Introducción

El análisis básico de semen incluye la determinación del volumen y concentración del eyaculado y motilidad espermática: masal o individual (^{Núñez et al., 2006}). La alimentación afecta estos I parámetros (^{Graaf et al., 2007}) y la rentabilidad de los ovinocultores, ya los costos de H alimentación varían según los costos de los insumos, la conversión alimenticia y la ganancia diaria de peso (^{Albright et al, 1994}). ^{González et al., (2013)} establecen de 48 %, a 90% los I costos de producción ovina. El uso de alternativas forrajeras puede modificar el consumo de B insumos mas caros y así disminuir este costo.

El Hibiscus rosa-sinensis es una arbustiva consumida por vacunos, ovinos y caprinos, capaz de I sustituir al concentrado comercial en dietas de ovinos de pelo en crecimiento con un nivel de inclusión de 1% del peso vivo (^{Espinosa et al., 2006}), resultado de la combinación de nutrientes, digestibilidad y preferencia de los ovinos hacia este forraje. ^{Ruiz et al, (2006)} reportaron la I mejor ganancia de peso con consumos de 40 a 60% de H. rosa-sinensis en la dieta. Sin embargo, I se ha reportado efectos anti-espermáticos y anti-androgénicos (^{Unny et al, 2003}) que podrían condicionar el uso de este forraje en machos reproductores. Dado que la literatura donde se I estudió el consumo de H. rosa-sinensis con los parámetros de calidad seminal en ovinos es escasa, el objetivo del presente trabajo es evaluar el efecto de la inclusión del follaje del H. rosa-sinensis en la dieta, en los parámetros de calidad seminal en ovinos de pelo en el trópico.

Método

El presente trabajo se realizó en Yucatán, México, en las coordenadas 21°04'30" N, 89°30'19" O, con un clima AW0, el más seco de los climas cálidos húmedos tropicales, con lluvias en verano. Doce sementales ovinos Pelibuey, con experiencia en colección de semen con vagina artificial, fueron utilizados. La edad fue de 24±5 meses, con un peso de 42.04±5.24 kg, y condición corporal de 2.3±0.3 (escala 1-5, según ^{Rusell, 1969}). Con fines de adaptación, los animales fueron divididos de manera aleatoria en dos grupos (n=6), realizando una evaluación control de su calidad seminal. Posteriormente fueron asignados a dos tratamientos, en un diseño experimental completamente al azar con seis repeticiones: T1, los animales recibieron una dieta con base en alimento comercial con 16 % de PC 500 g d^-1 ovino^-1; los animales del tratamiento 2: T2 (n=12), recibieron una dieta con base en 20% de Tulipán (225.5 g MS/kg MV, ~1.6 kg d^-1 animal^-1). Ambas dietas complementadas con pasto de corte (Pennisetum purpureum x P. Typhoides var. CT-115). Las dietas fueron isoprotéicas e isoenergéticas (~ 98 g de PC y 10 MJ), según el modelo ^{AFRC (1993)} se calculó una ganancia de peso (~ 40"60 g d^-1) con el fin de asegurar que la alimentación no fuera limitante.

Al final del periodo del tratamiento (45 d) se eyacularon a los sementales con el método de vagina artificial y se obtuvo el volumen del eyaculado directamente del tubo colector. Se evaluó I la Motilidad masal del 1 al 5, según ^{Guerrero et al. (2009)}, como parte de un procedimiento I control. Se realizó un Análisis de Semen Asistido por Computadora (CASA) obteniendo los H parámetros: concentración espermática (CE/ml) en una dilución 1:1000 de semen fresco en I Glutaraldehído al 2% en una cámara Neübauer; y las variables de motilidad individual (MI): I velocidad curvilínea (VCLμ/s), velocidad rectilínea (VSLμ/s), velocidad promedio (VAP, μ/s), I índice de linealidad (LIN, %), índice de rectitud (STR, %), índice de oscilación (WOB, %), I amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, μ) y frecuencia de batido de la I cola (BCF, Hz); con una dilución de semen fresco en triladyl, agua tridestilada y yema de huevo en una cámara Makler utilizando de 10 a 20 x 10⁶ espermatozoides por mL (^{Álvarez et al, 2012}). El volumen del eyaculado en ml, la concentración espermática por mililitro y por eyaculado, la velocidad curvilínea (VCL), velocidad rectilínea (VSL) y la velocidad promedio (VAP) para T1 y T2 se analizaron con la prueba t de Student. Para determinar las subpoblaciones espermáticas, las ocho variables de motilidad obtenidas mediante el CASA de cada uno de los 20,223 espermatozoides obtenidos, fueron analizados como describe ^{Núñez Martínez et al., (2006)}. Brevemente, los datos fueron sometidos a una reducción de factores, con el método VARIMAX, y los índices se aplicaron a los valores de los parámetros de los espermatozoides individuales, y los valores obtenidos por la aplicación de los índices fueron clasificados en un proceso en dos fases, utilizando el tratamiento como variable categórica. Los datos fueron analizados con el software SPSS 15.0.1 (SPSS for Windows, Version 15.0.1. Chicago, SPSS Inc.).

Resultados

No se encontraron diferencias significativas (P>0.05, T1 vs T2 Media ± DE) en volumen para volumen de eyaculado (0.73±0.13 vs 0.87±0.12 ml), concentración espermática /ml (4051±729.5 vs 4860±598.6 millones/ml). En los índices de velocidad y movimiento se presentaron diferencias estadísticas para los ocho parámetros de motilidad (Cuadro 1) demostrando mayor motilidad espermática en los animales (P<0.01) que recibieron Hibiscus rosa-sinensis.

VCL = velocidad curvilínea, VSL = velocidad rectilínea, VAP = velocidad promedio, LIN = índice de linealidad, STR = índice de rectitud, WOB = índice de oscilación, ALH = amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza, y BCF = frecuencia de batido de la cola.

** P<0.01.

Cuadro 1 Parámetros de motilidad individual de espermatozoides de ovinos pelibuey alimentados con dietas isoprotéicas e isoenergéticas conteniendo tulipán (Hibiscus rosa-sinensis) o concentrado (control). 

Cuadro 2 Indices de motilidad individual (en unidades arbitrarias, (^{Nuñez Martínez et al.,2006}) (Media+Desviación Estándar) para las subpoblaciones de espermatozoides de ovinos pelibuey alimentados con dietas isoprotéicas e isoenergéticas conteniendo tulipán (Hibiscus rosa-sinensis) o concentrado (control). 

Con los índices obtenidos, Se definieron cuatro subpoblaciones espermáticas. Las combinaciones de mayores índices, pertenecieron a las poblaciones 4 y 3, y las menores fueron lal y 2, respectivamente. Es el resultado del proceso de formación del número mínimo de nodos, a lo que llega el procedimiento Two Step Clustering, agrupando entonces a los registros mas próximos entre sí. Las subpoblaciones espermáticas mostraron un mayor porcentaje de motilidad con el tratamiento de tulipán (Cuadro 3). Las subpoblaciones presentan una estructura diferente, ya que para el tratamiento con H. rosa-sinensis se encontraron la 2 y la 3, y en el control la 1 y la 4. Sin embargo, en porcentaje, mas espermatozoides se encontraron en una de las poblaciones de mayores índices de motilidad en el tratamiento de H. rosa-sinensis (Subpoblación 3, 66.1%) que en el control (subpoblación 4, 47.2%).

Cuadro 3 Subpoblaciones espermáticas de ovinos pelibuey alimentados con dietas isoprotéicas e isoenergéticas en animales alimentados con Hibiscus rosa-sinensis o alimento concentrado (control). 

Ambas pruebas estadísticas indican diferencias entre los tratamientos. La t de Student indica que los parámetros de motilidad individual son mayores en los animales que recibieron follaje de H. rosa-sinensis, y los datos de los espermatozoides, al agruparse por índices obtenidos de los parámetros de motilidad, indican que cada uno de los tratamientos tiene subpoblaciones diferentes, y también presentan proporciones diferentes, ya que mientras en el tratamiento de H. rosa-sinensis la población 3 (mayores índices) tiene una relación 1.95:1 con la población 2 (menores índices), en el control, la relación entre las dos subpoblaciones (4 y 1) es de 0.9:1.

Discusión

Los resultados para volumen y concentración espermática obtenidos indican que no hay efecto del consumo de forraje de Hibiscus rosa-sinensis, en las condiciones de este experimento. Los H efectos en la fertilidad del Hibiscus rosa-sinensis han sido relacionados con la disminución de la espermatogénesis y la función endocrina del testículo, así como de los pesos del testículo y glándulas sexuales accesorias (^{Vasudeva y Sharma, 2008}). ^{García Contreras et al, (2009)} encontraron que la función reproductora en conejas alimentadas con H. rosa-sinensis fué comparable a la obtenida con balanceado comercial, mientras que la morfología del tracto reproductor del conejo no se ve afectada con niveles de inclusión de hasta el 60% (^{Ramos et al., 2011}).

En otras pruebas, se ha reportado disminución del volumen eyaculado y menores conteos de espermatozoides en epidídimo de ratas con dietas altas en fitoestrógenos (^{Assinder et al, 2007}). Esto ha sido relacionado con un aumento de la apoptosis en células germinales, lo que lleva a una reducción significativa del número de elementos espermatogénicos como espermatogonias, espermatocitos, espermátides y espermatozoides de la cola del epididímo (^{Reddy et al., 1997}). En el presente trabajo no se observó una diferencia en el volumen de eyaculado o concentración espermática, por lo que se pueden descartar estos proceso con el consumo de H. rosa-sinensis. Los estudios existentes de efectos del H. rosa-sinensis son de extractos acuosos, de benceno, cloroformo o etanol, utilizando la flor, originando concentraciones altas, difíciles de alcanzar con el uso del follaje en la alimentación.

En la alimentación de rumiantes con H. rosa-sinensis, no ha afectado la función reproductora en machos (^{Aguilar-Urquizo et al., 2013}). Los fitoestrógenos son reducidos en el rumen a Daidzein y finalmente a Equol, sufriendo una considerable degradación. Sin embargo, niveles altos (20 mmol/L) pueden ser alcanzados en el plasma de las ovejas (^{Retana-Márquez et al., 2011}). ^{Kholkute (1977)} reporta una reducción de fructosa prostática, fosfatasa alcalina en la próstata, y de ácido cítrico en vesículas seminales y se relacionan negativamente con la motilidad, lo cual es congruente con el aumento de motilidad encontrado en este estudio.

En otros estudios se demostró el efecto del consumo de plantas del género Hibiscus en la calidad seminal en otros mamíferos. Aunque ^{Orisakwe et al, (2004)}, al evaluar el efecto del extracto de H. sabdariffa encontraron una disminución significativa (P<0.05) del recuento espermático en el epidídimo, ^{Amin y Hamza (2006)}, señalan una disminución de anormalidades inducida por el cisplatino en el esperma y aumento de la movilidad (P<0.05). En ratas con Diabetes + H. W. sabdariffa, concentraciones significativamente más altas (P<0.05) y mayor motilidad del esperma E£ (P<0.001) se encontró en comparación con el grupo de ratas diabéticas (^{Idris et al., 2012}). ^{Victor et al. (2014)} evaluaron la eficacia de Hibiscus sabdariffa y Telfairia occidentalis en la atenuación del estrés oxidativo en ratas adultas, reportando un incremento (P<0.05) en la concentración y motilidad espermática. La respuesta al Hibiscus puede ser dosis-dependiente, en concentraciones bajas muestran efectos favorables en la calidad seminal en ovinos pelibuey, como reportan ^{Erasmus et al., (2012)}, cuando evaluaron los efectos del extracto de Eurycoma longifolia en las diversas funciones del esperma humano.

Especies que también presentan Coumarinas, como Mucuna pruriens Linn, disminuyen los efectos negativos de la edad en conteos de espermatozoides y aumentan la motilidad (^{Suresh et al., 2010}) como en el presente trabajo.

Los fitoestrógenos de los diferentes grupos son estructuralmente similares a los estrógenos naturales, y por el anillo fenólico y la distancia entre los grupos hidroxilo pueden ligarse a los receptores de estrógenos, por lo que los resultados del presente trabajo se comparan con otras especies vegetales que contienen fitoestrógenos, de manera similar a lo presentado por ^{Dinithi et al., (2015)}. En cabritos alimentados con Trifolium pratense en la dieta, ^{Gunnarsson et al. (2009)}, encontraron que los fitoestrógenos pueden estimular la síntesis de testosterona a la pubertad, precedido de un incremento de la hormona Triiodothironina (T3). En ratas machos expuestas (3 días) a una dieta con genisteina, daidzeina, y gliciteina, se reduce la fertilidad, al incrementarse la lipoperoxidación de los espermatozoides en el epidídimo (^{Glover y Assinder, 2006}). Dada la relación entre ésta, y la pérdida de motilidad espermática (utilizada como medida de lipoperoxidación), el efecto del consumo de H. rosa-sinensis en ovinos pelibuey es contrario al de los fitoestrógenos mencionados.

A diferencia de lo encontrado en el presente trabajo, ^{Henkel et al. (2012)} indican que el extracto de Typha capensis disminuye la motilidad espermática (P<0.0001) y ^{Ahangarpour et al. (2014)} al evaluar los efectos de los extractos acuosos e hidro-alcohólicos de semilla de Lactuca sativa en el nivel de testosterona y la espermatogénesis en ratas adultas señalan una decadencia (P<0.05) en la viabilidad (directamente relacionada con la movilidad) y el conteo espermático. ^{Lembe et al., (2014)} evaluaron los efectos de la combinación de Lepidium meyenii y Fagara tessmannii observaron que en dosis altas se observa un aumento significativo (P<0.05) del conteo K. espermático

El efecto observado del H. rosasinensis en la motilidad individual y las subpoblaciones espermáticas podría estar mediado a través de cambios en la concentración de calcio, que es inversamente proporcional al movimiento. Los iones de bicarbonato activan la cAMP, lo que ha I llevado a la protein Kinase C a ser uno de los reguladores del movimiento espermático (^{Mortimer, 1997}), y cambios en la composición o el pH del plasma seminal pueden ser la causa I de las diferencias en motilidad individual.

^{Robayo et al., (2008)} indican que VCL y VAP se correlacionan de manera positiva con la habilidad de migrar en el moco cervical de la oveja, y VAP con la eficiencia de ésta migración, I pero encontraron un efecto negativo entre el desplazamiento lateral de la cabeza y la migración. En el presente estudio, los valores de VCL y VAP fueron mayores (P<0.001), los espermatozoides provenientes de ovinos pelibuey alimentados con H. rosa-sinensis. Siendo parámetros asociados con la habilidad migratoria y la eficiencia de la misma, se puede esperar un mayor potencial de migración para los que procedan de animales alimentados con esta planta.

Los efectos nocivos del consumo de los fitoestrógenos, se han relacionado con el conteo espermático (^{Chavarro et al., 2008}). Sin embargo, machos ovinos intactos en praderas con especies ricas en fitoestrógenos no muestran evidencia de morbilidad reproductiva, mientras los machos castrados muestran desarrollo de glándulas mamarias y metaplasia de la próstata y otras glándulas accesorias (^{Bennetts et al, 1946}). Los trabajos con parámetros de motilidad obtenidos por CASA en animales alimentados con follaje de H. rosa-sinensis son escasos. ^{Sharawi e Ibrahim (2014)} observaron una mayor motilidad (p<0.01) en semen de ratas que recibieron extractos de cloroformo o menor en extractos de etil-acetato, aplicándolos vía subcutánea por 3 días. ^{Kumar et al, (2014)} Dieron 200 mg/kg peso corporal de extracto de benceno de flores de Hibiscus rosa-sinensis encontrando una reducción significativa de la motilidad masal. Empero, una parte de los flavonoides de las hojas pueden ser reducidos en el rumen a AGV a través de la formación de intermediarios como el ácido p-hidroxi-fenilacético y ácido 3,4 dihidro fenilacético (^{Sharma et al.,1981})

En el H. rosa-sinensis se encuentran flavonoides, glicosidos de flavonoides, hibiscetin, cyanidin, glucósidos de cyanidin, acetato de taraxeryl, b-sitosterol, campesterol, stigmasterol, ergosterol, y ácidos cítrico, tartárico and oxálico, ciclopropenoides y pigmentos de antocianinas (^{Maganha et al., 2010}), lo que le confiere actividad antioxidante.

Utilizando una fuente de antioxidantes agregada al semen de toros, ^{Sapanidou et al., (2014)} no encontraron cambios en los parámetros VSL,VCL o VAP como en el presente trabajo, pero encontraron una mayor proporción de espermatozoides de movimiento rápido.

Las subpoblaciones espermáticas conforman la manera correcta de estudiar un eyaculado (^{Nuñez Martínez et al., 2006}), pero analizar los datos suponiendo distribución normal, es frecuente (Hoflak et al., 2007). En el presente trabajo es evidente una mayor motilidad de los animales que H recibieron el H. rosa-sinensis. Según el análisis de subpoblaciones, las diferentes proporciones presentadas en los tratamientos, determinan las diferencias en motilidad entre tratamientos, y la mayor proporción de la población de alta motilidad (66% de la subpoblación 3, en el tratamiento de H. rosa-sinensis) Esta composición de las subpoblaciones explica las diferencias encontradas en la prueba paramétrica.

El enfoque de subpoblaciones puede ser aplicado para explicar de mejor manera fenómenos biológicos que afecten la motilidad. La motilidad puede ser considerada como una prueba funcional, y los sistemas CASA pueden proveer de miles de datos de los parámetros de velocidad y movimiento. Restringir esta información al análisis estadístico univariado, parámetro por parámetro, disminuye el valor de la información total y puede llevar a conclusiones erróneas (^{Contri et al., 2012}).

Conclusiones

Los ovinos pelibuey alimentados con inclusión de 20% de Hibiscus rosa-sinensis en la dieta presentaron un volumen del eyaculado y una concentración espermática similar a los ovinos alimentados con concentrado comercial, y difieren en los parámetros de motilidad individual y composición de las subpoblaciones espermáticas: ovinos pelibuey alimentados con Hibiscus rosa-sinensis muestran tener mejor motilidad.

El H. rosa-sinensis es una opción para incluir en la dieta de sementales ovinos de pelo en el trópico.