Artículos de investigación

 

Protocolo para la extracción de ADN metagenómico bacteriano del langostino Macrobrachium carcinus L

 

Protocol for extraction of bacterial metagenome DNA to prawn Macrobrachium carcinus L

 

J. Ulises González-de la Cruz¹, H. Delfín-González², Ma. C. de la Cruz-Leyva¹; R. A Rojas-Herrera³, M. Zamudio-Maya^3*

 

¹ División Académica Multidisciplinaria de los Ríos (DAMR), Universidad Juárez Autónoma de Tabasco (UJAT). Km 1 de la carretera Tenosique-Estapilla. Tenosique Tabasco, México. jose.gonzalez@damr.ujat.mx

² Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuaria, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. UADY. Km. 15.5 Carretera Mérida-Xmatkuil, AP 4-116, Mérida Yucatán, México. gdelfin@uady.mx

³ Campus de Ciencias Exactas e Ingenierías, Facultad de Ingeniería Química.Universidad Autónoma de Yucatán (UADY). Periférico Norte Kilómetro 33.5,Tablaje Catastral 13615, Col. Chuburna de Hidalgo Inn, C.P. 97203. MéridaYucatán, México. Te.: 52(999) 946-0956; Fax. 52(999) 946-0994. * E-mail márcela. zamudio@uady.mx

* Corresponding author

 

Submitted December 17, 2010
Accepted January 31, 2011
Revised received June 08, 2011

 

Resumen

En este trabajo se adecuó un protocolo para la extracción de ADN metagenómico (ADNmg) bacteriano del sistema digestivo (intestino, estómago y hepatopáncreas) del langostino Macrobrachium carcinus L., tomando como referencia la metodología de extracción de ADN bacteriano de suelos y sedimentos (Rojas-Herrera et al., 2008). Esta metodología constaba de lisis enzimática, física, mecánica y química; después de una serie de ensayos se suprimió la lisis enzimática. Sin embargo, el éxito de la extracción del ADNmg fue influenciado principalmente por la preparación de las muestras analizadas; en particular el hepatopáncreas donde fue necesario eliminar la grasa mediante choques térmicos de temperaturas y separación de las fases mediante centrifugación con la muestra congelada. La eficacia del ADN aislado fue verificada mediante la fragmentación por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), después de la amplificación con iniciadores universales. En general, se tuvo una baja diversidad (19 filotipos) entre los diferentes órganos analizados de 13.5±1 (intestinos) a 11.7±0.96 (estómagos). Los índices de Shannon-Weaver (2.45), Simpsons (10.88) y equidad (0.972) obtenidos de la digitalización de la imagen del gel, proponen que los filotipos que conforman la microflora del sistema digestivo de M. carcinus, se distribuyen irregularmente entre los diferentes órganos analizados.

Palabras claves: M. carcinus, ADN metagenómico, diversidad bacteriana, DGGE.

 

Abstract

In this work we adapted a protocol for the extraction of metagenomic DNA (ADNmg) bacteria in the digestive system (intestines, stomach and hepatopáncreas) of Macrobrachium carcinus L., with reference to the method of extracting bacterial DNA from soils and sediments (Rojas-Herrera et al., 2008). This methodology consisted of enzymatic, physics, mechanics and chemistry after a series of tests was abolished enzymatic lysis. However, the success ADNmg extraction was influenced mainly by the preparation of the samples, in particular the hepatopáncreas, where it was necessary to remove the fat by thermal shock temperature and phase separation by centrifugation with the sample frozen. The effectiveness of isolated DNA fragmentation was verified by gel electrophoresis in denaturing gradient (DGGE) after amplification with universal primers. In general, it had a low diversity (19 phylotypes) between the different organs analyzed of 13.5 ± 1 (intestines) to 11.7 ± 0.96 (stomach). The Shannon-Weaver index (2.45), Simpsons (10.88) and equity (0972) obtained from the digitization of the image of the gel, suggested that the phylotypes that form the gut microflora M. carcinus, is distributed unevenly between the different organs analyzed.

Keywords: M. carcinus, metagenomic DNA, bacterial diversity, DGGE.

 

INTRODUCCIÓN

Los métodos moleculares de huellas genéticas (T-RFLP, RAPD, DGGE) emergieron como una herramienta biotecnológica, que revolucionó el estudio de la diversidad microbiana en las muestras ambientales (Boon et al, 2002; Lyautey et al, 2005; Mclntosh et al., 2008) y alimentarias (Ampe et al., 1999; Ercolini, 2004). Sin embargo, el protocolo de aislamiento del ácido nucleico es uno de los puntos críticos en este tipo de investigaciones (Tang et al., 2009; Zhou et al., 1996), debido a la heterogeneidad de las muestras (Giacomazzi et al., 2005; Somerville etal, 1989).

Para eliminar estas interferencias se recurre frecuentemente al uso de kits comerciales para la extracción de ADN de cultivo celulares (Brunvold et al, 2007; Schulze et al, 2006), rotíferos (Dooms et al., 2007) y sedimentos (Bouchon et al., 1998; Goarant etal., 1999).

En crustáceos también se han utilizado kits comerciales basados en lisis celular y precipitación del ADN (Li et al., 2007; Papaspyrou et al., 2005), para estudiar las comunidad bacteriana asociada en su habitad (Durand et al., 2009; Kutako et al., 2007; Payne et al., 2007). No obstante, se ha reportado que el uso de estos kits puede sesgar los resultados (Carrigg et al, 2007; Kozdroj y Van Elsas, 2000; Lipthayeía/,,2004).

Esto ha llevado como se mencionó anteriormente a la necesidad de adecuar y/o diseñar técnicas de extracción de ADN que aseguren el éxito de la PCR y posterior estudios, considerando las características de las muestra (Burke et al, 2009; Somerville et al, 1989), como la de los ambientes desérticos (Bonilla-Rosso et al, 2010), lagos eutróficos (Tang et al, 2009), sedimentos con hidrocarburos (Maciel et al, 2009) y camarones (Papaspyrou et al, 2005).

El langostino de agua dulce o piguaM. carcinus es una especie nativa del atlántico y se distribuye desde la Florida hasta Brasil, pasando por América central y las Antillas (Chace y Hobbs, 1969). En México habita en los ríos caudalosos del estado de Tabasco, donde se captura por pesquería artesanal sobreexplotada, debido a su elevado valor comercial. Sin embargo, los estudios realizados en langostinos no reportan datos sobre la existencia de un protocolo de extracción de ADN bacteriano del sistema digestivo de M. carcinus. El conocimiento de la comunidad bacteriana en este langostino podría apoyar en el establecimiento de programas de sanidad, adecuados en la detección de agentes patógenos que frecuentemente provocan enfermedades o muerte al organismo en el habitat. Generará información de apoyo para los estudios de identificación de cepas benéficas con efecto probiótico; ambos panoramas lograrían aprovecharse en esquemas de cultivo en cautiverio.

Por lo cual, en el presente trabajo se dio a la tarea de adecuar un protocolo de extracción de ADNmg que permita el estudio de la comunidad bacteriana presente en el intestino, estómago y hepatopáncreas de M carcinus, utilizando PCR-DGGE.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección y preparación de la muestra

Se recolectaron un total de 58 muestras de langostinos de ambos sexos M. carcinus L (Figura 1) (NOM-109-SSA1-1994) durante la temporada 2008-2009 en el río Usumacinta, localizado en el municipio de Tenosique de Pino Suárez Tabasco al sur de México, entre los paralelos 17°28.5' de latitud norte y los 91°25.6' de latitud oeste. Las muestras previamente empaquetadas en bolsas de polietileno y congeladas fueron transportadas al laboratorio donde se extrajo el tracto digestivo. Los órganos debidamente identificados como intestino (Hint ó Mint), estómago (HEst ó MEst) y hepatopáncreas HHep ó MHep) se almacenaron en condiciones estériles en solución salina al 2% a -20° C, hasta su uso. La letra H ó M que precede estas siglas corresponden al sexo hembra o macho del organismo muestreado.

 

Preparación de la muestra

Las muestras de intestino (0.3-0.1 g según el tamaño del langostino), estómago (1 g) y hepatopáncreas (1 g) se resuspendieron en 1 mi de amortiguador TEN (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA pH 8.0). En el caso del hepatopáncreas fue necesario eliminar los altos contenidos de grasa: 1 g de muestra se macero y agitó vigorosamente, se incubó a 65° C por 10 min y se centrifugó a 10,000 xg por 10 min a 40° C; se en fría a -10° C por 10 min. Nuevamente, se centrifugó a 10,000 xg por 10 min a 4º C. Al final se formaron 3 faces, una solida con alto contenido de grasa en la parte superior, una líquida y la pastilla; se recuperó lml de la fase acuosa inferior y la pastilla para la extracción del ADNmg.

 

Extracción de ADN

El aislamiento del ADNmg bacteriano del sistema digestivo (intestino, estómago y hepatopáncreas) de M. carcinus, se obtuvo con el protocolo de Rojas-Herrera et al. (2008) eliminando la etapa de lisis enzimática del proceso de extracción.

Las muestras se sometieron a un choque térmico a -10° C por 15 min y 5 min a 65° C (se repitió tres veces). Posteriormente, se adicionó lml de SDS al 20% (p/v), se incubó 30 min a 30° C y se centrifugó a 10 000 xg 20 min a 30° C. Se adicionó 500 ul de acetato de potasio 5 M y se incubó a 65° C por 5 min y 15 min en baño de hielo-alcohol a -10° C. Se centrifugó a 16 000 xg por 30 min a 4º C. Al sobrenadante se agregó 200 ul de oxido de silicio (SiO₂) y se centrifugó a 16000 xg por 3 min a 25° C. La pastilla se lavó dos veces con 1 mi de etanol al 70% (v/v), se centrifugando cada vez con las condiciones antes citadas. Se adicionó 50 ul de agua destilada estéril a la pastilla, se resuspendió por incubación en un baño a 55° C por 5 min y se centrifugó a 16000 xg, 5 min. El ADN extraído se conservó a -20° C para análisis posteriores.

La verificación del ADN se realizó en gel de agarosa al 1% (p/v) teñido con bromuro de etidio (0.3 ug/ml); se inyecto en el pozo del gel, la muestra de ADN junto con solución acarreadora en relación 1:1. Se utilizó un marcador molecular {Lambda Him III Lacier) de referencia. La electroforesis se corrió con amortiguador TAE (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA pH 8.0) por 3 h a 60 V. El gel se observó en un transiluminador UV y la imagen se almacenó en un equipo foto-documentador (Gel Doc XR system (BioRad), utilizando el programa Quantity One (BioRad imaging systems).

 

Amplificación del ADN

Se amplificó la región V3 del gen ARNr 16S utilizando los iniciadores gc338f (5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') (Lane, 1991) y 518r (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'). La secuencia subrayada en el iniciador gc338f corresponde a la grapa GC (Muyzer et al., 1993).

La mezcla de reacción contenía: 100 ng de ADN de la muestra, 2.5 ul de amortiguador (NH4) IX, 0.2 mM de la mezcla de dNTPs (Invitrogen, Carlsbad Ca.), 0.2 mM de cada iniciador, 4 mM de MgCl₂ (Promega), 0.1% de albúmina de suero bovina (BSA) y 1U de Taq polimerasa DNA (Invitrogen™).

La amplificación térmica de PCR inició con la desnaturalización a 94° C por 5 min (1 ciclo), un "Touchdown" utilizando 10° C por encima de la temperatura de alineación (65° C) esta temperatura fue decreciendo Iº C por minuto hasta llegar a 55° C y de ahí, se aumentó a 72° C por un minuto (10 ciclos). Nuevamente, se desnaturalizó a 94° C por 1 min, se alineó a 55° C por 1 min, la extensión se sintetizó a 72° C por 1 min (20 ciclos) y una extensión final a esta temperatura por 10 min.

La verificación de los amplicones se realizó en gel de agarosa al 1.5% (p/v) siguiendo las condiciones antes descritas a excepción del amortiguador de corrida de la electroforesis, ya que en este caso se utilizó Tris borato-EDTA (TBE) 0.5 X.

 

DGGE

La separación de los amplicones se llevó a cabo por DGGE en un equipo Dcode™ Universal Mutation Detection System (BioRad), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los amplicones de 200 pb se separaron en un gel de poliacrilamida al 8% (p/v) con un gradiente desnaturalizante de 30 a 60% de urea-formamida (100% corresponde a 7 M urea y un 40% de formamida (v/v). El volumen de carga fue 100 ul de amplicón a 1000 ng en una relación 1:1 (producto de PCR: amortiguador de carga). La electroforesis se corrió en amortiguador TAE IX a 60 V por 22 h a 60° C (Muyzer et al, 1993).

El gel se tiñó en solución de SYBR GOLD (Invitrogen™, Eugene Oregon USA) 0.5X (5 ul/100 mi de amortiguador TAE IX) por 45 min y se observaron en un transiluminador UV. La imagen se almacenó en un foto-documentador Gel Doc XR system (BioRad), utilizando el programa antes mencionado.

Se cortaron las bandas únicas de los patrones de bandeo resultantes, mismas que se eluyeron en agua estéril bidestilada por 24 h a 4º C. El ADN eluído se reamplificó por PCR bajo las condiciones mencionadas anteriormente, a excepción de que el BSA se excluye y se baja la concentración del MgC1₂ a 2.5 mM.

 

Digitalización de la imagen del DGGE

Utilizando el programa Quantity One (BioRad imaging systems) se realizó el análisis de la imagen, para detectar la intensidad relativa de los perfiles de bandeo generados y así, conseguir la curva densitométrica en base a la intensidad relativa del área de los picos de las bandas. Con la presencia (1) o ausencia (0) de la banda a través de los patrones de bandeos se generó una matriz binaria para obtener un dendograma de similitud, utilizando el método Euclidiano del vecino más cercano de las muestras analizadas con el programa estadístico computacional Statgraphics Plus 3.0.

Con los valores arrojados de las intensidades relativas del pico de las bandas a través de los perfiles de bandeo de DGGE, se determinaron los índices de diversidad de especies, índice de Shannon-Weaver, Simpson y homogeneidad (Magurran, 1998) basados en la taxonomía numérica (Sokal y Siseath, 1963), utilizando el programa Species Diversity & Richness 3.02© (PISCES Conservation Ltd 2002, IRC House, Pebandasnnington, Lymington, S041 8GN, UK. (www.pisces.conservation.com/).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La ausencia de protocolos de extracción de ADN metagenómico (ADNmg) bacteriano estandarizados según las características físicas (estructura de la pared celular), químicas y biológicas (adherencia de los microorganismo) de las muestras alimentaria (Giacomazzi et al., 2005) y ambientales, limita el conocimiento de la diversidad microbiana (Tang et al., 2009; Zhou et al., 1996).

Lo cual se comprobó en este trabajo, donde utilizando la metodología de extracción de ADN bacteriano de suelos y sedimentos, únicamente se aisló fragmentaciones de ADN degradado a partir del intestino y estómago del langostino M. carcinus (datos no mostrados). En el caso del hepatopáncreas no se obtuvieron resultados; lo anterior puede inferir la presencia de posibles inhibidores en las muestras analizadas y que podría restringir la recuperación del ADN (Rojas-Herrera et al, 2008).

En los órganos del sistema digestivos de langostino (M. rosenbergii) se encuentran sales de sodio, cloro, calcio, carbohidratos complejos, ácidos biliares y grasos (Ahearn, 1978). Tratar previamente las muestras forma parte de la adaptación de distintos métodos de extracción, ya que facilita la extracción del ADN (Bouchon et al., 1998; Maciel et al., 2009). Por lo que, en esta investigación se plantearon dos modificaciones primordiales a la metodología utilizada.

La primera, en la preparación de las muestras donde no se dieron lavados (la metodología original sugiere tres lavados), únicamente se resuspendieron las muestras de intestino y estómago antes de la extracción. Sin embargo, en el hepatopáncreas que contiene una gran cantidad de triglicéridos y fosfolípidos (Muriana et al., 1993) fue necesario una maceración vigorosa para relajar los ácidos grasos, seguido de una incubación (65° C por 10 min) y una centrifugación (10,000 xg por 10 min a 40° C); con el propósito de romper y separar estas cadenas saturadas. La muestra se congeló (-10° C por 10 min) y se centrifugó (10,000 xg por 10 min a 4º C). Al final, se obtuvo una fase grasa, acuosa y pastilla recuperando estas dos últimas, para la posterior extracción del ADN metagenómico.

La segunda modificación fue directamente en el proceso de extracción, al suprimir la lisis enzimática, pues el sistema digestivo contiene naturalmente una importante carga de enzimas Meas que apoyan en el proceso digestivo (Sriket et al., 2010).

A sí que, con el protocolo modificado se logró la extracción de ADNmg de alto peso molecular del sistema digestivo de langostinos de agua dulce M. carcinus hembras y machos; después del tratamiento al que fueron sometidas las muestras y a la exclusión de la lisis enzimática en el proceso de aislamiento (Figura 2a).

Los ADNmg extraídos registraron una concentración de 0.87, 0.81 y 0.68 mg/g de estómago, hepatopáncreas e intestino respectivamente. Se considera que los resultados de absorbancia se encontraron entre el rango de calidad confiable de 0.1 a 1.0 (Glasel, 1995), no siendo necesario realizar una purificación previa a la amplificación del gen ARNr 16S por PCR (Figura 2b).

 

PCR-DGGE e índices de diversidad.

La eficacia del protocolo propuesto para el estudio de la flora bacteriana del sistema digestivo de langostino se corroboró por DGGE al detectar un perfil de 19 bandas o filotipos (Figura 3).

El dendograma de vecino más cercano agrupó los patrones de bandeo obtenidos en tres ciados hermanos interrelacionados, registrando una distancia euclidiana máxima de 1,6.

El clado 2 (Grup 2) concentro el 58.3 % de las muestras que exhibieron menor número de bandas (2 a 4 filotipos): H2Int, HIEst, H2Est, MIEst, MlHep, M2Hep, Mllnt. Por otro lado, el primer {Grup 1: HlHep, Hllnt, M2Est) y tercer ciado (Grup 3: M2Int, H2Hep), agrupo las muestras que registraron el mayor numero de filotipos (6 a 9 bandas), que representan la comunidad bacteriana en la muestra analizada.

Las diferencias observadas respecto a la presencia/ausencia de bandas entre los perfiles de bandeo, pueden deberse a presiones ambientales o de diferencias fisiológicas de los individuos y composición de la matriz analizada; lo cual, influye en la microflora (Gamboa-Delgado et al., 2003; Kevin y Fred, 1997; Little y Ebert, 2000; Mathew et al, 2010; Sarathi et al., 2007).

Por ejemplo, en peces se ha mencionado que la mayor diversidad y riqueza de especies bacterianas se encuentran en el intestino (Chace y Hobbs, 1969; Dalí, 1967). En este estudio no se tuvo este patrón, pues en el intestino de langostino se registró variabilidad: muestras con mayores (Hllnt, M2Int) y menores filotipos (H2Int, Mllnt).

Tubiash et al. (1975) mencionaron que en la hemolinfa de los cangrejos machos existe una población bacteriana mayor que en las hembras. En este estudio no se presentó este comportamiento.

Hay una diversidad de factores que pueden influir en la composición microbiana; la disponibilidad de nutrientes en el medio y las enzimas extracelulares secretadas por las propias bacterias, juegan un papel importante en la asimilación de nutrientes en el sistema digestivo de los hospederos, lo cual influye en la modificación de la microflora original (Venkat et al., 2004).

Lo anterior podría justificar la escasa presencia de filotipos en las muestras de langostinos machos, independiente del órgano analizado (MIEst, MlHep, M2Hep, Mllnt).

Otros estudios han demostrado que existe una relación simbiótica con la flora bacteriana presente en los camarones, lo que sugiere que las hembras tienen necesidades nutricionales distintas, principalmente relacionadas con aspectos reproductivos y hormonales, que pueden influir en la comunidad bacteriana (Kevin y Fred, 1997; Little y Ebert, 2000).

En general, aunque los patrones de DGGE obtenidos de los órganos digestivos no exhibieron cambios notables tanto en el número como en la distribución de las bandas, el menor número de filotipos se encontró en las muestras de hepatopáncreas y se corroboró con los parámetros ecológicos estudiados.

La diversidad de los filotipos detectados se estimó con los valores de la intensidad de los picos de las bandas en los perfiles de bandeo. La diversidad beta (β) del sistema digestivo de la pigua registró un índice de Shannon-Weaver (H), Simpson (D) y equidad de 2.45, 10.88 y 0.972 respectivamente (Tabla 1).

Sin embargo, la diversidad alfa (α) infiere una mayor y menor riqueza de filotipos en intestino (13.5) y estómago (11.75). En todos los casos el intestino y hepatopáncreas fueron los que registraron los índices de H (2.54 y 2.41 respectivamente), D (12.10 y 10.58 respectivamente) y equidad más altos (0.976 y 0.973 respectivamente).

Los parámetro de diversidad analizados manifiestan que el estómago, es el órgano del sistema de la pigua menos abundante, menor distribuido y con la más baja diversidad.

De la Cruz-Leyva (2010) menciona que en ecología microbiana se ha investigado la diversidad bacteriana en diferentes ambientes (sedimentos marinos, lagunas, aguas residuales, costeras y subterráneas, ostras) y recursos pesqueros, comparando patrones de bandeo con técnicas de huellas genéticas (T-RFLP, RFLP, DGGE) para estimar la riqueza y composición de la comunidad (Boon et al, 2002; Cho y Kim, 2000; Danovaro et al, 2006; Villanueva et al, 2007; La Valley et al, 2009; Ramette, 2009). Sin embargo, los resultados generados de estas investigaciones presentan grandes discrepancias, por un lado, esto puede deberse a la estrategia metodológica utilizadas en el estudio (Anderson y Cairney, 2004) y por el otro, a la población que se estudia (bacterias). Las bacterias en general se adaptan y proliferan con tazas de crecimientos aceleradas e influenciadas con las condiciones ambientales expuestas. No obstante, lo más preocupante es la pericia (la detección y ajuste del contorno de la banda) y fundamentos (ecología poblacional) del investigador, que genera y describe estos resultados (de la Cruz-Leyva, 2010).

La adecuación del protocolo propuesto en esta investigación, resulto ser eficaz para la extracción de ADNmg bacteriano del sistema digestivo del langostino de agua dulce M. carcinus.

Teniendo en cuenta que los métodos de extracción no solo deben producir un ADN íntegro y de alto peso molecular, sino también contrarrestar los inhibidores de la PCR que aseguren el éxito del estudio de la comunidad bacteriana en la muestra de interés.

 

CONCLUSIONES

Los resultados demostraron la complejidad de la muestra del sistema digestivo de M. carcinus y comprobaron la efectividad de este protocolo para el aislamiento de ADNmg bacteriano, al detectar 19 filotipos durante el análisis del DGGE. Enfatizando la importancia que tiene el tratamiento de la muestra, para asegurar el éxito del protocolo de extracción. Por lo que se propone este protocolo en futuros estudios de la comunidad bacteriana asociada al sistema digestivo de este langostino.

 

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