Introducción

Anopheles calderoni especie perteneciente a la serie Arribalzagia, se encuentra incluida en el grupo Punctimacula, el cual está compuesto por las siguientes especies morfológicamente similares en estado adulto: Anopheles (Anopheles) punctimacula, Anopheles (Anopheles) guarao y Anopheles (Anopheles) malefactor (^{Rubio-Palis y Moreno, 2003}; ^{Wilkerson, 1991}). Anopheles calderoni se ha registrado en Ecuador (^{González et al., 2010}), Venezuela (^{Rubio-Palis y Moreno, 2003}) y Perú (^{Calderón et al., 1995}; ^{Cruz et al., 2004}; ^{Wilkerson, 1991}), en este último, se encontró infectada con Plasmodium vivax (^{Kroeger y Alarcón, 1993}). En Colombia, A. calderoni solo fue registrada en el 2010 (^{González et al., 2010}) debido, en parte, a su errónea identificación taxonómica, ya que anteriormente había sido confundida y reportada como A. punctimacula, considerada como un vector de malaria a nivel local (^{Olano et al., 2001}).

La evaluación de especímenes depositados en colecciones, sugiere que A. calderoni está presente en por lo menos 10 departamentos de Colombia, e incluso a altitudes mayores a las reportadas anteriormente para esta especie (^{González et al., 2010}). Trabajos posteriores con especímenes recolectados en campo reportan a A. calderoni en varias localidades del occidente colombiano (^{Gómez et al., 2015}; ^{Orjuela et al., 2015}; ^{Rodríguez-Zabala et al., 2016}). Las larvas de A. calderoni se detectan tanto en criaderos permanentes como en temporales, en criaderos artificiales de uso doméstico, en excavaciones, lagunas, estanques de peces, zanjas, arroyos y cultivos de palma (^{Conde et al., 2015}; ^{Naranjo-Díaz et al., 2014}; ^{Orjuela et al., 2015}). Por ello, se supone que podría tener una distribución más amplia de la conocida actualmente.

Algunos estudios de comportamiento, en localidades del Departamento del Valle del Cauca, Colombia, muestran que A. calderoni presenta gran heterogeneidad en su actividad de picadura al humano (^{Lucumi et al., 2011}). Esta especie se encontró naturalmente infectada por P. falciparum en localidades del municipio de Tumaco (^{Naranjo-Díaz et al., 2014}) y en Boca Prieta con P. vivax VK210 y P . falciparum (^{Orjuela et al., 2015}), ubicadas en el Departamento de Nariño, al sur occidente del país. En dicho estudio, A. calderoni fue la especie predominante (> 90%) en las localidades de municipios que reportaron índices parasitarios anuales -IPA (número de casos de malaria por cada mil habitantes de población en riesgo) de 29 y 59 (^{Orjuela et al., 2015}). Por lo tanto, se ha sugerido que A. calderoni podría ser un vector de importancia local.

Los trabajos previos en Colombia han utilizado secuencias del gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI; ^{Gómez et al., 2015}; ^{González et al., 2010}; ^{Orjuela et al., 2015}) y el gen nuclear espaciador interno transcrito 2 (ITS2; ^{Gómez et al., 2015}) para la acertada identificación de las especies de la serie Arribalzagia. Aunque estos marcadores han sido de gran utilidad, es necesario la implementación de una técnica molecular sencilla y económica como la PCR-RFLP, que puede llevarse a cabo en el laboratorio para la correcta diferenciación de estas especies.

En el presente trabajo se analizaron especímenes de Anopheles recolectados en localidades ubicadas en 10 departamentos de Colombia con el fin de conocer la distribución actual de A. calderoni en regiones ecológicamente diversas del país. Además, se calcularon las tasas de picadura y de inoculación entomológica, y se determinó la infección natural por Plasmodium para lograr una aproximación a su importancia epidemiológica en las regiones donde se encuentra presente en Colombia. Además, se caracterizó la región ITS2 y se realizó un análisis bioinformático para el diseño de una prueba molecular que permita su diferenciación de las otras especies de la serie Arribalzagia presentes en Colombia.

Materiales y métodos

Los mosquitos Anopheles incluidos en este estudio fueron recolectados utilizando atrayente humano protegido. Se utilizó un protocolo y consentimiento informado aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad Nacional de Salud Pública de la Universidad de Antioquia, Acta número 063. Las recolectas se hicieron durante 3 noches consecutivas en 2 puntos por localidad, entre las 18:00 y 24:00 hr, en intra y peridomicilio. Los ejemplares se recolectaron en localidades de los siguientes 10 departamentos de Colombia: Antioquia, Chocó, Valle del Cauca, Norte de Santander, Córdoba, La Guajira, Magdalena, Amazonas, Risaralda y Nariño; entre los años 2009 y 2015 (tabla 1, fig. 1A). Para obtener una distribución más completa de A. calderoni, se incluyen especímenes de trabajos previos del grupo (tabla 2). Las coordenadas de las localidades donde se encontró A. calderoni se posicionaron sobre el mapa de ecorregiones de la WWF (^{Olson et al., 2001}), utilizando el Sofware ArcGIS 10.2 (^{ESRI, 2014}).

Figura 1. A, Sitios de colecta de especímenes Anopheles; B, ecorregiones y localidades donde se encontró Anopheles calderoni. 

Los organismos fueron identificados usando la clave morfológica de ^{González y Carrejo (2009)} y se confirmó la identidad de la especie por análisis de secuencias ITS2 y COI. Las secuencias de ITS2 se compararon con las reportadas para esta especie en GenBank y las de 5’COI en la base de datos Barcode of Life Data System -BOLD, lo que corroboró que los ejemplares analizados pertenecen realmente a A. calderoni.

Los ejemplares de A. calderoni fueron evaluados para determinar su infección natural por parásitos de Plasmodium spp. utilizando un ensayo inmunoenzimático (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay- ELISA). Se analizaron mezclas de las cabezas y el tórax de hasta 5 mosquitos de A. calderoni de la misma localidad, usando anticuerpos monoclonales dirigidos a P. falciparum, P. vivax VK247 y P. vivax VK210, en platos separados (^{Gutiérrez et al., 2008}). Los mosquitos positivos se confirmaron por una segunda ELISA y posteriormente se realizó una PCR anidada con cebadores específicos para el género Plasmodium (^{Gutiérrez et al., 2008}, ^{Singh et al., 1999}).

La tasa de picadura a humanos (TPH), que indica el promedio de picaduras de A. calderoni que recibe una persona en 1 noche, se calculó por periodo de captura tomando el total de mosquitos (nt) sobre el número de noches de capturas (nc) y el promedio de cebos humanos (xch) utilizados [TPH = nt/nc/xch]. La tasa de infección (TI) se expresó como el número de mosquitos infectados por parásitos Plasmodium (ni), sobre el número total de mosquitos (nt) capturados a nivel de municipio [TI = (ni/nt) ×100]. Los intervalos de confianza (IC, 95%) se calcularon bajo el supuesto de una distribución binomial utilizando el software EPIDAT, versión 3.1 (^{Hervada et al., 2004}). La tasa de inoculación entomológica (TIE), que indica el número de picaduras infectivas que puede recibir una persona en el transcurso de 1 año, se calculó por municipio tomando el promedio de TPH multiplicada por 365 días y la tasa de infección [TIE = TPH × 365 × TI] (^{Gutiérrez et al., 2008}; ^{Naranjo-Díaz et al., 2013}; ^{Rosero et al., 2013}).

Para confirmar molecularmente a los mosquitos identificados por morfología como A. calderoni, se extrajo ADN a partir del abdomen (^{Rosero et al., 2010}). Se amplificó la región ITS2 siguiendo las condiciones previamente estandarizadas (^{Cienfuegos et al., 2008}, ²⁰¹¹; ^{Zapata et al., 2007}). Adicionalmente, se amplificó y secuenció el fragmento 5’COI o región código de barras (^{González et al., 2010}) en especímenes representativos de cada localidad para confirmar la asignación de especie dada por la región ITS2.

Con el fin de buscar estrategias para la diferenciación de A. calderoni de otras especies de la serie Arribalzagia, se caracterizó la región ITS2 en mosquitos de esta especie para el diseño de una prueba basada en una PCR-RFLP. Se analizó la secuencia ITS2 en organismos de varias localidades: Buga (n = 3), Riofrío (n = 3) y Cartago (n = 1) en el Departamento del Valle del Cauca; Pereira (n = 3) en el Departamento Risaralda y Tumaco (n = 5) en el Departamento Nariño. Se clonó, secuenció y analizó la ITS2 de estos especímenes. Las secuencias se editaron y anotaron en Geneious 6.0 (^{Kearse et al., 2008}), y subsecuentemente se alinearon y compararon con las secuencias reportadas para A. calderoni de Colombia, HQ622618 y HQ622619 (^{González et al., 2010}). Posteriormente, se determinó la variabilidad inter e intraespecímen. Finalmente, se realizó un análisis bioinformático, una restricción “in silico” de las secuencias ITS2, utilizando el programa NEBcutter V 2.0 (^{Vincze et al., 2003}). Se usaron las enzimas disponibles en la plataforma para obtener información preliminar y determinar si A. calderoni producía patrones de restricción que permitieran diferenciarlo de otras especies de Anopheles.

Resultados

En algunas localidades donde se detectó A. calderoni pueden encontrarse cohabitando otras especies del género Anopheles. Sin embargo, se observa que dependiendo de la localidad, departamento y ecorregión, las especies con las que cohabita varían (tabla 1, fig. 1B). En las localidades del Departamento de Nariño, A. calderoni es la especie dominante o la segunda en abundancia después de A. albimanus. Igualmente, en 2 de las localidades del Valle del Cauca (Buga y Riofrío), fue la especie más abundante durante el muestreo y en las otras 2 (Cartago y Dagua), solo se detectó A. calderoni, aunque poco abundante. En las localidades del Departamento de Chocó, se observa una mayor riqueza de especies; en éstas, A. calderoni se encuentra en bajo número, mientras que A. nuneztovari y A. darlingi, que son los vectores primarios de Colombia, son las que se registraron con mayor abundancia. En las localidades de los departamentos de Antioquia, Norte de Santander, Magdalena y Amazonas no se encontraron especímenes de A. calderoni, pero se detectaron otras de las especies de la serie Arribalzagia, incluyendo a: A. malefactor, A. neomaculipalpus, A. punctimacula, A. mattogrosensis y A. peryasuii.

De los 683 ejemplares de A. calderoni evaluados, solo se detectó 1 infectado con P. falciparum, recolectado en el municipio de Tumaco (11) (tabla 3). La tasa de infección para el período fue de 0.17 %. La tasa de picadura en humanos más alta, de 14.7 picaduras por persona por noche, se registró en el municipio de Tumaco para el mismo período en que fue capturado el mosquito infectado con P. falciparum. Se estimó que una persona puede recibir 3.1 picaduras de A. calderoni infectivas al año (tabla 3).

Se obtuvieron 38 secuencias ITS2 de A. calderoni, las cuales tuvieron un 99.6% de similitud con las reportadas para Colombia en GenBank (^{González et al., 2010}). Las secuencias tuvieron una longitud de 357 pb. La composición nucleotídica promedio fue de 53.5% GC. Se encontraron 21 sustituciones nucleotídicas que constituyeron 20 sitios polimórficos y 13 variantes, lo que representa una baja variabilidad intragenómica (tabla 4). No se encontraron inserciones o deleciones. Los análisis bioinformáticos mostraron que la enzima AluI, frecuentemente utilizada para confirmación molecular de varias especies de Anopheles (^{Cienfuegos et al., 2008}, ²⁰¹¹), no genera cortes en la secuencia ITS2 de esta especie. Sin embargo, se encontraron otras enzimas de restricción que producen patrones distinguibles que representan la región ITS2 de A. calderoni, como es la enzima HaeIII; ésta reconoce un sitio en la secuencia y genera un patrón de 2 bandas de 220 pb y 181 pb (fig. 2).

Figura 2. Restricción “in silico” que representa los patrones de la región ITS2 de A. calderoni digerida con la enzima HaeIII. Se produce un patrón de 2 fragmentos: 220 y 181 pb. Marcador: representa el marcador de peso molecular. 

Discusión

Este estudio provee información sobre la distribución reciente de A. calderoni en localidades de varios departamentos de Colombia, las cuales comprenden diversas ecorregiones. De los 10 departamentos muestreados, solo se detectó A. calderoni en 4, todos ellos ubicados al occidente del país. Chocó, Valle del Cauca, Risaralda y Nariño, que comprenden las ecorregiones de Manglares del Pacífico, Bosque montano, Bosque seco y Bosque húmedo (^{Encyclopedia of Earth, 2016}). La presencia de A. calderoni en estas ecorregiones puede sugerir su capacidad de establecerse en condiciones ambientales heterogéneas.

Los resultados demuestran que A. calderoni está distribuida al occidente del país. No se detectó la especie en localidades al norte, noreste y sur de Colombia. Además, se encontró en mayor abundancia en la municipalidad de Tumaco, Nariño, al sur la Costa Pacífica, que corresponde a la ecorregión de Manglares del Pacífico. Un estudio anterior (^{Orjuela et al., 2015}) indicó que las variables ambientales de precipitación y la humedad relativa explican la abundancia de la especie, sugiriendo estacionalidad en cuanto la presencia de A. calderoni (^{Orjuela et al., 2015}), con mayor abundancia en temporada lluviosa (^{Naranjo-Díaz et al., 2014}).

En la colección del Museo de Entomología de la Universidad del Valle (MUSENUV), se encuentran depositados especímenes de A. calderoni de las costas atlántica y pacífica de Colombia, e incluso del interior del país, como es del Departamento del Tolima (^{González et al., 2010}), comprendiendo regiones con características ecológicas de bosque seco Valle del Cauca, bosque húmedo Magdalena-Urabá, la barrera desértica del Caribe y bosque montano Valle del Cauca. A diferencia de dicho estudio, en el presente trabajo, A. calderoni no se detectó en los muestreos llevados a cabo en los departamentos del norte, noreste, noroeste y sureste de Colombia. Esto puede tener varias explicaciones, como la diferencia temporal entre los muestreos de ambos trabajos, o la época del año en que se realizaron las recolectas, sobre todo si se considera la hipótesis de que A. calderoni es influenciada por la estacionalidad (^{Orjuela et al., 2015}). En este estudio se corrobora la presencia de A. calderoni en varias localidades de la región pacífica. Además, se presenta un nuevo registro para la localidad Ricaurte, municipio de Dagua, en el Departamento del Valle del Cauca.

Es de notar que, aunque A. calderoni no se encontró en las localidades de los Departamentos de Antioquia, Norte de Santander, Magdalena y Amazonas, en éstos fueron encontradas otras especies de la serie Arribalzagia como A. malefactor, A. neomaculipalpus, A. punctimacula, A. mattogrosensis y A. peryasuii, las cuales pueden presentar problemas durante la identificación por morfología y confundirse con A. calderoni (^{Gómez et al., 2015}). Por ello se realizó la caracterización de la región ITS2 en A. calderoni como una aproximación inicial, para buscar una estrategia que permita su diferenciación con las demás especies de la serie Arribalzagia. La región ITS2 ha sido previamente utilizada en una prueba molecular basada en una PCR-RFLP para diferenciar especies de Anopheles (^{Cienfuegos et al., 2008}, ²⁰¹¹; ^{Zapata et al., 2007}). Esta prueba es relativamente sencilla de realizar en el laboratorio y tiene un costo moderado comparado con la secuenciación de ADN. La caracterización de la ITS2 en A. calderoni y la realización de un análisis de restricción “in silico” indicaron que la enzima HaeIII genera cortes en la región ITS2 de A. calderoni que producen patrones que permitirían diferenciar la especie. Se recomienda que en trabajos futuros se caracterice ITS2 para las demás especies de la serie presentes en Colombia para determinar los patrones de ITS2 de cada una de ellas, y así establecer una metodología que permita la diferenciación efectiva de especímenes recolectados en campo.

Adicionalmente, se encontró una baja variabilidad en la ITS2 en los insectos de A. calderoni. La conservación de la región ITS2, se ha atribuido al proceso de evolución concertada que homogeniza las diferentes copias de la ITS2 entre los ejemplares de una misma especie (^{Li y Wilkerson, 2007}). La baja variabilidad en la región ITS2 de A. calderoni indica su utilidad como marcador en una prueba de identificación molecular de estas especies.

El análisis de la tasa de picadura y la estimación de la tasa de inoculación entomológica revelaron una alta preferencia de picadura al humano por parte de A. calderoni. Se estimó que una persona puede recibir 3.1 picaduras infectivas al año. Por su comportamiento antropofílico y el hallazgo de su infección natural por el parásito, se considera que A. calderoni es un vector potencial de malaria a nivel local, específicamente en el sureste del país (^{Conde et al., 2015}; ^{Naranjo-Díaz et al., 2014}). Aunque la tasa de infección para A. calderoni reportada en este estudio es de 0.17%, es menor que la reportada para Perú (0.26%) (^{Cruz et al., 2004}), pero es mayor a las reportadas para vectores primarios como A. nuneztovari (0.101%) y A. darlingi (0.087%) (^{Naranjo-Díaz et al., 2013}). La tasa de picadura en humanos para A. calderoni varió ente las localidades (0.04 - 14.7 picaduras por noche),y la mayor tasa se registró para Tumaco en Nariño (14.7 picaduras por noche). Aunque esta tasa es considerada alta, se han reportado tasas de picadura aún más altas en el Departamento del Valle del Cauca (55.7 - 65.8 picaduras por noche) (^{Lucumi et al., 2011}). Por ello, en caso de tratarse de un vector local, la presencia de A. calderoni supondría un alto riesgo de transmisión de la malaria. Por todo ello, se recomienda realizar estudios futuros que brinden información sobre la biología e importancia epidemiológica de A. calderoni con el fin de implementar intervenciones de control vectorial dirigidas.