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Introducción
La resistencia a los antibacterianos es producto de la ineficacia de los tratamientos clínicos y que actualmente está causando un fuerte impacto negativo en la salud humana y en la producción animal (Theuretzbacher, 2013). Durante años, se ha observado el surgimiento de superbacterias altamente infecciosas y con gran resistencia a los antibióticos (Theuretzbacher, 2013). Las opciones terapéuticas para patógenos adquiridos en la comunidad como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) son tan limitadas como lo es la producción de nuevos antibióticos contra estos organismos (David y Daum, 2010). MRSA es una bacteria que se ha adaptado muy bien a las cadenas productivas humanas, siendo en la industria lechera uno de los principales problemas al ser un agente causal de la mastitis bovina (Plozza et al., 2011). Este microorganismo es altamente contagioso, persiste en las glándulas afectadas, así como en las máquinas de ordeño donde es difícil su eliminación con antibióticos (Lowder et al., 2009; Plozza et al., 2011). Se han observado elementos de resistencia a los lactámicos, y que son codificados en un casete cromosomal compuesto por los genes mecA, mecRI, mecI; sin embargo cada año se reportan cambios de este operón, lo cual demuestra la capacidad de la bacteria para resistir a nuevos fármacos (David, et al., 2010). MRSA exhibe además patrones complejos de adhesión a los tejidos del hospedero, permitiéndole formar biopelículas (Yarwood et al., 2004) y evadir la respuesta inmune (Quave, et al., 2008; Foster, et al., 2013).
Este microorganismo desarrolla una estrategia bifásica para establecerse y exhibir su patogenicidad, ya que en baja densidad bacteriana expresa factores proteicos que le permiten adherirse y colonizar superficies (Reuter, et al., 2016). Mientras que en alta densidad bacteriana la síntesis de estos factores se reprime y comienza a secretar factores de virulencia (Antunes et al., 2010). La regulación de la expresión de estos distintos factores de virulencia, se lleva a cabo por los sistemas de percepción de quórum (SPQ), cuyo fenómeno es mejor conocido como comunicación bacteriana o percepción de quórum (PQ) (Quave et al., 2008). El SPQ de S. aureus, Agr/AIP, es uno de los más ampliamente estudiados en bacterias Gram positivas, que emplea polipéptidos como moléculas autoinductoras y que regulan la expresión/secreción de diversas toxinas como son alfa, beta y delta hemolisinas, así como serina proteasa y la toxina del síndrome de choque tóxico. Este sistema consiste en una serie de eventos de señalización basados en la autoinducción con una molécula peptídica la cual posee al menos dos residuos aromáticos, uno de fenilalanina y otro de tirosina, de tal forma que cuando el autoinductor es reconocido por su receptor transmembranal (AgrC) este fosforila a la proteína AgrA, y esta a su vez, desencadena la expresión de los operones P2 y P3 (Figura 1)
El locus agr contiene dos transcripciones divergentes denominadas P2 y P3. El transcrito P2 es un operón de cuatro genes que codifican los factores necesarios para sintetizar AIP, mientras que el transcrito de P3, RNAIII, produce una molécula de RNA reguladora que actúa como el efector principal del sistema agr mediante la regulación de factores de virulencia extracelular. (Basado en Quave y Horswill, 2014).
Figura 1 Sistema de percepción de quórum Agr/AIP de Staphylococcus aureus
El operón agr (Figura 1) está compuesto por agrD que sintetiza el autoinductor peptídico (AIP), agrC la histidina-quinasa, agrA el regulador de respuesta transcripcional y agrB la proteína exportadora (Roux, et al., 2014). Como sucede con los demás SPQ cuando se alcanza una alta densidad bacteriana, la concentración del autoinductor (AIP) en el medio es alta por lo que se activa la expresión de factores de virulencia (Quave, et al., 2008). El péptido autoinductor (AIP) se une a la parte extracelular de AgrC, que a su vez autofosforila al regulador de respuesta AgrA (Figura 1) (Zhang, et al., 2002; Qiu, et al., 2005; Kavanaugh, et al., 2007). Esta autofosforilación se forma por un cambio inducido por el AIP en la conformación de AgrC, que permite una conexión entre el sensor y la quinasa (Painter, et al., 2014). AgrA, regula la expresión de los operones hld y agr mediante los promotores P2 y P3 (Figura 1). El gen hld codifica la molécula efectora RNAIII, que regula varios factores de virulencia. Los componentes RNAIII y AgrA, regulan la transcripción de alrededor de 200 genes involucrados en factores de virulencia (O’Rourke et al., 2014).
Por lo tanto, si se interrumpe la expresión de genes que se asocien al operon agr, la producción de factores de virulencia también se verá interrumpida. Bajo esta condición, la bacteria pierde su capacidad de colonizar y causar daño.
El uso de moléculas APQ es una alternativa que en décadas recientes se ha propuesto como una nueva estrategia para combatir infecciones bacterianas, con la ventaja de evitar o reducir la aparición de resistencia (Brackman et al., 2016; Hong, et al., 2012; Chong, et al., 2011). La principal característica de estas moléculas y que las distingue de los antibióticos, es que no interfieren con la viabilidad bacteriana, razón por la cual se plantea que no generan presión de selección y por lo tanto no generan resistencia como lo hacen los compuestos bactericidas (Castillo-Juárez et al., 2015).
Los compuestos fenólicos presentes en especies vegetales hasta el momento se han descrito como la principal fuente de metabolitos APQ (Quave et al., 2008), por lo que es posible que se pueda identificar esta actividad en las hojas de aguacate mexicano. México es el centro de origen de muchas especies vegetales tales como el maíz, el cacao, la papaya, el jitomate, así como el aguacate (Persea americana Mill.) (Gutiérrez-Díez, et al., 2009). En el país se cultivan variedades “criollas” de aguacate en huertos comerciales y en traspatios o bien se encuentran de forma silvestre (Gutierrez-Díez, et al., 2009). El estado de Nuevo León forma parte del centro de origen de la raza mexicana de aguacate (Persea americana var. drymifolia) (Sánchez -Pérez, 1999), se han encontrado evidencias de aguacates primitivos en áreas de la Sierra Madre Oriental del Estado de Nuevo León. Los habitantes de los pueblos cercanos a este punto, de forma tradicional, utilizan las hojas de aguacate “criollo” (Persea americana var. drymifolia) como remedio medicinal contra la diarrea, amebiasis y helmintiasis (Díaz, et al., 2013, Rosas-Piñon, et al., 2012).
Algunos intentos por caracterizar las fracciones polares de las hojas de aguacate (Abe et al., 2005; Dike, 2012; Jiménez-Arellanes et al., 2013) han reportado terpenoides y fenilpropanoides, con propiedades antimicrobianas (Sacchetti, et al., 2006; Ríncon-Hernández y Espinosa-García, 2008).
En el presente trabajo se evaluó la actividad bactericida sobre cepas de MRSA, así como la capacidad antioxidante de los polifenoles totales extraídos de las hojas de 18 distintas variedades de aguacate mexicano. Además se analizó su efecto APQ mediante el análisis de la expresión génica del sistema agr. Con los resultados obtenidos proponemos el uso de un recurso vegetal subutilizado como una fuente importante de metabolitos bactericidas y APQ de cepas de MRSA.
Materiales y Métodos
Obtención de material vegetal
Fueron utilizadas hojas verdes de distintas variedades de árboles de aguacate mexicano de los municipios de Zaragoza (Latitud: N 24°6’0”, Longitud: O 99°49’48”) y Aramberri (Latitud: N 23°59’24”, Longitud: O 99°48’36”) del Estado de Nuevo León. Los nombres de las variedades fueron proporcionados por los pobladores del lugar: "amarillo", "campeón", "cuerno", "criollo 1", "criollo 2", "criollo 3", "criollo 4", "el Salto", "el Salvador", "huevo de paloma", "Leonor", "mantequilla", "María Elena", "pagua", "plátano temprano", "plátano tardío", "plátano largo", "pato".
Extracción y purificación de los polifenoles totales
Las hojas de aguacate fueron secadas en un horno de flujo continuo a una temperatura de 45°C durante 24 horas. El material fue pulverizado y se resuspendió en agua estéril. Los polifenoles de las hojas de aguacate fueron obtenidos mediante extracción asistida por ultrasonido a 20 Hz durante 1 hora y fueron purificados en una columna de amberlita XAD-16 usando etanol al 100% como fase móvil. El disolvente fue eliminado mediante un evaporador rotatorio a 60°C por una hora. El precipitado resultante con los polifenoles fue reconstituido en etanol al 70%.
Cepas bacterianas
Se utilizaron las siguientes cepas de MRSA: CCIV4 aislada de un animal con mastitis bovina, ATCC 35592 asociada a hospital, ATCC BAA-1552 asociada a comunidad y la μ3, misma que presenta una resistencia intermedia a vancomicina (ATCC 700698).
Antibiograma Kirby-Bauer
Se realizó un ensayo de sensibilidad a cada uno de los extractos por el método de difusión en placa. Se ajustó una solución bacteriana a 0.5 en la escala de Mcfarland a partir de un preinóculo incubado en caldo soya-tripticaseína (TSB) por 18 horas a 37°C. Se inocularon 500 μl del cultivo ajustado en placas de agar Müller-Hinton de cada una de las cepas. Posteriormente se emplearon sensidiscos de 5mm de diámetro de papel Watman no. 1 con 30 μL de las muestras de polifenoles a una concentración de 0.2 mg∙mL-1. Las placas se incubaron por 24 horas y se determinó el diámetro en milímetros de la zona de inhibición (Jorgensen y Turnidge, 2015).
Determinación de la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida
Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) fue empleada la metodología de Jorgensen (2015) con modificaciones. Se utilizaron 20 tubos con 100 μL de la solución bacteriana ajustada a 0.5 en la escala de McFarland y se inocularon en tubos con 0.85 mL de TSB. Posteriormente, cada tubo fue ajustado a un volumen final de 1mL y a concentraciónes de polifenoles de 50 a 190 μg∙mL-1 en intervalos de 10 μg∙mL-1 y de 200 a 500 μg∙mL-1 en intervalos de 50 μg∙mL-1 . Como control positivo se utilizó 30 μg∙mL-1de kanamicina y como control negativo etanol al 70% y un tubo con TSB sin inocular. Todos los tubos fueron incubados por 24 horas a 37°C y 120 rpm.
La CMI fue medida en la concentración del extracto que permitió sobrevivir a menos de 0.1% del inoculo. Para determinar la CMB, los tubos del ensayo anterior que mostraron inhibición de más de 0.1% fueron sembrados en agar soya tripticaseína (TSA) e incubados a 37°C por 24 horas. La CMB fue aquella concentración que no presentó crecimiento bacteriano correspondiente a alguna de las concentraciones empleadas.
Extracción de RNA y síntesis de cDNA
Para la extracción de RNA fueron inoculados dos matraces con 50 mL de TSB por cada cepa, hasta obtener la máxima densidad bacteriana después de 120 horas de incubación a 37°C y 120 rpm. Transcurrido ese tiempo a uno de los matraces se le agrego etanol al 70% mientras que al otro se le agregaron los polifenoles de aguacate mexicano de la variedad a probar a la concentración 0.2 mg∙mL-1. Ambos matraces fueron incubados durante 1 h a 37°C y 120 rpm. Posteriormente el RNA total fue extraído utilizando tiocianato de guanidina y perlas de cerámica en un ruptor celular de acuerdo a las indicaciones del fabricante (FastRNA®Pro Green Kit). Para la síntesis del cDNA fue empleado el kit ImProm II Reverse Transcription System (Promega). Este procedimiento se repitió para las variedades María Elena, huevo de paloma, criollo 1, plátano tardío, campeón, plátano largo, pato, cuerno, mantequilla, amarillo, Leonor y el salto.
Medición de la expresión del gen agrA y rnaIII
Para la medición de los niveles de expresión del operón P2 fue seleccionado el gen agrA con los iniciadores rt-agrAf (AAAGTTGCAGCGATGGATTT), rt agrAr (ATGGGCAATGAGTCTGTGAG), mientras que para el operón P3 fue seleccionado el gen rnaIII con los iniciadores rnaIIIr (GAG TGA TTT CAA TGG CAC A) y rnaIIIf (GGT TAT TAA GTT GGG ATG G). Para determinar la expresión relativa fue usado el gen constitutivo 16S con los iniciadores rt-16S-f (CGT GGA GGG TCA TTG GA) y rt-16S-r (CGTTTACGGCGTGGACATA) (Zhao et al., 2010). Las condiciones de amplificación fueron 1 minuto a 90°C, seguido por 40 ciclos de 10 s a 90°C, 10 s a 55°C, 10 s a 72°C y una curva de fusión (melting) desde 50°C hasta 90°C. Los ensayos de qPCR fueron realizados en un equipo LightCycler® 480 Instrument II (Roche ®) y los resultado se expresan mediante el cociente del CT del gen 16S dividido entre el CT del gen agrA o rnaIII.
Análisis fitoquímico
Para la detección de la presencia de saponinas, taninos condensados, flavonoides totales y capacidad antioxidante fue elegida la variedad María Elena, la cual presenta un mayor poder bactericida y por lo tanto también el mayor potencial de encontrar compuestos bactericidas y APC.
La detección de saponinas se realizó de acuerdo al procedimiento de Galindo y colaboradores (1989). Los polifenoles fueron ajustados a una concentración final de 1 mg∙mL-1 en una solución de metanol-agua (9:1) y fue agitada durante 30 s hasta la aparición de espuma.
Para la determinación de taninos condensados se usaron 0.25 mL de la solución de polifenoles a los que se les adicionó 1.5 mL de vainillina en metanol al 4% p/v y 0.75 ml de ácido clorhídrico al 37% p/v. La mezcla fue incubada a 30°C por 15 minutos y transcurrido el tiempo de incubación fue medida la absorbancia a 500 nm (Makkar y Becker, 1993).
Los Flavonoides totales fueron determinados utilizando 150 μL de la muestra de polifenoles con 150 μL NaNO2. Después fueron adicionados 150 μL de AlCl3 al 10% y 1 ml de NaOH 1M. La absorbancia fue medida a 510 nm inmediatamente (Martínez-Ávila et al., 2011).
La actividad antioxidante fue evaluada por dos métodos. Para la capacidad captadora del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 100 μL de extracto se adicionaron a 2.9 mL de una solución 60 μM de radical DPPH’. Posteriormente, las muestras fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente en ausencia de luz. Transcurrido el tiempo de incubación, se midió la absorbancia a 517 nm (Martínez-Ávila et al., 2011). La capacidad de eliminación de radicales del extracto fue calculada con la siguiente ecuación, expresándose como porcentaje de inhibición DPPH’:
Inhibición (%) = (Abs control - Abs muestra)/Abs control X100
Por otra parte también fue determinada la capacidad antioxidante mediante la actividad inhibidora del catión 2,2’azinobis-(3 etilbenzotiazolina)-6-sulfónico (ABTS). Se diluyeron 50 μL de polifenoles con 950 μL de solución de ABTS y fueron incubados durante 1 minuto a temperatura ambiente, posteriormente se midió la absorbancia a 732 nm (Martínez-Ávila et al., 2011).
Análisis de datos
Los resultados fueron analizados mediante el software IBM SPSS ver. 19.0, usando un análisis de varianza con prueba de Tukey para el análisis de medias, así como la prueba de t de Student. Se consideró un valor de p<0.5 como estadísticamente significativo.
Resultados
Actividad bactericida de los polifenoles totales
Los 18 cultivares evaluados mostraron una discreta actividad bactericida de acuerdo con los estándares del Clinical Laboratory and Standard Institute (CLSI), al ser menores a 20 mm de inhibición se les considera de resistencia intermedia (Jorgensen y Turnidge, 2015). El cultivar que obtuvo un mayor halo de inhibición en la prueba de sensibilidad de Kirby-Bauer, fue el cultivar de María Elena (Tabla 1).
Tabla 1 Inhibición del crecimiento de polifenoles totales obtenidos de las hojas de 18 cultivares de aguacate mexicano sobre cepas de S. aureus. Halos de inhibición (mm)
| Variedad | 33592 | BAA-1552 | μ3 | CCIV |
|---|---|---|---|---|
| Control positivo (kanamicina) | 28±0.5 | 27±0.55 | 26.66±0.58 | 28±1.5 |
| María Elena | 18 ± 1.2 | 18±0.4 | 16.6±1.25 | 17±1.48 |
| Criollo 3 | 12.67±0.33 | 17±0.4 | 13.44±2.26 | 13.67±1.48 |
| El Salvador | 8±0.8 | 14.67±0.3 | 10.55±3.35 | 12±1.5 |
| Plátano temprano | 13.67±0 .58 | 14.33±1.28 | 13.11±0.38 | 14.33±1.28 |
| Criollo 4 | 14.33±0.28 | 14.33±1.28 | 12.77±0.95 | 12.67±1.3 |
| Pagua | 15±0.3 | 14.33±1.28 | 13.22±0.84 | 13.33±1.28 |
| El Salto | 12.67/+-0.33 | 13.67±0.3 | 11.78±0.84 | 12±1.3 |
| Criollo 2 | 13±0.2 | 13.67±0.3 | 12.78±0.84 | 14.67±0.3 |
| Huevo de paloma | 14 ± 1.25 | 13.67±0.3 | 12±1.4 | 11.33±1.28 |
| Criollo 1 | 10.67±0.3 | 13±1.4 | 10.55±1.26 | 11±0.7 |
| Plátano tardío | 10.67±0.33 | 12.67±1.3 | 10.27±1.3 | 11±0.5 |
| Campeón | 10.33± 1.2 | 12.67±1.3 | 10.33±1.2 | 11±0.5 |
| Plátano largo | 14/+-0.25 | 12.67±1.3 | 13.55±2.21 | 17±1.28 |
| Pato | 11.33 ±1 .28 | 12.38±1.3 | 10.68±0.6 | 11.33 ±1.3 |
| Cuerno | 11±0.3 | 11.67±1.3 | 10.33±0.33 | 11.33±1.3 |
| Mantequilla | 14.33±1.28 | 11.67±1.4 | 11.89±1.34 | 12.67±0.3 |
| Amarillo | 13.33 ± 1.2 | 11.33±0.8 | 11.55±1.1 | 13±0.5 |
| Leonor | 16.33±0.25 | 10.67±1.28 | 11.89±1.8 | 11.67±1.3 |
Los resultados se expresan como la media ± DE de tres repeticiones independientes
Debido a que el cultivar María Elena obtuvo los mejores halos de inhibición en la prueba de Kirby Bauer, esta fue seleccionada para el cálculo de la CMI y CMB. Los resultados para la CMI no presentaron diferencias significativas entre las cuatro cepas estudiadas, pero si contra el control positivo (F=24.8, p<0.001). Para la CMB tampoco se encontraron diferencias entre las cepas, únicamente contra el control positivo (F=29.31, p<0.001), tal como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2 CMI y CMB de polifenoles totales del cultivar María Elena sobre cepas de MRSA.
| Cepa | CMI (μg∙mL -1 ) | CMB (μg∙mL -1 ) |
|---|---|---|
| μ3 | 116±5.7 | 136±5.77 |
| BAA-1552 | 126±11.54 | 143.3±5.77 |
| 33592 | 133.3±11.54 | 153.33±5.77 |
| CCIV | 116±15.27 | 146±15.27 |
| μ3 + kanamicina | 56±5.77** | 86.7±5.77** |
Los resultados se expresan como la media de tres repeticiones ±DE.** ANOVA p<0.001
Análisis fitoquímico
Los resultados obtenidos en el análisis fitoquímico de los polifenoles del cultivar María Elena muestran una mayor abundancia de compuestos del tipo flavonoide así como un contenido moderado de saponinas. En este ensayo no fueron detectados taninos condensados, esto puede deberse a que no se encuentran presentes en la muestra o bien a que se encuentran a una concentración más baja que la sensibilidad de la prueba.
El ensayo de flavonoides totales, arrojó una concentración de 1633.73 ppm de equivalentes de quercetina, en una concentración de polifenoles totales de 3000 ppm es decir que más del 54% de los polifenoles aislados corresponden a este tipo de compuestos. Los polifenoles evaluados mostraron tener gran poder antioxidante tanto en la prueba de captación del radical DPPH, así como en la capacidad antioxidante contra el radical ABTS (Tabla 3).
Tabla 3 Capacidad de captación DPPH y capacidad antioxidante del radical ABTS
| Muestra | María Elena |
|---|---|
| Capacidad de captación DPPH (%) | 94.23 ± 0.8 |
| Capacidad antioxidante ABTS (%) | 96.29 ± 1.54 |
La capacidad secuestradora y capacidad antioxidante fue expresada como el porcentaje de inhibición de DPPH y ABTS. Los valores se muestran como la media ± DE de tres repeticiones.
Expresión de los genes agrA y rnaIII de las cepas de MRSA tratadas con polifenoles totales
Para determinar el efecto de los polifenoles sobre el SPQ Agr/AIP de MRSA fueron medidos los niveles de expresión de los genes específicos de los operones P2 y P3. Por una parte, para medir la expresión del operón P2, fue seleccionado el gen agrA y su nivel de expresión fue comparado contra el gen constitutivo 16S (Zhao et al., 2010). Los resultados obtenidos muestran una disminución en la expresión mediada por los polifenoles totales del cultivar María Elena (p<0.001) que va desde el 56% en la cepa de MRSA asociada a infecciones intrahospitalarias (ATCC 33592) hasta el 74% en la cepa μ3, la cual presenta también resistencia intermedia a vancomicina (Figura 2).
Figura 2 Análisis de la expresión del gen agrA de las cepas de MRSA. Las barras expresan el índice de expresión calculando el cociente de CT 16S/agrA. Azul: Control de etanol al 70%; Rojo: cepa en presencia de los polifenoles totales de P. americana var. drymifolia. (RT-qPCR, sybr Green; p <0.001).
De igual manera, fueron medidos los niveles de expresión del operón P3, para tal efecto, fue utilizado el gen rnaIII, en el cual se encuentra incluido una parte del gen hld mismo que codifica para la δ hemolisina y que está encargado de la expresión de múltiples factores de virulencia, adhesión y supervivencia de la bacteria (Zhao et al., 2010). De manera similar a lo obtenido con la expresión del gen agrA fue obtenida una reducción en los niveles de expresión del operón P3, sin embargo, pese a ser un resultado estadísticamente significativo (p<0.001), estos obtuvieron un índice menor a los obtenidos con el gen agrA. Los resultados muestran una disminución de los niveles de expresión que van del 40% en la cepa ATCC asociada a comunidad BAA-1552, hasta 51% de la cepa clínica aislada de ganado bovino con mastitis CCIV (Figura 3).
Figura 3 Análisis de la expresión del gen rnaIII de las cepas de MRSA. Las barras expresan el índice de expresión calculando el cociente de CT 16S/rnaIII. Azul: Control de etanol al 70%. Rojo: cepa expuesta a los polifenoles totales de P. americana var. drymifolia. (RT-qPCR, sybr Green).
Ambos resultados demuestran que tanto el operón P3 como el operón P2, disminuyen de forma significativa sus niveles de expresión con respecto a la expresión del gen 16S y por lo tanto, de todos los genes asociados de ambos operones.
Para comprobar si la actividad registrada para los polifenoles del cultivar María Elena, se presentaba también para los polifenoles de otros cultivares, se seleccionaron 11 que presentaban halos de inhibición menores a 15 mm en relación a la cepa μ3. Los resultados obtenidos muestran que el efecto es consistente en estas variedades al encontrarse el mismo patrón de inhibición (p<0.001) para ambos genes evaluados (Figura 4).
Figura 4 Análisis de la expresión del gen agrA y rnaIII de la cepa μ3 contra los polifenoles de hojas de 11 variedades diferentes. Panel A. Análisis de la expresión relativa del gen agrA calculando el cociente de CT 16S/agrA (RT-qPCR, sybr Green). Panel B. Análisis de la expresión relativa del gen rnaIII calculando el cociente de CT 16S/rnaIII. Azul: Control de etanol al 70%. Rojo: cepa expuesta a los polifenoles totales de P. americana var. drymifolia. (RT-qPCR, sybr Green;).
Discusión y Conclusión
El objetivo del presente trabajo fue evaluar las actividades antioxidantes, bactericida y APQ de los polifenoles de hojas de aguacate mexicano (Persea americana var. drymifolia), así como su perfil fitoquímico funcional.
Los resultados indican una moderada actividad bactericida de los polifenoles totales presentes en las hojas de aguacate con respecto al antibiótico kanamicina. Así también, los valores de CMI (116-133.33 mg∙mL-1) y CMB (130-146 μg∙mL-1) obtenidos son mayores a los reportados para otras especies vegetales (Motamedi et al., 2014; Bezerra dos Santos et al., 2015, Taylor et al., 2005). La actividad bactericida puede deberse en parte a la presencia de saponinas; estos compuestos tienen la capacidad de romper las membranas de los microorganismos modificando la tensión superficial del medio extracelular (Nassiri y Hosseinzadeh, 2008). Con respecto al análisis fitoquímico los compuestos que se observaron en mayor abundancia fueron del tipo flavonoide, estos compuestos se han reportado previamente en extractos crudos, butanólicos y etanólicos de hoja de aguacate Hass (Akinpelu et al., 2015; Rincón-Hernández et al., 2008, Walker y Crane, 1987).
Con el fin de determinar si estos polifenoles tenían efecto APC se evaluó el efecto sobre la expresión del sistema Agr/AIP. Se seleccionó un grupo de genes que representaban a los operones inducidos por la proteína AgrA fosforilada, como son el gen agrA que se localiza al final del operon P2 y el gen rnaIII en el que se encuentra parcialmente codificada la δ hemolisina. Los niveles de expresión fueron medidos mediante RT-qPCR, observándose que los polifenoles inhiben significativamente la expresión de ambos operones (p<0.001). Lo anterior puede sugerir que la inhibición del SPQ mediado por el sistema Agr es realizada en algún momento antes o durante la fosforilación de la proteína AgrA. Una posible explicación podría ser que la presencia de derivados de flavonoides inhiben los sitios de unión del autoinductor, debido a que este posee dos residuos de aminoácidos aromáticos, de tal manera que, los flavonoides podrían ocupar estos sitios, impidiendo la unión del AIP al receptor y por ende la fosforilación de AgrA.. Se ha reportado que un mecanismo similar es provocado por la baicaleína, un flavonoide aislado originalmente de Scutellaria baicalensis (Chen et al., 2016).
Este efecto se repitió en otras 10 variedades, de las cuales caben destacar el cultivar “El cuerno” que tuvo solo 11 mm de inhibición en la placa de difusión contra la cepa μ3 y una medición relativa de la expresión del gen agrA en una proporción 5 veces menor en presencia de los polifenoles que en la ausencia de estos.
La principal característica de los compuestos APQ es que dichas moléculas no tienen efecto sobre la viabilidad celular (Quave et al., 2011), sin embargo en este trabajo nosotros reportamos la capacidad de inhibir la expresión de genes relacionados con el sistema Agr/AIP, así como una capacidad intermedia de inhibir el crecimiento bacteriano. Tal efecto puede deberse principalmente a dos causas, la primera, puede ser a la coexistencia de diferentes moléculas del tipo flavonoide con un blanco diferente en la célula. Al ser una mezcla heterogénea de polifenoles existe la posibilidad de que esto ocurra por ejemplo, se han encontrado compuestos flavonoides que pueden provocar la salida de los materiales intracelulares como resultado de la ruptura de la membrana citoplasmática (Aherne et al. 2007), así como de otros que pueden inhibir la síntesis de los ácidos nucleicos e inducir la permeabilidad de la membrana bacteriana (Lamb y Cushine, 2005). De ser esto posible podríamos encontrar moléculas que compitan con los receptores AgrC en coexistencia con otros flavonoides que actúen sobre la viabilidad bacteriana. Existen reportes de moléculas de este tipo que selectivamente inhiben la PQ por ejemplo la baicaleina (Chen et al., 2016) los análogos al 4-benzoil-fenoxi-butiril (Gordon et al., 2013), la kaempferida o la 3,7,30-trihidroxi-flavona (Skogman at al., 2016). La segunda opción podría ser la concentración de los flavonoides. En otros sistemas de PQ como Burkholderia spp (Huber et al., 2003) y Pseudomona aeruginosa (Lee et al., 2015), basados en auto inductores no proteicos como las N-acil- homoserina-lactonas de los Gram negativos (Whitehead et al., 2001) se ha observado que el galato de epigalocatequina (EGCG del inglés: epigallocatechin gallate) en altas concentraciones es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, sin embargo en concentraciones subletales disminuye la virulencia de la bacteria (Lee et al., 2015). Un caso semejante es reportado en Enterococcus faecalis en altas concentraciones el EGCG inhibe la formación de biopelícula por medio del efecto bactericida, pero a dosis subletales disminuye la expresión de los genes de virulencia (Lee et al., 2015) mismos que son regulados por sistema FRS/AIP (Carniol et al., 2004). En S. aureus el EGCG también actúa como bactericida en altas concentraciones sin embargo a dosis subletales inhibe de la formación de biopelículas por medio de la inhibición del operón ica, (Blanco et al., 2005; O’Gara, 2007). Tanto el sistema Frs de E. faecalis como el sistema Agr de S. aureus tienen en común que sus autoinductores son de naturaleza peptídica (Carniol et al., 2004: Thoendel et al., 2010), por lo que sería posible encontrar mecanismos análogos en ambas especies.
Debido a que los extractos probados en este estudio son los polifenoles totales, cabe la posibilidad de que se encuentre presente más de un compuesto activo y por lo tanto el mecanismo de acción no sea debido únicamente a la APQ. Son necesarios estudios posteriores en los que se evalúe la expresión génica global de la bacteria, para tener un mayor panorama acerca de la regulación del genoma completo mediado por estos polifenoles totales así como la caracterización molecular éstos.
