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Introducción
México es uno de los principales países productores de fresa (Fragaria x ananassa Duch.), ya que ocupa el tercer lugar a nivel mundial con una producción estimada de 338,764 t durante 2016. El estado de Michoacán es la principal entidad productora y exportadora con un 76.8 % del volumen total (SIAP-SAGARPA, 2016).
La elevada producción del fruto de fresa se debe a sus propiedades organolépticas, lo que provee de notables beneficios a la salud debido a que contiene compuestos nutritivos que incluyen minerales (manganeso, magnesio, cobre, hierro y fósforo), vitaminas (A, E, K y C, entre otras), fibra dietética y un amplio rango de compuestos fenólicos (flavonoides, ácidos fenólicos, lignanos y taninos), que poseen propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antimicrobianas, antihipertensivas y anticancerígenas (Giampieri et al., 2015; Forbes-Hernández et al., 2017). Lo anterior ha colocado a la fresa como un alimento popular incluido en diversos productos alimenticios como el yogurt, además de mermeladas, gelatinas, alimentos funcionales y suplementos dietéticos, entre otros (Giampieri et al., 2015).
Lamentablemente, el fruto de fresa es un alimento altamente perecedero, particularmente durante su transporte y almacenamiento en poscosecha, ya que es susceptible de sufrir deshidratación, daño mecánico, pudrición o infección por microorganismos patógenos, especialmente hongos. El moho gris es una de las principales causas de pudrición en poscosecha del fruto de fresa, la cual es ocasionada por el hongo Botrytis cinerea Pers.:fr. La infección del fruto comienza desde la etapa de floración en el campo, en donde el hongo permanece latente hasta su maduración, tiempo en el cual el microorganismo cambia de saprófito a patógeno (Romanazzi et al., 2013).
El tratamiento con fungicidas químicos sintéticos (por ejemplo Trioxil®, i.a. sulfato de cobre tribásico), es el principal método de control de este tipo de fitopatógenos; no obstante, el uso de estos compuestos, además de incrementar los costos de producción y evitar la exportación de la fresa, pueden ocasionar aislados resistentes al ingrediente activo (Weber, 2011), además del riesgo en la salud humana que conlleva la persistencia de residuos químicos en los frutos (Botelho et al., 2010). Asimismo, y debido al interés que han mostrado los consumidores, quienes exigen alimentos libres de plaguicidas químicos en los alimentos, es necesario realizar la búsqueda de nuevas alternativas para el control de este tipo de patógenos (Darolt et al., 2016).
Los ácidos grasos son moléculas ubicuas en la naturaleza, ya que pertenecen a una clase de compuestos fisiológicamente importantes, involucradas en el almacenamiento de energía, estructura de la membrana y en varias vías de señalización (Pohl et al., 2011). Estas moléculas varían en longitud y nivel de saturación, existiendo ácidos grasos con cadenas hidrocarbonadas de 4 hasta 28 carbonos, las cuales pueden ser saturadas o insaturadas (Sylvain et al., 2009). Además de realizar funciones estructurales en las células y de participar en mecanismos de control de enfermedades, entre otras funciones básicas, los ácidos grasos poseen actividad antifúngica sobre diversos hongos, además de que son biodegradables y utilizados como aditivos alimentarios (Liu et al., 2008).
Por otro lado, el quitosano (poli β-[1-4]-N-acetil-D-glucosamina) es un biopolímero catiónico reconocido como seguro (GRAS, Generally Recognized as Safe, por sus siglas en inglés), ya que es biodegradable, no tóxico y compatible con el ambiente (Mahae et al., 2011). Este polisacárido es producido por la desacetilación química de la quitina (2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucosa), cuya fuente principal se encuentra en el exoesqueleto de crustáceos, insectos y hongos; el cual, además, puede formar biopelículas con actividad antimicrobiana, entre ésta la antifúngica (López-Mata et al., 2013; Sun et al., 2014).
En este sentido, la actividad biológica del quitosano sobre hongos patógenos de plantas está ampliamente documentada (Romanazzi et al., 2013; Muñoz et al., 2009). Sin embargo, la actividad antifúngica del quitosano solo, no siempre alcanza los niveles de protección deseados en los frutos en poscosecha, por lo que la incorporación de moléculas antimicrobianas, como los ácidos grasos, para la formación de compósitos podría incrementar su eficacia y expandir su aplicación en la conservación de alimentos. Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto protector de compósitos de quitosano-ácidos grasos sobre la infección de B. cinerea en frutos de fresa en poscosecha.
Método
Obtención de frutos de fresa y del hongo fitopatógeno
Los frutos de fresa var. Camino Real que se utilizaron en el presente estudio fueron obtenidos en una producción comercial de Zamora, Michoacán. Dichos frutos se seleccionaron con base en la uniformidad del tamaño, ausencia de daño físico e infección por hongos, así como por el nivel de maduración (más del 75 % de la superficie del fruto era roja) (Hernández-Muñoz et al., 2008). Por otro lado, el hongo B. cinerea se obtuvo del Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. El hongo se mantuvo bajo resiembra continua en agar papa dextrosa (PDA, Bioxón, México) a 25 ± 2.0 °C.
Preparación de quitosano, octanoato de sodio, ácido decanoico y de los compósitos quitosano/octanoato de sodio, quitosano/ácido decanoico
El quitosano de mediano peso molecular (190 a 300 kDa) (Verlee et al., 2017) se obtuvo de Sigma-Aldrich, México (75-85 % de desacetilación) y se preparó de acuerdo a las metodologías de Bautista-Baños et al. (2003) y Liu et al. (2007): Se preparó una solución de 200 mL a una concentración de 20 mg/mL, para lo cual 4 g de quitosano se disolvieron en 100 mL de agua destilada y 2 mL de ácido acético (J.T. Baker, México), los cuales se mantuvieron en agitación constante por 24 h. Posteriormente, el pH de la solución se ajustó a 5.6 con NaOH 1 N (J.T. Baker, México). Luego, se adicionó agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 200 mL y se procedió a esterilizar la solución a 120 °C, 20 psi, por 15 min. La solución de quitosano se utilizó para preparar cajas Petri con PDA a concentraciones finales de 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 y 15 mg/mL, mismas que se utilizaron en los bioensayos correspondientes.
Los ácidos grasos (octanoato de sodio y ácido decanoico) se obtuvieron de Sigma-Aldrich, México y se prepararon con base en las instrucciones del fabricante. De esta manera, se preparó una solución de octanoato de sodio a una concentración de 49.8 mg/mL en agua destilada. Con respecto al ácido decanoico, se preparó una solución en etanol absoluto (J.T. Baker, México) a una concentración de 51.6 mg/mL. Dichas soluciones se esterilizaron por filtración utilizando filtros de 0.22 µm de poro (Merck Millipore, USA). A partir de la solución de octanoato de sodio se prepararon cajas Petri con PDA a concentraciones finales de 0.016, 0.16, 0.33 y 0.49 mg/mL, mientras que para el ácido decanoico se prepararon concentraciones de 0.017, 0.17, 0.34 y 0.51 mg/mL, las cuales se utilizaron en los bioensayos correspondientes (Liu et al., 2008).
Los compósitos quitosano/octanoato de sodio y quitosano/ácido decanoico se prepararon de la siguiente manera: una vez preparadas y esterilizadas las tres soluciones, las concentraciones correspondientes (aquellas que mostraron un 100 % de inhibición in vitro del hongo) de octanoato de sodio se disolvieron en la solución de quitosano a temperatura ambiente (25 ± 2 °C), lo mismo que las de ácido decanoico. Dichos compósitos se agitaron vigorosamente por 5 min y se utilizaron en los ensayos de protección correspondientes.
Bioensayos in vitro: inhibición del crecimiento micelial de B. cinérea
El efecto del quitosano sobre el crecimiento micelial in vitro de B. cinerea se realizó de acuerdo a las metodologías de Liu et al. (2007) y Muñoz et al. (2009). Se preparó medio PDA con diferentes concentraciones de quitosano (2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 y 15 mg/mL). Dichas soluciones se vaciaron en cajas Petri de 60 mm (SyM, México) y una vez que el medio solidificó, un fragmento de 5 mm de PDA-micelio del hongo se colocó de manera inversa en el centro de cada caja Petri. Las cajas inoculadas se incubaron a 25 ± 2.0 °C durante 4-8 días hasta que el control negativo (ácido acético al 1 %) alcanzó el borde de la caja Petri. Se incluyó un control positivo con tiabendazol (Tecto 60®, polvo, 600 g i. a. kg, MSD AGVET), así como un control absoluto (B. cinerea + PDA). Al final del periodo de incubación, se determinó el crecimiento del diámetro de la colonia con un vernier digital (Fisher Scientific, México). Con la información obtenida se calculó el Índice Antifúngico (IA) de acuerdo a la siguiente fórmula: IA (%) = 1- (DCtratamiento/DCcontrol) x 100. Donde DCtratamiento = diámetro de la colonia de la caja con quitosano. DCcontrol = diámetro de la colonia de la caja control (Guo et al., 2006). Se realizaron seis repeticiones de cada concentración de quitosano en ensayos independientes.
Por otra parte, el efecto del octanoato de sodio y del ácido decanoico sobre el crecimiento micelial de B. cinerea se realizó de acuerdo a Liu et al. (2008), con algunas modificaciones. Se preparó medio PDA con diferentes concentraciones de los ácidos grasos (0.016, 0.16, 0.33 y 0.49 mg/mL para el octanoato de sodio y 0.017, 0.17, 0.34 y 0.51 mg/mL para el ácido decanoico), las cuales se vaciaron en cajas Petri de 60 mm. Para el caso del ácido decanoico disuelto en etanol, las cajas se mantuvieran abiertas por 1 h en campana de flujo laminar (CHCbiolus, México) para permitir la evaporación del etanol. Posteriormente, un fragmento de 5 mm de PDA-micelio del hongo se colocó de manera inversa en el centro de cada caja Petri. Las cajas inoculadas se incubaron a 25 ± 2.0 °C durante 7 días hasta que el control negativo (agua destilada estéril para el octanoato de sodio y etanol absoluto para el ácido decanoico) y el control absoluto (B. cinerea + PDA) alcanzó el borde de la caja Petri. Se incluyó un control positivo con tiabendazol. Al final del periodo de incubación, se determinó el crecimiento del diámetro de la colonia con un vernier digital y se calculó el IA de acuerdo a la fórmula mostrada en el párrafo anterior. Se establecieron seis repeticiones de cada concentración de ácido graso en ensayos independientes.
Bioensayos in vivo: ensayos de protección de frutos de fresa de la infección por B. cinerea en poscosecha
Previo a la evaluación del quitosano, octanoato de sodio, ácido decanoico y los compósitos quitosano/octanoato de sodio y quitosano/ácido decanoico en la protección de frutos de fresa, se evaluó la patogenicidad del aislado de B. cinerea sobre frutos de fresa var. Camino Real. Para realizar lo anterior, los frutos se desinfestaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 3 % durante 2 min y posteriormente éstos se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se secaron con papel absorbente estéril en campana de flujo laminar (Hernández-Muñoz et al., 2008). En los frutos desinfestados se realizaron dos heridas superficiales en la zona ecuatorial (5 mm de profundidad) y un fragmento de PDA-micelio de 3 mm se colocó en cada herida del fruto. Los frutos inoculados se colocaron en contenedores de plástico estériles con algodón humedecido y se incubaron a 25 ± 2.0 °C, durante 5-8 días (Fraire et al., 2003; Muñoz et al., 2009). Transcurrido este tiempo se evaluó la presencia de micelio de B. cinerea (Moussa et al., 2013).
Después de realizar el ensayo de patogenicidad, se evaluó el efecto protector de los compuestos anteriormente señalados sobre la severidad del moho gris. Para realizar lo anterior, el cáliz de cada fruto se removió y las fresas se desinfestaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 3 % durante 2 min. Posteriormente, se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se secaron en la campana de flujo laminar, utilizando papel absorbente estéril (Hernández-Muñoz et al., 2008). Después, se realizaron heridas superficiales (dos heridas de 5 mm de profundidad) en la zona ecuatorial de cada fruto, para así sumergirlos durante 2 min en diferentes concentraciones de quitosano, octanoato de sodio, ácido decanoico y los compósitos quitosano/octanoato de sodio y quitosano/ácido decanoico. Los frutos se dejaron secar por 1.5 h. Transcurrido este tiempo, un fragmento de PDA-micelio de cada hongo se colocó de manera invertida en las heridas del fruto para, finalmente, agregar 20 µL de la concentración correspondiente de compuesto sobre el micelio inoculado. Los frutos se colocaron en cajas de plástico estériles con algodón estéril húmedo y se incubaron a 2 ± 2.0 °C por 7 días. Transcurrido este tiempo, los frutos se almacenaron a temperatura ambiente (25 ± 2.0 °C) durante 3 días para simular las condiciones de almacenamiento de la fresa para exportación (Romanazzi et al., 2013; Darolt et al., 2016). Se realizó el mismo procedimiento para los controles negativos: ácido acético al 1 % para el quitosano y el compósito quitosano/octanoato de sodio; etanol absoluto para el ácido decanoico y ácido acético al 1 % y etanol absoluto para el compósito quitosano/ácido decanoico. Se incluyó un control absoluto (frutos inoculados con B. cinerea. Cada tratamiento se realizó por triplicado con 10 frutos por réplica y el experimento se repitió dos veces de manera independiente.
Después del tiempo de incubación se registró la infección de los frutos por B. cinerea, así como el crecimiento superficial de micelio. La severidad de la enfermedad se obtuvo de acuerdo con la escala de Romanazzi et al. (2013), la cual tiene seis niveles: 0) fruto sano; 1) 1-20 % de la superficie del fruto infectada; 2) 21-40 % de la superficie del fruto infectada; 3) 41-60 % de la superficie del fruto infectada; 4) 61-80 % de la superficie del fruto infectada; 5) más del 80 % de la superficie del fruto infectada.
Diseño experimental y análisis estadístico
Los tratamientos se aplicaron bajo un diseño experimental completamente al azar. Los datos del IA y severidad de la enfermedad se transformaron con la función √ x + 0.5 (Salgado-Garciglia et al., 2008). Los resultados se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA p ≤ 0.05) y se realizó una comparación de medias con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05) utilizando el programa estadístico SPSS-IBM Statistics versión 22.
Resultados
Inhibición del crecimiento micelial in vitro de B. cinérea
El crecimiento micelial in vitro de B. cinerea fue inhibido por Tecto 60® (6 mg/mL) y por quitosano en concentraciones de 10, 12.5 y 15 mg/mL durante un periodo de 7 días de incubación, mientras que en las concentraciones de 2.5, 5 y 7.5 mg/mL el hongo comenzó a crecer a partir del segundo día de incubación alcanzándose un IA de 71, 83 y 86 %, respectivamente. No obstante, estos valores fueron estadísticamente diferentes (p ≤ 0.05) en comparación con los controles negativo y absoluto, los cuales no mostraron inhibición (Cuadro 1, Figura 1).
Cuadro 1 Efecto de quitosano sobre el crecimiento micelial de B. cinerea.
| Quitosano (mg/mL) | Crecimiento micelial (mm) | IA(%) |
|---|---|---|
| 2.5 | 15.6±1.03 | 71d |
| 5 | 9.1±0.98 | 83c |
| 7.5 | 7.6±0.51 | 86b |
| 10 | 0 | 100a |
| 12.5 | 0 | 100a |
| 15 | 0 | 100a |
| Control positivoϯ | 0 | 100a |
| Control absoluto* | 53 | 0e |
| Control negativo¶ | 53 | 0e |
Valores con la misma letra en la misma columna no son diferentes de acuerdo a Tukey (p ≤ 0.05).
Los datos representan el promedio de seis réplicas ± la desviación estándar.
ϯFungicida Tecto 60® (Tiabendazol 6 mg/mL).
*PDA.
¶Ácido acético al 1 %, pH = 5.6.
Figura 1 Inhibición del crecimiento micelial de B. cinerea por quitosano, octanoato de sodio y ácido decanoico. Se muestra el control positivo: Tecto 60®. Control absoluto: PDA. Control negativo: ácido acético al 1 %, pH 5.6; agua destilada estéril y etanol absoluto, para el quitosano, octanoato de sodio y ácido decanoico, respectivamente. De los compuestos antifúngicos sólo se muestra una de las concentraciones que inhibió el crecimiento del hongo en un 100 %.
Respecto al ensayo con octanoato de sodio, éste inhibió completamente el crecimiento micelial de B. cinerea en dos de las concentraciones ensayadas (0.33 y 0.49 mg/mL), después de 7 días de incubación, al igual que el fungicida Tecto 60®, mientras que a la concentración de 0.16 mg/mL mostró un IA de 95 %, mostrando diferencias (p ≤ 0.05) con los controles negativo y absoluto (0 % de IA). Finalmente, en la concentración de 0.016 mg/mL se observó crecimiento similar a los controles negativo y absoluto durante los 7 días de incubación, con un IA de 2 % (Cuadro 2, Figura 1).
Cuadro 2 Efecto del octanoato de sodio sobre el crecimiento micelial de B. cinerea.
| Octanoato de spodio (mg/mL) | Crecimiento micelial (mm) | IA(%) |
|---|---|---|
| 0.016 | 52 | 2c |
| 0.16 | 3.6±2.87 | 95b |
| 0.33 | 0 | 100a |
| 0.49 | 0 | 100a |
| Control positivoϯ | 0 | 100a |
| Control absoluto* | 53 | 0c |
| Control negativo¶ | 53 | 0c |
Valores con la misma letra en cada columna no son diferentes de acuerdo a Tukey (p ≤ 0.05).
Los datos representan el promedio de seis réplicas ± la desviación estándar.
ϯFungicida Tecto 60® (Tiabendazol 6 mg/mL).
*PDA.
¶Agua destilada estéril.
Con relación al ácido decanoico, el crecimiento micelial de B. cinerea fue inhibido completamente, tanto por el fungicida Tecto 60® como por tres de las concentraciones del ácido ensayadas (0.17, 0.34 y 0.51 mg/mL), luego de 7 días de incubación, mientras que la concentración utilizada más baja (0.017 mg/mL) mostró un crecimiento similar (p ≤ 0.05) a los controles negativo y absoluto durante los 7 días de incubación, con un IA de 1 % (Cuadro 3, Figura 1).
Cuadro 3 Efecto del ácido decanoico sobre el crecimiento micelial de B. cinerea.
| Ácido decanoico (mg/mL) | Crecimiento micelial (mm) | IA(%) |
|---|---|---|
| 0.017 | 52.6±0.51 | 1b |
| 0.17 | 0 | 100a |
| 0.34 | 0 | 100a |
| 0.51 | 0 | 100a |
| Control positivoϯ | 0 | 100a |
| Control absoluto* | 53 | 0b |
| Control negativo¶ | 53 | 0b |
Valores con la misma letra en cada columna no son diferentes de acuerdo a Tukey (p ≤ 0.05).
Los datos representan el promedio de seis réplicas ± la desviación estándar.
ϯFungicida Tecto 60® (Tiabendazol 6 mg/mL).
*PDA.
¶Etanol absoluto.
Protección de frutos de fresa de la infección por B. cinerea en poscosecha
Previo a la realización de los ensayos de protección in vivo, se realizó un experimento de patogenicidad y los resultados muestran que el hongo evaluado en esta investigación es patógeno para frutos de fresa var. Camino Real después de 5 días de la inoculación (resultados no mostrados). Por otra parte, los frutos de fresa tratados con quitosano y los compósitos quitosano/octanoato de sodio y quitosano/ácido decanoico e inoculados con micelio de B. cinerea mostraron una reducción significativa (p ≤ 0.05) en la infección, en comparación con los controles negativo y absoluto, como se observa en los Cuadros 4 y 5, así como en las Figuras 2 y 3. Asimismo, sólo se observó una reducción significativa (p ≤ 0.05) en la infección de los frutos cuando éstos se trataron con ácido decanoico solo, no así con el octanoato de sodio.
Cuadro 4 Reducción de la severidad del moho gris en frutos de fresa tratados con quitosano, octanoato de sodio y el compósito quitosano/octanoato de sodio después de 10 días de la inoculación con B. cinerea.
| Tratamiento (mg/mL) | Grado de severidad (escala de daño) 0-5 |
|---|---|
| Quitosano | |
| 10 | 2.7c-e |
| 12.5 | 1.9bc |
| 15 | 1.3bc |
| Control absoluto* | 4e |
| Control negativo¶ | 3.9de |
| Octanoato de sodio | |
| 0.33 | 2.7c-e |
| 0.49 | 2.2b-e |
| Control absoluto* | 4e |
| Control negativoϯ | 4e |
| Compósito quitosano/octanoato de sodio | |
| 10/0.33 | 2.4c-e |
| 12.5/0.33 | 1.2bc |
| 15/0.33 | 1ab |
| 10/0.49 | 2b-d |
| 12.5/0.49 | 0a |
| 15/0.49 | 0a |
| Control absoluto* | 4e |
| Control negativo¶ | 3.9de |
Valores con la misma letra en cada columna no son diferentes de acuerdo a Tukey (p ≤ 0.05).
*Frutos de fresa inoculados con B. cinerea.
¶Frutos de fresa inoculados con B. cinerea y tratados con ácido acético al 1 %, pH = 5.6.
ϯFrutos de fresa inoculados con B. cinerea y tratados con agua destilada estéril.
Cuadro 5 Reducción de la severidad del moho gris en frutos de fresa tratados con quitosano, ácido decanoico y el compósito quitosano/ácido decanoico después de 10 días de la inoculación con B. cinerea.
| Tratamiento (mg/mL) | Grado de severidad (escala de daño) 0-5 |
|---|---|
| Quitosano | |
| 10 | 2.7cd |
| 12.5 | 1.9a-c |
| 15 | 1.3ab |
| Control absoluto* | 4d-f |
| Control negativo¶ | 3.9d-f |
| Ácido decanoico | |
| 0.17 | 2.4b-d |
| 0.34 | 2.4b-d |
| 0.51 | 2a-c |
| Control absoluto* | 5f |
| Control negativoϯ | 4.8ef |
| Compósito quitosano/ácido decanoico | |
| 10/0.17 | 3c-e |
| 10/0.34 | 2.8cd |
| 10/0.51 | 1.8a-c |
| 12.5/0.17 | 2.6cd |
| 12.5/0.34 | 2.5b-d |
| 12.5/0.51 | 1a |
| 15/0.17 | 1.8a-c |
| 15/0.34 | 1.6a-c |
| 15/0.51 | 1a |
| Control absoluto* | 5f |
| Control negativo° | 5f |
Valores con la misma letra en cada columna no son diferentes de acuerdo a Tukey (p ≤ 0.05).
*Frutos de fresa inoculados con B. cinerea.
¶Frutos de fresa inoculados con B. cinerea y tratados con ácido acético al 1 %, pH = 5.6.
ϯFrutos de fresa inoculados con B. cinerea y tratados con etanol absoluto.
*Frutos de fresa inoculados con B. cinerea y tratados con etanol absoluto y ácido acético al 1 %, pH = 5.6.
Figura 2 Efecto protector del quitosano, octanoato de sodio y del compósito quitosano/octanoato de sodio. A) Control absoluto: B. cinerea. B) Control negativo: B. cinerea + ácido acético al 1 %, pH 5.6. C) Quitosano 15 mg/mL. D) Octanoato de sodio 0.49 mg/mL. E) Compósito quitosano/octanoato de sodio 12.5/0.33 mg/mL. F) Compósito quitosano/octanoato de sodio 15/0.33 mg/mL. G) Compósito quitosano/octanoato de sodio 12.5/0.49 mg/mL. H) Compósito quitosano/octanoato de sodio 15/0.49 mg/mL.
Figura 3 Efecto protector del quitosano, ácido decanoico y del compósito quitosano/ácido decanoico y ácido decanoico. A) Control absoluto: B. cinerea. B) Control negativo: B. cinerea + etanol absoluto + ácido acético al 1 %, pH 5.6. C) Quitosano 15 mg/mL. D) Ácido decanoico 0.51 mg/mL. E) Compósito quitosano/ácido decanoico 12.5/0.51 mg/mL. F) Compósito quitosano/ácido decanoico 15/0.34 mg/mL. G) Compósito quitosano/ácido decanoico 15/0.51 mg/mL.
La mayor protección de los frutos de fresa de la infección por B. cinerea se observó en aquellos tratados con el compósito quitosano/octanoato de sodio en las concentraciones de 12.5/0.49 y 15/0.49 mg/mL, respectivamente, con un grado de severidad de 0 (Cuadro 4, Figuras 2 G y H). Este resultado indica una infección superficial de los frutos de 0 %, en comparación con los controles negativo y absoluto cuyos grados de severidad fueron de 3.9 (infección de los frutos del 41 al 60 %) y 4 (infección de los frutos del 61-80 %), respectivamente (Cuadro 4, Figuras 2 A y B).
Asimismo, las concentraciones de 12.5/0.33 y 15/0.33 mg/mL (Cuadro 4, Figuras 2 E y F) revelaron grados de severidad de 1.2 y 1, respectivamente, lo que equivale a un porcentaje de infección del 1 al 20 %, mostrando diferencias (p ≤ 0.05) con los controles negativo y absoluto. Por otra parte, los frutos tratados con quitosano solo, también mostraron una reducción significativa (p ≤ 0.05) de la infección, en comparación con los controles negativo y absoluto, ya que se observaron grados de severidad de 1.9 en la concentración de 12.5 (Cuadro 4) y 1.3 en la de 15 mg/mL (Cuadro 4, Figura 2C), correspondientes a una infección del 1 al 20 %. Finalmente, cuando los frutos fueron tratados sólo con octanoato de sodio, se observaron grados de severidad de 2.7 en la concentración de 0.33 (Cuadro 4) y 2.2 en la de 0.49 mg/mL (Cuadro 4, Figura 2D), correspondientes a una infección de 21 a 40 %, sin mostrar diferencias significativas (p ≤ 0.05) con los controles negativo y absoluto.
Con respecto a los frutos tratados con quitosano y ácido decanoico, la mayor protección se observó en los que se trataron con el compósito quitosano/ácido decanoico en todas las concentraciones ensayadas (10/0.17; 10/0.34; 10/0.51; 12.5/0.17; 12.5/0.34; 12.5/0.51; 15/0.17; 15/0.34; 15/0.51 mg/mL) con grados de severidad que van desde 1 hasta 3, mostrando diferencias significativas (p ≤ 0.05) con respecto a los controles negativo y absoluto (grado de severidad de 5, infección de los frutos mayor al 80 %) (Cuadro 5). Sin embargo, los tratamientos que destacan son los de 12.5/0.51, 15/0.34 y 15/0.51 mg/mL, con grados de severidad de 1, 1.6 y 1, respectivamente, los cuales revelan infecciones superficiales de los frutos de 1 a 20 % (Cuadro 5, Figura 3 E, F y G). Asimismo, cuando los frutos se trataron sólo con ácido decanoico, se observaron grados de severidad de 2.4 en la concentración de 0.17 mg/mL, 2.4 en la de 0.34 mg/mL (Cuadro 5) y 2 en la de 0.51 mg/mL (Cuadro 5, Figura 3D), equivalente a una infección de 21 a 40 %, mostrando diferencias estadísticas (p ≤ 0.05) con los controles negativo (grado de severidad de 4.8, equivalente a una infección de 61 a 80 %) y absoluto (grado de severidad de 5, equivalente a una infección superior al 80 %) (Cuadro 5, figuras 3A y B).
Discusión o Conclusiones
El hongo B. cinerea es causante del moho gris, una de las enfermedades más importantes de la fresa, la cual afecta la calidad del fruto, por lo que ocasiona cuantiosas pérdidas en el rendimiento del cultivo. El patógeno infecta las hojas y las flores de las plantas de fresa y subsecuentemente éste permanece latente hasta que comienza a pudrir al fruto cuando comienza a madurar (Kim et al., 2007).
Existen numerosos fungicidas químicos registrados para el control de la pudrición del fruto de fresa. Sin embargo, con los eminentes riesgos que su aplicación conlleva, se están evaluando alternativas para el control del moho gris en poscosecha. En la actualidad, los estudios sobre el quitosano y su uso en el control de enfermedades en poscosecha y la conservación de alimentos son atractivos por su capacidad para formar biopelículas biodegradables y antifúngicas, las cuales, además, pueden incorporar agentes antimicrobianos diversos para mejorar su actividad biológica y expandir sus aplicaciones (Berger et al., 2011; Sun et al., 2014).
En el presente estudio, el quitosano redujo el crecimiento del hongo en 100 % con las concentraciones de 10, 12.5 y 15 mg/mL. Estudios previos han mostrado que el quitosano inhibe el crecimiento de una gran variedad de hongos, incluido B. cinerea (Bautista-Baños et al., 2006; Hernández-Muñoz et al., 2008), lo que es consistente con otros estudios que indican que este biopolímero de naturaleza policatiónica, afecta a la membrana celular de los hongos mediante atracciones electrostáticas con fosfolípidos cargados negativamente, lo que provoca la salida del contenido citoplasmático o bien la inhibición de la síntesis de ADN/ARN y proteínas (Guo et al., 2008; Kong et al., 2010; Verlee et al., 2017).
Por otra parte, se ha reportado que los ácidos grasos poseen actividad antifúngica in vitro sobre el crecimiento micelial de patógenos de plantas como Penicillium pinophilum y P. digitatum (Era et al., 2015), Alternaria solani y Colletotrichum lagenarium (Liu et al., 2008), entre otros. Se ha hipotetizado que estas moléculas afectan procesos fundamentales en los microrganismos que inhiben, como las funciones de la membrana, la producción de energía, integridad de la pared y actividad proteínica (Xi-Hui y Joon-Hee, 2017). Interesantemente, en este trabajo el octanoato de sodio y el ácido decanoico inhibieron el crecimiento micelial de B. cinerea en 100 % en las concentraciones de 0.33 y 0.49 mg/mL y 0.17, 0.34 y 0.51 mg/mL, respectivamente. Estos resultados son importantes debido a que ambos ácidos grasos muestran una prometedora actividad antifúngica in vitro sobre B. cinerea, un patógeno por excelencia de la fresa, lo cual hasta el momento no se ha reportado.
Considerando los resultados obtenidos in vitro, se evaluó el efecto protector de estas moléculas aplicadas solas y en mezcla, sobre la infección de frutos de fresa por B. cinerea. Los resultados muestran que aunque al aplicar el quitosano solo, se redujo significativamente la severidad del moho gris en los frutos de fresa, el compósito quitosano/octanoato de sodio reveló los mejores resultados de protección de los frutos en las mayores concentraciones en las que fue aplicado: 12.5/0.49 y 15/0.49 mg/mL, con porcentajes de infección superficial de los frutos de 0. Por lo anterior, destaca el uso de este compósito sobre la utilización de los compuestos solos, ya que en este trabajo se observó un efecto protector aditivo cuando los frutos de fresa se trataron con la mezcla en todas las concentraciones ensayadas.
Estudios previos han aprovechado las excelentes características del quitosano de formar una biopelícula comestible y ser un acarreador de diversos compuestos como nutraceúticos (Han et al., 2004; Hernández-Muñoz et al., 2008) y extractos de plantas (Bautista-Baños et al., 2003), con el objetivo de mejorar el valor nutricional del fruto de fresa y la calidad de la papaya, respectivamente. En este trabajo se adicionó un ácido graso para mejorar la protección de los frutos de fresa de la infección provocada por B. cinerea, obteniendo resultados positivos en el compósito quitosano/octanoato de sodio. Adicionalmente, estas moléculas poseen bajo riesgo ambiental, al ser biodegradables; y son aceptadas como aditivos alimentarios, lo que resalta aún más el resultado. Para el caso del quitosano y el ácido decanoico, tanto la aplicación de los compuestos por separado como el compósito, redujeron significativamente la severidad del moho gris en los frutos de fresa, destacando las mayores concentraciones utilizadas: quitosano 15 mg/mL, ácido decanoico 0.51 mg/mL y el compósito quitosano/ácido decanoico 12.5/0.51 y 15/0.51 mg/mL, con porcentajes de infección superficial de los frutos del 1 al 40 %. Sin embargo, es preciso mencionar que en este caso no existieron diferencias significativas entre el uso de los compuestos por separado y el uso del compósito.
En conclusión, este es el primer reporte que muestra que el octanoato de sodio y el ácido decanoico inhiben el crecimiento micelial in vitro de B. cinerea. Asimismo, este trabajo también revela que el compósito quitosano/octanoato de sodio posee un mayor efecto protector de los frutos de fresa en todas las concentraciones ensayadas, sobre la infección provocada por B. cinerea en poscosecha. También se destaca el efecto protector del ácido decanoico, aplicado solo o en combinación con quitosano. Lo anterior sugiere que éstos podrían ser potencialmente utilizados en el control de la enfermedad en poscosecha. Sin embargo, resta por analizar la calidad nutricional de los frutos tratados, tanto con los compuestos por separado, como con el compósito, así como la aceptación del fruto por parte de los consumidores.
