos. La baja frecuencia con la que se obtienen embriones somáticos haploides es una respuesta común en el cultivo de anteras de distintas especies; como en la mayoría de los casos este valor no excede al 0.01% (Polci et al., 2004).

Cabe señalar que aun cuando de todos los medios probados, el medio A5 tenía la concentración más baja de reguladores de crecimiento, este logró inducir la formación de embriones, al igual que el medio A1 que contenía 10 veces más cantidad de estos compuestos.

La respuesta de las anteras en medios de cultivo con una diferencia en la concentración de reguladores tan amplia concuerda con lo que postulan Fehér et al. (2003), quienes consideran que la embriogénesis somática no puede definirse como una respuesta a los reguladores aplicados exógenamente, sino más bien que son los niveles hormonales endógenos los que primordialmente determinan la respuesta de las células a los estímulos que se generan en el cultivo in vitro; asimismo, sugieren que los cambios drásticos en el ambiente celular, tal como exponer las células o los tejidos a condiciones nutrimentales u hormonales sub o supra óptimas como las que se manejan en el cultivo de anteras, generan efectos de estrés y que este puede causar la reorganización celular y cambio en el desarrollo para permitir la embriogénesis somática.

Los reguladores de crecimiento como las auxinas y citocininas, son los compuestos más involucrados en los cambios de desarrollo mediante la regulación de la división y diferenciación celular. La influencia de la aplicación de auxinas y citocininas exógenas en la embriogénesis somática ya se ha documentado por distintos autores (Dudits et al., 1991; Yeung, 1995; Sagare et al., 2000) y se corrobora con los resultados del presente trabajo, en donde combinar dos auxinas (2,4-D y ANA) con una citocinina (cinetina) originó la formación de embriones somáticos.

Aún cuando los medios A1 y A5 indujeron la formación de embriones somáticos, el patrón de desarrollo que se observó en cada uno de ellos fue diferente; las anteras cultivadas en el medio A1 tuvieron como primera respuesta la formación de callos y fue hasta después de cuatro semanas de cultivar estos callos en el medio MD1 (nueve semanas de iniciar el cultivo) que apareció la primera planta, en la cual se podían observar los cotiledones, el hipocótilo y la raíz. En contraste, las anteras cultivadas en el medio A5 formaron embriones sin una fase de callo y estos fueron evidentes a la quinta semana de que éstas se colocaron en dicho medio (Figura 3A).

La formación directa de embriones a partir del polen observada al emplear el medio A5, podría representar una ventaja al reducir la posible variación somaclonal frecuentemente asociada a la producción de callo previa a la embriogénesis. Además, bajo estas condiciones el tiempo para obtener plantas haploides es menor al no requerir la formación de callo.

Después de 15 semanas de cultivo las plantas regeneradas se desarrollaron con la morfología típica de una planta de chile miahuateco, pero menos vigorosas que las diploides, característica que también observaron Bárany et al. (2005) en plantas haploides del cultivar Yolo Wonder B de C. annuum. La falta de vigor es común en plantas haploides y se atribuye principalmente a la disminución en el tamaño celular (Polci et al., 2004).

Análisis cromosómico, desarrollo y multiplicación de plantas

El análisis cromosómico de las microplantas regeneradas reveló que éstas tenían un número cromosómico 2n= x= 12; es decir, eran plantas haploides (Figura 3C). Las plantas tratadas con colchicina que crecieron en el invernadero alcanzaron la etapa de floración (Figura 3D).

Cultivar los ápices de vástago de las plantas haploides regeneradas en un medio MM, promovió la diferenciación de 2 a 3 nuevos brotes a partir de cada ápice (Figura 3B). Los brotes regenerados formaron raíces cuando se cultivaron en un medio que contenía AIB (ME) para dar lugar a una nueva planta.

Después de analizar el número cromosómico de las plantas regeneradas a partir de los ápices de plantas haploides, se encontró que poseían un número haploide (2n= 12) de cromosomas igual a las que les dieron origen. El hecho de poder multiplicar el número de plantas haploides por el cultivo de ápices, permitiría compensar la baja frecuencia de embriogénesis obtenida con el cultivo de anteras.

El protocolo desarrollado permitió, después de nueve semanas de iniciar el cultivo de las anteras, obtener plantas haploides de chile miahuateco. Estas plantas fueron capaces de producir flores 25 días después del tratamiento con colchicina; sin embargo, no fue posible confirmar la duplicación de su número cromosómico (doble haploide) debido a la muerte prematura de las mismas.

El presente protocolo contribuye al avance en el desarrollo de la metodología para la obtención de líneas doble haploides que podrían ser utilizadas en los estudios genéticos de características deseables (Aleza et al., 2003), e incluso, tal como lo señalan Dolcet-Sanjuan y Clavería (2003), se deben producir líneas para obtener híbridos comerciales de chile.

 

CONCLUSIONES

El protocolo desarrollado permitió regenerar plantas haploides de chile miahuateco a partir del cultivo de anteras. La baja frecuencia de embriogénesis somática de las anteras puede incrementarse mediante una fase de multiplicación.

 

LITERATURA CITADA

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