Aislamiento e identificación de P. aeruginosa

Se colectaron muestras de agua de los canales de riego en la región de la Ciénega de Chapala, Michoacán, en los municipios de Sahuayo (20°03’ de latitud norte y 102°43’ de longitud oeste); Venustiano Carranza (20°08’latitud norte y 102°35 minutos de longitud oeste); y Vista Hermosa (20°16’ de latitud norte y 102°28’ de longitud oeste). Las muestras se colectaron durante los meses de septiembre a diciembre del 2012 a una profundidad de 30 cm y 1 m del borde del canal de riego. Se depositaron en tubos estériles y se transportaron en hielo (4ºC) al laboratorio, donde fueron procesadas el mismo día de su colecta. Para la determinación del número total de bacterias viables en las muestras de agua, se hicieron diluciones decimales 1:10, 1:100 y 1:1000; de las últimas dos diluciones se sembraron 100 µl en cajas Petri con agar nutritivo (DIBICO). A partir de las colonias crecidas en agar nutritivo se seleccionaron 5 colonias independientes de cada muestra y se sembraron en agar Pseudomonas F. Se seleccionaron las colonias pigmentadas y fluorescentes bajo luz UV, a las cuales se les realizó tinción de Gram y se identificaron bioquímicamente, las principales pruebas que se realizaron fueron fermentación de glucosa y lactosa, así como producción de gas y H₂S en agar Kligler con Hierro, IMViC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato), oxidasa y catalasa (^{MacFaddin, 2000}).

Identificación molecular de P. aeruginosa

La confirmación de la identidad de los aislados de P. aeruginosa se realizó por PCR de acuerdo con la literatura (^{Pirnay et al., 2002}; ^{Spilker et al., 2004}). A partir de un cultivo crecido en agar nutritivo toda la noche se tomó una asada y se resuspendió en 20 μl de solución de lisis (0.25% de SDS y 0.05 M de NaOH). Después, la mezcla se hirvió por 15 min y se adicionaron 180 μl de agua destilada estéril. Las reacciones de amplificación se realizaron en 25 μl, conteniendo 1X Master mix (Promega), 0.5 μM de cada primer y 2 μl de extracto total de ADN (50 ng aproximadamente). Las condiciones de amplificación con los oligonucleótidos PA-GS-F/PA-GS-R (rDNA 16S) y PA-SS-F/PA-SS-R (rDNA 16S) (Tabla 1) fueron: un ciclo inicial de desnaturalización a 95°C por 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94°C por 40 s, alineamiento a 55°C por 30 s y extensión a 72°C por 1 min. Las reacciones se terminaron con un ciclo de extensión a 72°C por 5 min. Para los primeros PS1/PS1 (oprI) y PAL1/PAL2 (oprL), las condiciones fueron similares a las anteriores, solo que la temperatura de alineamiento fue a 57°C. Los fragmentos amplificados se separaron en geles de agarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador Universal Hood (Bio-Rad).

Distribución de genes de virulencia en P. aeruginosa

Para el análisis de la distribución de los genes de virulencia se realizaron amplificaciones por PCR con oligonucleótidos para algD (GDP-manosa 6-deshidrogenasa), lasB (elastasa), toxA (exotoxina A), plcH (fosfolipasa C hemolítica), plcN (fosfolipasa C no hemolítica) y exoS (exoenzyme S) de P. aeruginosa (Tabla 1). Las reacciones se realizaron en 25 μl conteniendo 1X Master mix (Promega), 0.2 μM de cada oligonucleótido y 2 μl de extracto de ADN. La amplificación de los fragmentos se realizó en las condiciones descritas previamente (^{Faraji et al., 2016}).

Perfil de resistencia a los antimicrobianos

La resistencia a los antimicrobianos se determinó mediante el método de difusión en agar (^{CLSI, 2012}), para lo cual las bacterias se crecieron en cajas Petri con agar Müeller-Hinton por 20 h a 37°C. A partir de los cultivos de toda la noche se prepararon suspensiones bacterianas en caldo Müeller-Hinton (Difco) a una turbidez equivalente al tubo 0.5 de la escala de McFarland, después 100 µl de los cultivos ajustados se sembraron uniformemente sobre la superficie de agar Müeller-Hinton (Difco). Para este análisis se utilizaron discos (Bio-Rad) impregnados con los siguientes compuestos: amikacina (AK, 30 µg), ampicilina (AM, 10 µg), levofloxacina (LEV, 5 µg), cefalotina (CF, 30 µg), cefotaxima (CTX, 30 µg), ceftriaxona (CRO, 30 µg), cloranfenicol (CL, 30 µg), gentamicina (GE, 10 µg), netilmicina (NET, 30 µg), nitrofurantoína (NF, 300µg), cefepime (FEP, 30 µg) y trimetoprim-sulfametoxazol (SXT, 25 µg). También se utilizaron discos de imipenem (IPM, 10 µg), ceftazidima (CAZ, 30 µg), aztreonam (ATM, 30 µg) ticarcilina (TIC, 75 µg) (DB BBL). Se midió el halo de inhibición y de acuerdo con los valores obtenidos, las bacterias se clasificaron como resistentes, intermedias o sensibles siguiendo los criterios del CLSI (^{CLSI, 2012}). Como control se utilizó la cepa de P. aeruginosa ATCC 27853.

Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) a antibióticos

Con el propósito de expandir el análisis de resistencia a los antibióticos se hicieron ensayos mediante dilución en agar para carbenicilina, kanamicina, estreptomicina y tetraciclina. Para lo cual las bacterias se crecieron en cajas Petri con agar Müeller-Hinton por 20 h a 37°C. A partir de los cultivos de toda la noche se prepararon suspensiones bacterianas como se indicó en el apartado anterior. Posteriormente, las suspensiones bacterianas se transfirieron a una placa de 48 pozos y con ayuda de un replicador metálico de 48 puntas (V & P Cientific) se inocularon las suspensiones bacterianas en cajas con las siguientes concentraciones 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 µg/ml de carbenicilina (Sigma), estreptomicina (Sigma), kanamicina (Sigma) y tetraciclina (Sigma). Las cajas se incubaron a 37°C por 20 h, la CMI se determinó como la concentración más baja a la cual no se registró crecimiento visible de las bacterias. De acuerdo a los valores de la CMI, los aislados se clasificaron como resistentes o susceptibles. Para carbenicilina se consideraron resistentes los aislados con una CMI ≥512 µg/ml, para estreptomicina ≥16 µg/ml, para kanamicina ≥32 µg/ml y para tetraciclina ≥16 µg/ml (^{Salazar et al., 2001}; ^{CLSI, 2012}).

Concentración mínima inhibitoria a metales

Para la determinación de la CMI se procedió en la preparación del inoculo de forma similar que para antibióticos. Las bacterias se inocularon en agar nutritivo con las siguientes concentraciones de metales 0. 0.5, 1, 2, 4, 5 y 6 mM de Cu⁺² (CuSO₄), Zn⁺² (ZnSO₄) y Ba⁺² (BaCl₂). Para Hg⁺² (HgCl₂), Ag⁺¹ (AgNO₃) y Cr⁺⁶ (K₂Cr₂O₇) se probaron concentraciones de 0, 0.2 0.4, 0. 6, 0.8 y 1 mM; mientras que para Te⁺⁴ (K₂TeO₃) y Se⁺⁴ (Na₂SeO₃) se analizaron concentraciones de 0, 0.5, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 mM. Las cajas se incubaron por 24 hrs a 37°C, transcurrido el tiempo se observaron y se registró la CMI, es decir la concentración a la que ya no se observó crecimiento.

Aislamiento e identificación de P. aeruginosa

Durante septiembre a diciembre del 2012 se colectaron 20 muestras de agua de fuentes superficiales destinadas al uso agrícola en el noroeste del estado de Michoacán, México. Los resultados obtenidos de bacterias viables presentes en las muestras de agua oscilaron entre 2x10⁴ y 1.2x10⁶ UFC/ml. A partir de 100 colonias seleccionadas al azar se estudiaron con más detalle 46 aislados que mostraron pigmentación verde y producción de fluorescencia bajo luz UV en agar Pseudomonas F. La identidad de las bacterias fue confirmada a nivel bioquímico donde se observó que no fermentaron lactosa ni glucosa y no produjeron gas ni H₂S en agar Kligler con Hierro, también en INViC dieron (---+), crecieron en agar cetrimida, positivos para oxidasa y catalasa, producción de piocianina y fluoresceina. Las 46 bacterias fueron confirmadas a nivel molecular como P. aeruginosa mediante la amplificación de los genes oprI/oprL (^{Pirnay et al., 2002}) y de fragmentos específicos del gen ribosomal 16S a nivel de género y especie (^{Spilker et al., 2004}).

Distribución de genes de virulencia

Con el propósito de analizar el potencial de virulencia de los aislados bacterianos se determinó la distribución de 6 genes importantes para la virulencia en las 46 P. aeruginosa, se encontró que los más frecuentes fueron toxA y algD detectados en las 46 bacterias, los cuatro genes restantes se identificaron como sigue; lasB en 45, plcH en 44, plcN en 42, exoS en 41.

Análisis de resistencia a los antibióticos

Los datos obtenidos de susceptibilidad de las 46 P. aeruginosa contra 16 antibióticos mediante difusión en disco, indicaron que los mayores índices de resistencia se registraron para ampicilina, ceftriaxona y cloranfenicol con el 100% de aislados resistentes, seguido del 97.8% de resistentes a cefalotina, 93.5% a cefotaxima y nitrofurantoína, respectivamente; mientras que 47.8% fue resistente a trimetoprim-sulfametoxazol (Tabla 2). Por otro lado, todas las P. aeruginosa fueron susceptibles a ceftazidima, gentamicina, imipenem y ticarcilina, mientras que para amikacina, aztreonam, levofloxacina y netilmicina el 97.8% fue susceptible. También, altos índices de susceptibilidad se registraron para netilmicina 95.7 % y cefepima con el 73.9% (Tabla 2).

El análisis de la CMI mostró que todas las bacterias tuvieron una CMI ≥32 y ≤128 µg/ml para carbenicilina, para kanamicina entre ≥128 y ≤256 µg/ml, para estreptomicina de entre ≥16 y ≤64 µg/ml y por último para tetraciclina de 64 µg/ml (Tabla 3). De acuerdo a estos resultados las bacterias que se inhibieron en concentraciones menores a las indicadas por la línea punteada se consideraron susceptibles y las que su CMI está por arriba de la línea se consideraron resistentes (^{Salazar et al., 2001}; ^{CLSI, 2012}).

Tabla 3 Concentraciones Mínimas Inhibitorias de antibióticos. 

^*Cb, Carbenicilina; Km, kanamicina; Stp, estreptomicina; Tc, tetreciclina.