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Introducción
La inhibina alfa (INHA) es una glicoproteína heterodimérica secretada en las células de la granulosa en el ovario, la cual inhibe la síntesis y secreción de la hormona folículo estimulante (FSH) (Knight 1996, 477; de Kretser et al. 2002, 530). Se ha demostrado que la inmunoneutralización de la INHA con péptidos sintéticos y recombinantes incrementa significativamente los niveles de FSH (Medan et al. 2006, 110; Wang et al. 2012, 397), el número de folículos, la tasa ovulatoria y el tamaño de camada en ovejas y cabras (D’Alessandro et al. 1999, 189; Medan et al. 2003, 289; Padilla et al. 2007, 162), vacas (Glencross et al. 1994, 601; Morris et al. 1993, 254; Medan et al. 2006, 110) y cerdas (King et al. 1993, 478). Efectos similares se han encontrado en novedosas vacunas de ADN contra INHA (1-32) en ovejas, ratas y ratones (Han et al. 2008, 260; Wang et al. 2012, 398; Han et al. 2014, 966), y recientemente incluyeron el RF-péptido liberador de amida-3 (RFRP-3) como un segundo inmunógeno incrementando en un 25% la presencia de partos dobles en ovejas y entre un 35 y 40% el tamaño de camada en ratones (Dan et al. 2016a, 108; b, 22).
Se ha encontrado que las vacunas de ADN, incluyendo las de INHA, expresan exitosamente el antígeno en tejidos in vivo a partir de DNA de plásmido (Han et al. 2008, 255; Kutzler et al. 2008, 778; Wang y Lu, 2013, 18.3.4); sin embargo, la fertilidad ha sido baja debido a limitaciones en la secreción de gonadotropinas y en el desarrollo folicular (Dan et al. 2016b, 106), lo cual posiblemente también se deba a que la vacuna incluye una secuencia parcial de la INHA.
El desarrollo y evaluación de una nueva vacuna de ADN y su péptido recombinante que expresa completo el péptido maduro de la INHA (165-300), puede inducir mejor respuesta inmune debido a que se asemeja a la conformación nativa, por lo que podría inducir una mejor respuesta superovulatoria. El objetivo fue evaluar una nueva vacuna de ADN contra INHA (165-300) y su péptido recombinante sobre la respuesta inmune, fertilidad y tamaño de camada en ratones.
Método
Producción del plásmido y péptido recombinante
La construcción de la vacuna de ADN se diseñó clonando la secuencia del péptido maduro de INHA (165-300), el cual fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico porcino al vector pGEM-T. Se comprobó por PCR y por secuenciación la correspondencia con las secuencias reportadas en el Gen Bank del NCBI (NM_214189). A las construcciones se les agregó las secuencias del toxoide tetánico P2 y P30. El fragmento se sub clonó en el vector de expresión pCIneo (PromegaTM). A partir de las colonias positivas se comprobó la presencia del fragmento por PCR y secuenciación. Se crecieron colonias transformadas y se purificó el plásmido recombinante (INHA-ADN). Se evaluó su expresión in vitro inducida en E. coli cepa BL21 a 37 º C y una densidad óptica de 0.5 de OD y 1 mM de IPTG; posteriormente el péptido de INHA recombinante (INHA-rec) fue purificado para su uso como inmunógeno.
Se preparó el inmunógeno de la vacuna INHA-ADN empleando el plásmido bacteriano con capacidad de expresar el fragmento del péptido maduro (305 pb) de INHA y los epítopos inmunomoduladores (P2 y P30) se agregó a la preparación polietilenamina (PEI) como adyuvante en una relación 1:6. El segundo inmunógeno se preparó usando el antígeno INHA-rec producido en el vector de expresión pET11a en E. coli, purificado por cromatografía de afinidad con agarosa níquel. Este antígeno se preparó adicionando el adyuvante Montanide ISA 71 VGTM (Seppic SA, Francia) en proporción 1:1.
Inmunización de ratones con la vacuna de ADN y antígeno recombinante
El estudio se realizó en la Unidad de Producción y Experimentación Animal de la División Académica de Ciencias de la Salud de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. Todos los procedimientos fueron realizados en acuerdo con las disposiciones de la Norma Oficial Mexicana 051-ZOO-1995 para la producción, cuidado y uso de animales experimentales, y fueron avalados por el comité de ética institucional (Ref. Núm., CIEI/SubBQBtCA/2018.1).
Para evaluar la antigenicidad de la vacuna INHA-ADN y el péptido INHA-rec, se usaron 16 ratones hembras Balb/c sexualmente maduras. Para la inmunización se empleó un sistema prime boost heterólogo (Lu 2009, 349). Un grupo (INHA, n=8) fue inoculado vía intramuscular (IM) con 100 μg de la vacuna INHA-ADN, y 14 d después se inoculó vía IM 100 μg del antígeno INHA-rec. Para las hembras del grupo control (n=8), recibieron solución salina en cada ocasión. Con la finalidad de evaluar la fertilidad y tamaño de camada en los ratones, 14 días después de la aplicación de la INHA-rec, cada grupo de hembras fueron apareadas con un macho por un periodo de 14 días. Posterior al apareamiento se registró el número de hembras paridas, tamaño y peso de la camada de la primera camada.
Treinta y cinco días después de la última inoculación se dio un refuerzo con ambos inmunógenos con las mismas dosis y vía de administración. Cada grupo de hembras se apareó con un macho por 14 días posterior al refuerzo, y posterior a la gestación se registró el número de hembras paridas, tamaño y peso de la camada de la segunda camada.
Sacrificios de ratones y obtención de sueros
Cuatro días después del primer apareamiento para muestras sanguíneas se sacrificaron por decapitación tres ratones de cada tratamiento, atendiendo las normas internacionales y la NOM-062-ZOO-1999, y avalado por el comité de ética institucional. Después del segundo parto, las hembras restantes de cada tratamiento fueron sacrificadas por decapitación y se tomaron muestras sanguíneas. En cada caso la sangre se recuperó en tubos Eppendorf de 1.5 mL, se centrifugó a 3000 rpm por 5 min y posteriormente los sueros fueron almacenados a -20º C para su posterior análisis.
Determinación de anticuerpos por ELISA. Los títulos de anticuerpos de los ratones tratados con los inmunógenos contra INHA se calcularon con base en la densidad óptica (DO) como sigue:
Análisis estadístico
Los resultados para las variables títulos de anticuerpos, fertilidad, tamaño y peso de la camada se evaluaron mediante una prueba T (SAS, 2009). Solo se consideró el efecto principal de tratamiento, debido a que el número de parto (primero y segundo) no fue importante.
Resultados
La inducción de la expresión en E. coli cepa BL21 a 37º C resultó en una exitosa expresión de la inhibina recombinante, comparada con aquellas que no fueron inducidas (Fig. 1).
Figura 1 Inducción de Inhibina alfa (165-300) en E. coli BL21 en LB. Marcador de peso molecular, carril A; clonas no inducidas, carriles B, D y F; clonas inducidas, carriles C, E y G.
Los resultados de la inoculación de ratones y la evaluación de la fertilidad se presentan en la Tabla 1. La fertilidad promedio de los ratones fue similar entre INHA (67%) y control (60%). El tamaño de camada en hembras tratadas con vacunas INHA-DNA y INHA-rec (8.67 ± 0.88 crías) fue mayor (P<0.05) comparado con el control (4.33 ± 1.67 crías). Por consiguiente, el peso de la camada también fue diferente (P<0.05) entre tratamientos (16.57 ± 2.53 g vs. 6.59 ± 2.53 g). Los títulos de anticuerpo encontrados en hembras inmunizadas contra INHA fue 2.9 veces mayor comparados con el control (P<0.05).
Tabla 1 Fertilidad y tamaño de camada en ratones inmunizados con una vacuna de ADN (INHA-DNA) contra INHA y su péptido recombinante (INHA-rec).
| Variable | Tratamiento | Valor de Probabilidad |
|
|---|---|---|---|
| 100 µg de INHA-DNA y 100 µg del INHA-rec |
Control | ||
| Títulos de anticuerpo (veces) | 2.9 | - | 0.007 |
| Fertilidad (%) | 67 | 60 | 0.85 |
| Tamaño de camada (crías) | 8.67 ± 0.88 | 4.33 ± 1.67 | 0.05 |
| Peso de camada (g) | 16.57 ± 2.53 | 6.59 ± 2.53 | 0.05 |
P<0.05 Diferencias estadísticas significativas con un alfa igual o menor a 0.05.
Discusión
Este primer experimento muestra que la vacuna INHA-DNA y su antígeno INHA-rec es capaz de inducir una respuesta inmune bajo un esquema de inoculación prime boots.
En la evaluación de la expresión de la vacuna de ADN, el análisis electroforético mostró que el peso molecular de la INHA recombinante coincide con el peso molecular (~14-18 kDa) del péptido maduro de la INHA previamente aislado (Rivier et al. 1985, 125; Knight 1996, 477).
La vacuna INHA-DNA y su antígeno INHA-rec bajo un esquema de inoculación prime boots heterólogo es capaz de incrementar el tamaño de camada cerca de un 100%. Estos resultados son superiores a los de Han et al. (2008, 260) quienes reportaron incrementos en tamaño de camada en un 16.5% en ratas. En otro estudio en el que se evaluó una vacuna de ADN en roedores, Han et al. (2014, 966) reportan incrementos en tamaño de camada en solo 7.3%.
Este incremento significativo en el tamaño de camada es posible explicarlo debido a que la construcción vacunal empleada incluye la secuencia completa de la INHA. En la evaluación de la inducción de la expresión de la vacuna de ADN (INHA-ADN) en cepas E. coli BL21, (Figura 1) se ha constatado la expresión del péptido recombinante (INHA-rec) correspondiente al péptido maduro. Por lo anterior, es posible tener una mayor similitud pos transduccional de la INHA recombinante en relación a la nativa, lo cual ofrece una ventaja comparativa a la desarrollada por otro grupo de investigadores (Han et al. 2008, 255).
La expresión de la secuencia completa del péptido maduro de Inhibina y el antígeno recombinante permite inducir respuestas inmunes más fuertes, lo cual se ve reflejado en los niveles de anticuerpos producidos. El resultado final es la neutralización de la INHA endógena, la cual ejerce una fuerte regulación negativa contra FSH (Knigth et al. 2012, 57), permitiendo el incremento de FSH, el desarrollo de un mayor número de folículos, y por consiguiente una mayor tasa de ovulación. Este efecto ya se ha observado en otros estudios que incluyen secuencias parciales de la INHA (Han et al. 2008, 253), o asociadas con otros péptidos (Dan et al. 2016a, 18) o antígenos (Han et al. 2013, 262 pero con respuestas en incrementos en tamaño de camada menos favorables en ratas (29.6% Han et al. 2008, 260; 30.3% Wang et al. 2012, 398), ratones tratados con vacunas de ADN de INHA (1-32) (7.6% Han et al. 2013, 966) y ratones tratados e INHA (1-32) asociado con otros péptidos (28.40% Dan et al., 2016a: 22).
El esquema de inmunización prime boost heterólogo que combina la vacuna INHA-ADN, el antígeno INHA-rec y el posterior refuerzo es otro aspecto a considerar. La vacuna INHA-ADN inicialmente promueve la expresión de proteínas recombinantes in vivo produciendo células B de memoria las cuales son específicas de dominios de conformación sensibles del antígeno (Lu 2009, 349). Esto promueve una significativa respuesta humoral y celular cuando el antígeno INHA-rec fue inoculado (Niess et al. 2005, 256; Kutzler et al. 2008, 778; Lu 2009, 349).
Uno de las limitantes en el uso de vacunas de ADN son las múltiples dosis que se tienen que inocular para promover una buena respuesta inmune, la cual lo convierte en algo impráctico (Han et al. 2014, 966). Es posible que el esquema de inmunización prime boost heterólogo contribuya a disminuir las múltiples dosis de vacunas de ADN, por lo que nuevos estudios que incluyan otras especies serán requeridos. La vacuna de ADN contra INHA presenta ventajas que incluyen su producción con menor costo y no requiere una cadena fría para su mantenimiento o dispositivos especiales para su aplicación.
En conclusión, esta nueva vacuna de ADN contra INHA y su péptido recombinante es capaz de inducir anticuerpos contra INHA en ratones e incrementar el tamaño de camada sin un efecto negativo aparente en la fertilidad. Esta vacuna también podría funcionar para incrementar la tasa de ovulación y el tamaño de camada en animales domésticos de importancia zootécnica; sin embargo, se requieren plantear nuevos experimentos, evaluar fertilidad y la respuesta en niveles de FSH, principalmente.
