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Revista mexicana de biodiversidad

versión On-line ISSN 2007-8706versión impresa ISSN 1870-3453

Rev. Mex. Biodiv. vol.90  México ene. 2019  Epub 31-Ene-2019

http://dx.doi.org/10.22201/ib.20078706e.2019.90.2683 

Ecología

Microbiota bacteriana oral de la tortuga del bolsón Gopherus flavomarginatus en la Reserva de la Biosfera Mapimí, México

Oral bacterial microbiome of the bolson tortoise Gopherus flavomarginatus at the Reserva de la Biosfera Mapimí, Mexico

Cristina García-De la Peñaa  * 

Mirsha Rojas-Domínguezb 

Aurelio Ramírez-Bautistab 

Felipe Vaca-Paniaguac 

Clara Díaz-Velásquezc 

Verónica Ávila-Rodrígueza 

Luis Manuel Valenzuela-Núñeza 

César Alberto Meza-Herrerad 

a Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez del Estado de Durango, Av. Universidad s/n, Fracc. Filadelfia, 35010 Gómez Palacio, Durango, México.

b Laboratorio de Ecología de Poblaciones, Centro de Investigaciones Biológicas, Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Carretera Pachuca-Tulancingo Km. 4.5, Col. Carboneras, 42184 Mineral de La Reforma, Hidalgo, México.

c Laboratorio Nacional en Salud: Diagnóstico Molecular y Efecto Ambiental en Enfermedades Crónico-Degenerativas, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. De Los Barrios 1, Los Reyes Iztacala, 54090 Tlalnepantla, Estado de México, México.

d Universidad Autónoma Chapingo-URUZA, Carretera Gómez Palacio-Ciudad Juárez Km. 40, s/n, 35230 Bermejillo, Durango, México.

Resumen

Se determinó la comunidad bacteriana oral de tortugas del Bolsón Gopherus flavomarginatus de la Reserva de la Biosfera Mapimí, México, mediante secuenciación masiva. En 2015 se tomaron muestras a 5 machos y 5 hembras adultos aparentemente sanos; se extrajo el ADN, se amplificaron las regiones V3-V4 16S r ARN, se realizó secuenciación con Illumina y se usó EzBioCloud como base taxonómica de referencia. No se observó diferencia significativa en la microbiota oral entre sexos. Proteobacteria, Actinobacteria y Firmicutes fueron los phyla dominantes, así como la clase Gammaproteobacteria y el orden Pasteurellales. Pasteurellaceae, Moraxellaceae y Micrococcaceae fueron las familias más abundantes. De entre los taxones potencialmente patógenos para tortugas, se registra molecularmente la presencia de Mycoplasma y Pasteurella testudinis en G. flavomarginatus; ambas son consideradas posibles participantes en causar enfermedad respiratoria superior en otras especies de Gopherus. Se reporta por primera vez el género Bergeyella en la cavidad oral de un reptil; esta bacteria zoonótica solo había sido reportada como parte de la microbiota oral de caninos y felinos. Esta información integra una línea base de diversidad bacteriana oral para esta especie que puede contribuir a mejorar los planes actuales de su conservación y manejo.

Palabras clave: Gen 16S rARN; EzBioCloud; Proteobacteria; Mycoplasma; Pasteurella testudinis

Abstract

The community of oral bacteria of the Bolson tortoise, Gopherus flavomarginatus, was determined at the Reserva de la Biosfera Mapimí, México by massive sequencing. During 2015, samples of 5 males and 5 females apparently healthy were collected; DNA was extracted, V3-V4 16S rRNA regions were amplified, sequencing was carried out with Illumina, and EzBioCloud was used as the reference taxonomic base. No significant difference was observed in the oral microbiota between sexes. Proteobacteria, Actinobacteria, and Firmicutes were the dominant phyla, as well as the class Gammaproteobacteria, and the order Pasteurellales. Pasteurellaceae, Moraxellaceae, and Micrococcaceae were the most abundant families. Among taxa potentially pathogenic for tortoises, we documented molecularly the presence of Mycoplasma, and Pasteurella testudinis in G. flavomarginatus; both are considered as possible participants in causing upper respiratory disease in other Gopherus species. Genus Bergeyella is reported for the first time in the oral cavity of a reptile; this zoonotic bacteria had only been reported as part of the oral microbiome of canines and felines. This information provides an oral bacterial diversity baseline for this species that will contribute to and improve current conservation and management plans.

Keywords: 16S rRNA gene; EzBioCloud; Proteobacteria; Mycoplasma; Pasteurella testudinis

Introducción

La microbiota bacteriana ha coevolucionado con los vertebrados durante millones de años (Kilian et al., 2016). En particular, la cavidad oral se considera un gran ecosistema bacteriano debido a su contacto directo con el medio ambiente (Marsh y Martin, 2009). Esta composición bacteriana oral puede cambiar según la especie, el sexo, la edad, la nutrición, las condiciones climáticas y la estación del año (Carter y Cole, 1990). Entre los beneficios que ofrece la microbiota oral a su hospedero, se encuentra la formación de capas bacterianas organizadas en estructura y función (biofilm) que regulan la colonización, defensa y adaptación a cambios del medio ambiente (Li y Tian, 2012).

La microbiota oral de los reptiles sanos está compuesta por una gran diversidad de bacterias (Straub, 2002), entre las que se encuentran microorganismos comensales o mutualistas, así como algunos potencialmente patógenos para el hospedero (Santoro et al., 2006). Cuando el equilibrio entre los microorganismos y los tejidos se rompe, algunas bacterias se vuelven oportunistas provocando enfermedades infecciosas que pueden alterar la salud y repercutir en el crecimiento, reproducción y supervivencia (Ávila et al., 2009; Cleveland et al., 2002; Pérez-Heydrich et al., 2011). En algunos estudios se determinó la flora bacteriana oral en tortugas sanas de las especies Testudo hermanni, T. marginata, T. horsfieldii, Emys orbicularis, Mauremys rivulata, Sternotherus odoratus y Pelusios castaneus; se registraron bacterias comensales y potencialmente patógenas, como: Acinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Chryseobacterium, Citrobacter, Elizabethkingia, Enterobacter, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Kluyvera, Moraxella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Staphylococcus y Vibrio (Hacioglu et al. 2012; Heynol et al., 2015; Santoro et al., 2006; Straub, 2002). Para las tortugas del género Gopherus en Norteamérica se han registrado bacterias en la región oral pertenecientes a los géneros Citrobacter, Corynebacterium, Enterococcus, Flavobacterium, Kytococcus, Micrococcus, Pseudomonas, Staphylococcus y Stenotrophomonas (Dickinson et al., 2001; García-De la Peña et al., 2016; Ordorica et al., 2008). Sin embargo, Mycoplasma agassizii, M. testudineum y Pasteurella testudinis, en conjunto con un iridovirus y el herpesvirus 2, se han reportado como algunos de los posibles causantes de la enfermedad de las vías respiratorias superiores (URTD, por sus siglas en inglés) en tortugas, provocando disminución de las poblaciones de G. agassizii y G. polyphemus en EUA (Brown et al., 1999, 2001, 2004; Guthrie et al., 2013; Jacobson, 1994; Jacobson et al., 2012; Westhouse et al., 1996). La mayoría de estos estudios se han llevado a cabo utilizando técnicas tradicionales de aislamiento de bacterias mediante cultivos, pero debido a que gran parte de estos microorganismos depende de un microambiente específico que no puede ser reproducido en laboratorio, se vuelve limitado el conocimiento de su diversidad. Actualmente, la secuenciación masiva de regiones del gen 16S rARN ha permitido análisis de las comunidades microbianas a partir de cualquier tipo de muestra sin necesidad de realizar cultivos, aumentando significativamente el conocimiento de los géneros y especies que conforman la microbiota (Abusleme et al., 2017; Dewhirst et al., 2015; Hyde et al., 2016).

En México, la tortuga del Bolsón (Gopherus flavomarginatus) es endémica, se encuentra en estatus de peligro de extinción por la Norma Oficial Mexicana 059 (Semarnat, 2010) y como en peligro crítico según la Lista Roja de la UICN (Kiester et al., 2018). Su distribución geográfica está restringida al Bolsón de Mapimí en el desierto chihuahuense mexicano, donde actualmente se encuentra protegida en la Reserva de la Biosfera Mapimí (Conanp, 2006). Al igual que otras especies del género, G. flavomarginatus puede ser susceptible a enfermedades bacterianas, por lo que, en el presente estudio se determinó la microbiota bacteriana oral de machos y hembras de G. flavomarginatus aparentemente sanas mediante secuenciación masiva 16S rARN en la Reserva de la Biosfera Mapimí; con esta información se identificaron aquellas especies de bacterias potencialmente patógenas para las vías respiratorias. Se espera que esta información contribuya a mejorar los planes actuales de conservación y manejo para apoyar la sobrevivencia de esta especie.

Materiales y métodos

La Reserva de la Biosfera Mapimí abarca una superficie de 342,388 ha y comprende parte de Chihuahua, Coahuila y Durango en México (26°00’ y 26°10’ N, 104°10’ y 103°20’ O; 1,250 m snm). El clima es muy árido, semicálido BWhw(e), con una temperatura media anual de 25.5 °C y lluvias en verano (García, 2004). La vegetación predominante son los matorrales rosetófilo y micrófilo, así como la vegetación halófila y gipsófila (Rzedowski, 2006).

Para llevar a cabo la toma de datos y muestras de individuos G. flavomarginatus, se contó con el permiso DGVS07305/14 expedido por la Semarnat. Durante mayo del 2015, 5 personas recorrieron las áreas de colonias donde se distribuyen las tortugas G. flavomarginatus, establecidas previamente en el protocolo de monitoreo de esta especie (Conanp, 2017). Las tortugas se capturaron manualmente mientras estaban en actividad. Para cada individuo se registró el sexo (hembra: plastrón plano, cola corta, ausencia de glándulas bajo el mentón; macho: plastrón cóncavo, cola más larga que la hembra, presencia de glándulas bajo el mentón) de acuerdo con Adest et al. (1989) y el peso utilizando una red de tela y una balanza digital (0.01 gr). El estado físico de cada tortuga se determinó siguiendo los protocolos de observación de Homer et al. (1998), Jacobson (2014), USFWS (2016) y Wendland et al. (2009).

Para la toma de muestras orales, se abrió la boca de cada tortuga con ambas manos siguiendo el protocolo de manejo de la USFWS (2016); se introdujo un par de hisopos estériles y se llevó a cabo un ligero raspado en paladar, lengua y área sublingual durante aproximadamente 30 segundos. El par de hisopos fueron depositados en un tubo cónico estéril conteniendo 5 ml de solución salina fisiológica; estas muestras se conservaron en hielera a 4 °C. En seguida la tortuga fue liberada en el mismo sitio de su captura y se realizaron observaciones durante varios minutos para asegurar que el individuo mostrara una conducta normal.

El trabajo de laboratorio se llevó a cabo en el Laboratorio Nacional en Salud: Diagnóstico Molecular y Efecto Ambiental en Enfermedades Crónico-Degenerativas, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Universidad Nacional Autónoma de México. Los hisopos de cada muestra se agitaron en la solución fisiológica y posteriormente se presionaron contra las paredes del tubo y se retiraron. Los tubos se centrifugaron a 12,000 g × 10 min para formar una pastilla bacteriana; se desechó el líquido sobrante dejando únicamente 250 µl que fueron depositados en un tubo para lisis BashingBead™; en seguida se agregaron 750 µl de buffer lisante/estabilizador Xpedition™ Zymo Research™. Cada tubo se colocó en un disruptor celular (TerraLyzer™) durante 30 segundos para su conservación.

El ADN de las muestras se extrajo utilizando el kit Fungal/Bacteria ADN MiniPrep de Zymo Research™. El ADN extraído se corrió en geles de agarosa al 1.2% a 80V durante 45 minutos en cámara de electroforesis BIO-RAD para visualizar la presencia de ADN de alto peso molecular. La visualización se llevó a cabo en un fotodocumentador GelMaxTM (UVP®). La cantidad de ADN por muestra se midió en un fluorómetro marca Qubit®. Se llevó a cabo la amplificación de las regiones V3 y V4 del gen 16S rARN empleando los primers sugeridos por Klindworth et al. (2013): S-D-Bact-0341-b-S-17, 5´-CCTACGGGNGGCWGCAG-3´ y S-D-Bact-0785-a-A-21, 5´-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3´, que producen un amplicón de ~460 pb. Estas secuencias se mandaron sintetizar con los adaptadores “overhang” del protocolo de Illumina (2017a) quedando de la siguiente manera:

5´-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3´ y

5´-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3´ (amplicón de ~550 pb). Se utilizó el protocolo de PCR Illumina (2017a) empleando 12.5 µl de MyTaqTM Ready Mix 1X (Bioline®), 1 µl de cada primer (10 uM), 5 µl de ADN (50 ng totales) y 5.5 µl de H2O grado molecular; se utilizó el siguiente ciclo: 95 °C por 3 minutos; 25 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos, 72 °C por 30 segundos; 72 °C por 5 minutos en un termociclador Labnet MultigeneTM Gradient PCR. Se colocó 1 μl de los productos de PCR en un chip de Bioanalyzer ADN 1000 para verificar el tamaño del amplicón (~550 pb). Se realizó la purificación de los amplicones con perlas Agentcourt® AMPure® XP al 0.8%. Posteriormente, los amplicones se etiquetaron utilizando el Nextera XT Index KitTM para la creación de las bibliotecas, siguiendo el protocolo de Illumina (2017b), empleando 25 µl de MyTaqTM Ready Mix 1X (Bioline®), 5 µl de cada primer (N7xx y S5xx), 5 µl de ADN y 10 µl de H2O grado molecular; se utilizó el siguiente ciclo: 95 °C por 3 minutos; 10 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos, 72 °C por 30 segundos; 72 °C por 5 minutos. Se realizó la purificación de las bibliotecas con perlas Agencourt® AMPure® XP al 1.2%. Se colocó 1 μl de la biblioteca final de algunos productos de PCR seleccionados al azar en un chip de Bioanalyzer ADN 1000 para verificar el tamaño del amplicón esperando un tamaño de ~630 pb. Finalmente, se realizó la cuantificación, normalización (equimolaridad), la agrupación de las bibliotecas y la secuenciación masiva de siguiente generación (MiSeq Illumina® de 2 × 250 lecturas de final pareado) siguiendo el protocolo para metagenómica 16S (Illumina, 2017a).

El análisis de las secuencias se realizó en máquina virtual Oracle VM VirtualBox 5.1.14 en la plataforma MGLinux mediante el software bioinformático Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) v.1.9.0 (Caporaso et al., 2010). El proceso se inició ensamblando las secuencias forward y reverse de las muestras utilizando el programa PEAR (Zhang et al., 2014) con un traslape de 50 pb, una longitud mínima por lectura de 430 pb y máxima de 470 pb, un criterio de calidad Q30 (una base errónea por cada 1,000 bases) y un valor de p < 0.0001. Enseguida, los archivos fueron convertidos a formato FASTA y se llevó a cabo la eliminación de secuencias quiméricas de las muestras con USEARCH (Edgar, 2010). La selección de OTUs se realizó con el método UCLUST (Edgar, 2010) al 97% de similitud; se obtuvo una secuencia representativa para cada OTU y se asignó la taxonomía tomando como referencia la bases de datos EzBioCloud (Yoon et al., 2017). Se construyó la tabla de OTUs en formato biom (Biological observation matrix; McDonald et al., 2012), se separaron los dominios y se filtraron los singletons (OTUs que solo tuvieron una observación), esto último de acuerdo con Navas-Molina et al. (2013). Se obtuvieron las tablas de abundancia absoluta de OTUs y se graficó el número de secuencias por el número de taxones, categoría género, para observar si se logró una profundidad de cobertura adecuada (curvas de tendencia asíntota); esta gráfica se realizó en PAST ver 3.15 (Hammer et al., 2001). Al observar que el número de secuencias alcanzado de manera simultánea por todas las muestras fue 100,000, se llevó a cabo un proceso de rarefacción aleatoria simple (Weiss et al., 2017) tomando este valor como el número de secuencias a generarse. De esta forma se obtuvo un archivo biom estandarizado para todas las muestras. Con este archivo se calculó la diversidad beta utilizando el índice de Bray-Curtis (Beals, 1984); esta matriz de diversidad beta se utilizó para llevar a cabo una prueba Permanova (p < 0.05) para probar diferencia significativa de la microbiota oral entre sexos. La diversidad alfa se calculó con los índices de Shannon y Simpson; para probar la diferencia significativa entre sexos se utilizaron pruebas no paramétricas de t student con 999 permutaciones Monte Carlo para calcular el valor de significancia.

Se obtuvieron las abundancias relativas para phylum, clase, orden y familia, y se graficaron en Excel. Los géneros cuya abundancia relativa fue superior al 0.01% fueron representados en un mapa de calor; se utilizó el método de conglomerados jerárquicos con medida euclidiana para el dendrograma de las muestras; esta visualización se realizó con el software Morpheus (https://software.broadinstitute.org/GENE-E/). La determinación de la microbiota núcleo (OTUs presentes en todas las muestras) se llevó a cabo con los géneros y con el comando compute_core_microbiome.py.

Cada género y/o especie de bacteria registrada para G. flavomarginatus fue consultada en la literatura disponible para indicar su posible potencial patógeno en tortugas (Brown et al., 1999; Gregersen et al., 2009; Martínez-Silvestre y Soler-Massana, 2008; Martínez-Silvestre et al., 1999; McArthur, 2004; McArthur et al., 2004; Muro et al., 1998; Paré et al., 2006).

Resultados

Se presentan resultados obtenidos para muestras orales de 10 individuos adultos (5 hembras y 5 machos) físicamente sanos. Los machos presentaron una talla promedio de caparazón de 31.2 cm de largo, 26.8 cm de ancho y 9.4 kg de peso, mientras que las hembras presentaron valores de 28.8 cm, 23.8 cm y 9.3 kg, respectivamente.

La media del número total de secuencias obtenidas para ambos sexos antes del ensamblaje fue 295,811, la media de secuencias ensambladas fue 220,854 y la media de secuencias desechadas fue 74,957; en promedio se eliminaron 1,513 quimeras, dejando una media de secuencias de calidad de 219,341. Tras la asignación taxonómica, se obtuvo una media de secuencias bacterianas de 202,017 que después de eliminar los singletons fue de 157,272 (tabla 1).

Tabla 1 Número de secuencias orales obtenidas para cada individuo de Gopherus flavomarginatus. M = Macho, H = hembra, QE = quimeras eliminadas, SC = secuencias de calidad después de la eliminación de quimeras, SB = secuencias bacterianas después de la asignación taxonómica, SBSS = secuencias bacterianas después de la eliminación de los singletons. 

Individuo Totales Ensambladas Desechadas QE SC SB SBSS
M1 340,740 256,062 84,678 1,785 254,277 246,210 194,769
M2 287,584 229,153 58,431 798 228,355 221,586 170,019
M3 328,799 270,616 58,183 1,214 269,402 265,229 207,505
M4 301,889 188,996 112,893 1,299 187,697 131,325 104,378
M5 282,872 214,263 68,609 3,832 210,431 195,911 143,540
H1 306,617 253,611 53,006 1,215 252,396 245,541 191,708
H2 229,638 181,434 48,204 371 181,063 141,369 109,133
H3 260,181 184,527 75,654 1,870 182,657 163,767 133,544
H4 324,940 239,091 85,849 1,604 237,487 228,880 177,905
H5 294,854 190,790 104,064 1,142 189,648 180,350 140,222
Media 295,811 220,854 74,957 1,513 219,341 202,017 157,272

Se registró una profundidad de cobertura adecuada en cuanto al número de OTUs bacterianos de las muestras, ya que todas las curvas alcanzaron la asíntota cerca de las 100,000 secuencias (fig. 1). Utilizando la matriz de diversidad beta de Bray-Curtis generada con el archivo estandarizado a 100,000 secuencias aleatorias, no se registró diferencia significativa entre la microbiota oral de machos y hembras de G. flavomarginatus (Permanova: pseudo-F = 0.942, p = 0.461). La media del índice de diversidad de Shannon fue 6.98 y con Simpson fue 0.91. No se observó diferencia significativa entre sexos en ninguno de los índices de diversidad alfa (Shannon: t = 0.83, p = 0.418; Simpson: t = 0.72, p = 0.434).

Figura 1. Número de secuencias por el número de OTUs para cada muestra oral de Gopherus flavomarginatus sin rarificar. M = Macho, H = hembra. 

Se registraron 34 phyla, de los cuales Proteobacteria ( = 59%), Actinobacteria ( = 15%), Firmicutes ( = 10%) y Bacteroidetes ( = 7%) fueron los más abundantes (fig. 2). Se determinaron 98 clases, entre las que Gammaproteobacteria ( = 43%), Alphaproteobacteria ( = 11%), Bacilli ( = 8%) y Flavobacteria ( = 5%) mostraron los porcentajes más altos (fig. 3). Se obtuvieron 175 órdenes de los cuales Pasteurellales fue el más abundante ( = 30%), seguido por Pseudomonadales ( = 11%) y Micrococcales ( = 10%) (fig. 4). De las 434 familias registradas predominaron Pasteurellaceae ( = 30%), Moraxellaceae ( = 11%), Micrococcaceae ( = 9%) y Rhodobacteraceae ( = 8%) (fig. 5). Se reportaron 1,387 géneros y los más abundantes fueron Chelonobacter ( = 30%), Acinetobacter ( = 11%) y Paracoccus ( = 7%). El mapa de calor de los géneros cuya abundancia relativa fue mayor a 0.01% se muestra en la figura 6. El género Mycoplasma_g13 se determinó en 3 individuos (2 machos y 1 hembra) con una abundancia relativa de 9.82E-06, 7.17E-05 y 3.34E-05, respectivamente. Se contabilizaron 1,527 especies, de las cuales 235 se encuentran identificadas en esta base de datos taxonómica. La especie Pasteurella testudinis se determinó en 5 individuos (2 machos y 3 hembras) con las siguientes abundancias relativas: 3.92E-05, 1.53E-05, 1.52E-05, 3.94E-05 y 6.61E-06. Los géneros que se registraron como microbiota núcleo se muestran en la tabla 2.

Figura 2. Abundancia relativa (%) individual y promedio de los principales phyla de bacterias orales de Gopherus flavomarginatus. M = Macho, H = hembra. 

Figura 3. Abundancia relativa (%) individual y promedio de las principales clases de bacterias orales de Gopherus flavomarginatus. M = Macho, H = hembra. 

Figura 4. Abundancia relativa (%) individual y promedio de los principales órdenes de bacterias orales de Gopherus flavomarginatus. M = Macho, H = hembra. 

Figura 5. Abundancia relativa (%) individual y promedio de las principales familias de bacterias orales de Gopherus flavomarginatus. M = Macho, H = hembra. 

Figura 6. Mapa de calor de los géneros bacterianos orales de Gopherus flavomarginatus, cuya abundancia relativa fue mayor a 0.01%. M = Macho, H = hembra. 

Tabla 2 Géneros de bacterias orales que conformaron la microbiota núcleo de Gopherus flavomarginatus

Géneros
Acinetobacter Kytococcus
Arthrobacter Massilia
Bacillus Methylobacterium
Bergeyella Microcoleus
Blastococcus Microvirga
Brachybacterium Modestobacter
Brevundimonas Nesterenkonia
Cellulosilyticum Novihesbarpirillum
Chelonobacter Paracoccus
Clostridium Phenylobacterium
Corynebacterium Pseudarthrobacter
Cryobacterium Pseudomonas
Chryseobacterium Pseudonocardia
Deinococcus Rubellimicrobium
Diaphorobacter Rubrobacter
Enterococcus Rothia
Facklamia Skermanella
Geodermatophilus Sphingomonas
Glutamicibacter Staphylococcus
Halomonas Streptococcus
Janibacter Streptomyces
Kineococcus Terrisporobacter
Kocuria Testudinibacter

Con base en los resultados obtenidos, se determinaron 44 géneros y/o especies de bacterias que, según la literatura disponible, han causado enfermedades orales, nasales, oculares o respiratorias en tortugas (tabla 3).

Tabla 3 Prevalencia (%) de géneros y especies potencialmente patógenas registradas en la cavidad oral de Gopherus flavomarginatus según la literatura disponible (ver citas en Materiales y métodos). 

Géneros y especies (%) Gram Géneros y especies (%) Gram
Acinetobacter 100 - Micrococcus 90 +
Acinetobacter indicus 10 - Moraxella 10 -
Achromobacter 60 - Morganella 30 -
Aerococcus 80 + Morganella morganii 30 -
Aeromonas 30 - Mycobacterium 100 +
Alcaligenes faecalis 10 - Mycoplasma 30 -
Bacillus 100 + Neisseria 100 -
Bacteroides 100 - Neisseria elongata 60 -
Campylobacter 40 - Neisseria wadsworthii 30 -
Campylobacter fetus 10 - Pasteurella testudinis 50 -
Chelonobacter 100 - Peptostreptococcus 10 +
Citrobacter 100 - Prevotella 60 -
Clostridium 100 + Pseudomonas 100 -
Corynebacterium 100 + Rhodococcus 50 +
Enterobacter 80 - Salmonella 80 -
Enterococcus 100 + Salmonella enterica 80 -
Escherichia 80 - Serratia 30 -
Flavobacterium 70 - Staphylococcus 100 +
Fusobacterium 80 - Staphylococcus aureus 90 +
Klebsiella 40 - Streptococcus 100 +
Klebsiella pneumoniae 10 - Streptococcus gallolyticus 10 +
Klebsiella quasipneumoniae 10 - Vibrio 50 -

Discusión

Los phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes representaron en conjunto del 86% al 91% de las bacterias orales de G. flavomarginatus; el mismo patrón lo reporta Weitzman (2017), quien registró que estos 4 phyla conforman del 84% al 94% de la microbiota oronasal de G. agassizii, G. morafkai, G. berlandieri y G. polyphemus. La clase Gammaproteobacteria fue la más abundante para G. flavomarginatus ( = 42.5%) situación similar observada por Weitzman (2017) en G. agassizii, G. morafkai y G. polyphemus con más del 25% de los OTUs pertenecientes a esta clase. El género bacteriano más abundante en las muestras de G. flavomarginatus fue Chelonobacter ( = 29.5%), perteneciente al phylum Proteobacteria. Se trata de una bacteria que anteriormente se consideraba una cepa de Pasteurella testudinis; sin embargo al analizar su genoma se clasificó como un género distinto (Gregersen et al., 2009). Al respecto, Weitzman (2017) registró gran abundancia del género Chelonobacter en muestras del tracto respiratorio superior de G. agassizii, G. morafkai, G. berlandieri y G. polyphemus (> 98% de las secuencias bacterianas por muestra) utilizando pirosecuenciación 454 y la base de datos taxonómica de Greengenes (McDonald et al., 2012). En el presente estudio, se utilizó la base taxonómica EzBioCloud, la cual se encuentra actualizada al 2017 y cuenta con un alto nivel de curación, lo cual proporciona una mejor clasificación a nivel de género, especie y subespecie (Yoon et al. 2017). Aunque no se determinó la especie de Chelonobacter presente en G. flavomarginatus, Gregersen et al. (2009) mencionan que este género presenta baja diversidad genética, lo cual indica que puede estar conformado por una sola especie a la que denominaron Chelonobacter oris. Esta especie ha sido reportada en las coanas de tortugas Testudo hermanni causando infección respiratoria (Kudirkiene et al., 2014).

La prevalencia de P. testudinis en las muestras de G. flavomarginatus fue de 50%, similar al reportado en G. agassizii de 62% (Christopher et al., 2003). Por su parte, Weitzman (com. pers.) observó a P. testudinis en 50-92% de las muestras de G. agassizii, G. morafkai, G. berlandieri y G. polyphemus y argumenta que se trata de una especie de bacteria común, abundante y diversa en tortugas Gopherus. Sin embargo, ésta es una bacteria que en conjunto con el herpesvirus 2 se han reportado como causantes de enfermedades respiratorias en tortugas (Dickinson et al., 2001; Jacobson et al., 1995, 2012; Snipes y Biberstein, 1982; Snipes et al., 1980).

El género Acinetobacter fue el segundo más abundante en cavidad oral de G. flavomarginatus; pertenece al phylum Proteobacteria y es un habitante natural de tierra y agua que puede colonizar diversos sitios corporales y sobrevivir a la desecación ambiental durante semanas (Munoz-Price y Weinstein, 2008). Es un género que provoca infecciones oportunistas en animales y fue reportado previamente en estudios de salud del tracto respiratorio de tortugas (McArthur et al., 2004). La presencia del género Bergeyella en G. flavomarginatus es el primer reporte en cavidad oral de un reptil. La única especie de este género es B. zoohelcum, que previamente solo ha sido reportada como parte de la flora oral de caninos y felinos, además de ser una bacteria zoonótica de gran importancia médica por su infección tras la mordida de este tipo de animales (Shukla et al., 2004). Del phylum Firmicutes se encontraron con relativa abundancia los géneros Enterococcus y Staphylococcus. Enterococcus es habitante del suelo, agua, plantas y es parte de la normal de la flora intestinal de animales, sin embargo, puede actuar como patógeno cuando se encuentra en otras partes del cuerpo (Devriese et al., 2006). Innis et al. (2014), reportaron bacteremia, septicemia y osteomielitis necrosante en tortugas marinas Lepidochelys kempii con letargia y anorexia, de las cuales aislaron especies de Enterococcus a partir de sangre, hueso, tracto respiratorio y lesiones cutáneas. Por su parte, Staphylococcus ha sido reportado en cavidades nasales de G. agassizii y G. morafkai (Dickinson et al., 2001; Ordorica et al., 2008) y en la conjuntiva de varias especies de los géneros Testudo y Trachemys tanto en individuos sanos como en aquellos con conjuntivitis (Di Ianni et al., 2015). Otros géneros bacterianos registrados en la cavidad oral de G. flavomarginatus en el presente estudio han sido mencionadas como patógenos oportunistas en tortugas G. agassizii y G. polyphemus (Dickinson et al., 2001; McLaughlin et al., 2000; Ordorica et al., 2008), como Pseudomonas, Salmonella, Citrobacter, Corynebacterium, Klebsiella, Flavobacterium, Strepto-coccus y Campylobacter.

La posible relación entre Mycoplasma agassizii y M. testudineum con la enfermedad respiratoria superior en G. agassizii y G. polyphemus ha sido reportada en varios estudios (Jacobson y Berry, 2012; Jacobson et al., 2014). Sin embargo, investigaciones recientes indican que no necesariamente estas bacterias podrían ser las únicas causantes de esta enfermedad, incluso, se postula que pueden presentarse signos de la enfermedad sin la presencia de Mycoplasma spp. (Weitzman et al., 2017). En el presente estudio se determinó la presencia de Mycoplasma_g13 en G. flavomarginatus, que según la base de datos EzBioCloud, su secuencia de ADN es similar a la de 7 especies de Mycoplasma, entre ellas testudineum; sin embargo, es necesario realizar pruebas de PCR específicas para determinar la especie de Mycoplasma que porta esta especie de tortuga. Su prevalencia en individuos sanos de G. flavomarginatus fue de 30%, lo cual coindice con Weitzman et al. (2017) al indicar que las tortugas pueden ser portadoras de esta bacteria aunque no muestren signos visibles de enfermedad.

En general, la infección por un patógeno depende de sus interacciones con otros microorganismos infectivos, de la comunidad microbiana en que se encuentre y del sistema inmune del hospedero (Maslo et al., 2017; Rizzetto et al., 2013; Weitzman, 2017). Con relación a este último factor, Lederle et al. (1997) y Peterson (1994) han propuesto que para G. agassizii los estresantes más importantes son la sequía, el aumento de temperatura ambiental y la falta de alimento, lo cual puede desencadenar estrés fisiológico que disminuye la resistencia a las infecciones en estas tortugas. Algunos estudios de larga duración realizados en G. morafkai y G. agassizii (1987-2008 y 1991-2012, respectivamente) han demostrado que la sequía ejerce impactos negativos en la cobertura vegetal, lo cual reduce la disponibilidad de alimento, y por ende, la sobrevivencia de las poblaciones de tortugas (Lovich et al., 2014; Medica et al., 2012). De hecho, el modelaje de un escenario de cambio climático con un incremento de 2 °C y una disminución de 5 mm de precipitación sugiere que algunos sitios donde actualmente se localiza G. agassizii serán inhabitables para esta especie (Barrows, 2011; Loarie et al., 2009; Lovich et al., 2014). Para G. flavomarginatus también se ha establecido que la precipitación se relaciona directamente con la disponibilidad de alimento (Aguirre et al., 1979). Al respecto, Becerra-López et al. (2017) llevaron a cabo un estudio en que muestran que la abundancia del alimento principal de esta tortuga (Hilaria mutica) se ha perdido en un 63.7% en la Reserva de la Biosfera Mapimí en un periodo de 30 años, debido principalmente al cambio climático, el manejo ganadero y la agricultura. Otro aspecto que podría influir de manera negativa en la resistencia del sistema inmune de G. flavomarginatus es la baja diversidad genética que se ha detectado en individuos del Bolsón de Mapimí (Ureña-Aranda y Espinosa-de los Monteros, 2012), ya que la endogamia favorece la susceptibilidad a los patógenos (Smallbone et al., 2016).

Los análisis bacteriológicos como los que se llevaron a cabo en el presente estudio, deberían formar parte de cualquier programa de conservación y monitoreo en poblaciones animales vulnerables, ya que estas referencias pueden ser utilizadas a corto plazo en la implementación de estrategias de manejo epidemiológicas, como las que menciona Boarman (2002): el aislamiento de individuos o poblaciones enfermas de las no enfermas, el tratamiento veterinario de individuos con signos de infecciones, la inmunización de individuos sanos y el mejoramiento en la calidad del hábitat para elevar la respuesta inmunitaria de la especie de tortuga en cuestión. Asimismo, McCoy et al. (2007) y Perez-Heydrich et al. (2011) proponen la implementación de programas educativos que informen a la población sobre los riesgos infecciosos que pueden ser provocados por la liberación no autorizada de tortugas que estuvieron en cautiverio hacia los hábitats de vida libre. Por lo tanto, es importante que las estrategias de manejo y conservación de G. flavomarginatus sean dinámicas y se vayan adaptando a las distintas situaciones climáticas, antropogénicas y epidemiológicas que se presenten en su área de distribución, con el fin de asegurar la conservación de esta especie de tortuga a largo plazo.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por el Fondo Sectorial de Investigación para la Educación SEP-Conacyt Ciencia Básica (220658). Se agradece a Estefanía Garduño-Niño, Magdalena Rivas-García, Romario Martínez-Saldívar, Jesús Martínez-Luna, Ricardo Zapata-Ramírez, Irene Pacheco-Torres, Nohemí Villa-Vázquez y Sergio Barraza-Guerrero, por su ayuda en el trabajo de campo. A Cristino Villarreal-Wislar y al personal de la Administración de la Reserva de la Biosfera Mapimí por el apoyo logístico durante la realización del presente estudio. A Cameron W. Barrows (Universidad de California, Riverside) por la revisión del Abstract.

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Recibido: 25 de Abril de 2018; Aprobado: 17 de Agosto de 2018

*Autor para correspondencia: cristina.g.delapena@gmail.com (C. García-De la Peña)

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