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Introducción
Astaxantina (3, 3 ́-dihidroxi- β, β ́- caroteno- 4, 4 ́- diona) es una molécula compuesta de una cadena larga de 40 carbonos con doble ligaduras y dos grupos hidroxilo libres en sus anillos terminales.1 Astaxantina es uno de los antioxidantes más importantes2 ya que presenta varias ventajas con respecto a otros carotenoides, por ejemplo: mayor estabilidad, alto poder antioxidante (diez veces mayor que β-caroteno y 500 veces más que α-tocoferol), cruza fácilmente la barrera hematoencefálica y es un excelente pigmento.3
Debido a la estructura química (Figura 1), la astaxantina cruza la membrana lipídica de las células, protegiendo la superficie interna y externa de la oxidación.4,5 La astaxantina tiene una poderosa actividad antioxidante6 y ha sido evaluada eficientemente en modelos animales y humanos.7,8
Se han efectuado varios estudios en donde se analizan los beneficios de la astaxantina, entre los resultados más significativos se encuentra un efecto antimicrobiano en contra de Helicobacter pylori,9 dosis de 25 mg/kg protegió contra fármacos (naproxeno) que inducen úlcera gástrica en ratas,10 se evaluaron dosis de 3.6 mg diarios por dos semanas consecutivas, los resultados demostraron mantener los niveles óptimos de LDL y HDL en la sangre,11 2 mg/kg mejoró el metabolismo de glucosa y ayudó a prevenir la resistencia a insulina en ratas con una dieta rica en fructosa.12 Así también, presentó una importante actividad anticancerígena13 y redujo significativamente la presión sistólica en ratas hipertensas.1415 observaron que administrar 5 mg/kg/día de astaxantina durante 14 días redujo considerablemente lesiones hepatocelulares en ratas después de un daño isquémico. Por todo esto, la astaxantina se está utilizando como principio activo en productos nutracéuticos principalmente por vía oral para prevenir y ayudar a tratar enfermedades degenerativas, tales como cáncer, enfermedades de la piel y cardiacas.11,16
Las microalgas son una fuente importante de sustancias de alto valor agregado tales como ácidos grasos y carotenoides.18H. pluvialis es una microalga biflagelada unicelular perteneciente a la clase Chlorophyceae,19 cuando H. pluvialis es sometida a condiciones de estrés, como intensidades altas de luz,20 deficiencia de nutrientes,21altas concentraciones de sales,22 baja y alta temperaturas23 la microalga pierde la motilidad y cambia a una forma esférica. Después de 24 horas de estrés las células se enquistan, en esta etapa aumentan de tamaño y desarrollan una pared celular resistente.24H. pluvialis sobresale por su habilidad para sintetizar grandes cantidades de astaxantina, siendo una de las fuentes de producción más prometedora de este antioxidante,25 llegando a producir cerca del 4% de peso seco.2,26 Sin embargo, a pesar de ser una opción con gran potencial, todavía se requiere mejorar los parámetros de operación para optimizar los rendimientos, así como, bajar los costos de producción, con el propósito de hacer más competitiva esta fuente natural.27
Un factor técnico importante en este campo es el método de cuantificación utilizado. Aunque el método de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) es el método más exacto, tiene sus inconvenientes con respecto al tiempo implementado para efectuar los análisis.28 En contra posición, el método de espectrofotometría es un método rápido, sin embargo, carece de selectividad, ya que las absorbancias de compuestos similares tienden a traslaparse. Un método alternativo que elimina el problema de absorbancias traslapadaseslaespectrofotometría derivada.29 Este método se basa en una transformación matemática de los cruces en cero de los espectrogramas en espectros derivados, permitiendo una resolución rápida, sensible y precisa de múltiples componentes en una muestra.30) Liu et al, (2011) desarrollaron y validaron un método de espectrofotometría derivada. Determinaron cómo la clorofila y el beta caroteno interfieren en la cuantificación de astaxantina. Los parámetros de calidad calculados fueron exactitud, precisión y límite de detección. Para tener valores de referencia, y poder hacer la comparación estadística, también realizaron la cuantificación por HPLC. Los experimentos arrojaron resultados muy similares entre ambos métodos, por lo que se concluye que no existe diferencia significativa.28
Durante las últimos décadas se han estudiado varios factores estresantes y sus combinaciones en la síntesis de astaxantina utilizando Haematococcus pluvialis,31 se ha planteado que utilizar fotobiorreactores adecuadamente diseñados mejora los procesos de producción.32
Nguyen (2013), reportó un estudio comparativo de la producción de astaxantina natural obtenida a partir de microrganismos y astaxantina sintética obtenida por medio de procesos químicos, y en donde se incluyeron estudios relacionados con el mejoramiento en la acumulación de astaxantina por H. pluvialis (de 1991 a 2012), en éstos la mayor concentración de astaxantina fue de 357 mg/L y se obtuvo utilizando un fotobiorreactor de doble región.33
Por otra parte, Lababpour et al. (2004) analizaron 5 artículos y reportaron resultados de concentración de astaxantina en H. pluvialis a diferentes escalas de cultivo. Sin embargo, no se encontró una revisión sobre las condiciones de estrés óptimas en la producción de astaxantina a partir de H. pluvialis publicada hasta 2013.
El propósito de este estudio fue realizar una revisión bibliográfica de estudios que evaluaron diferentes factores de estrés y determinaron los mejores niveles de operación y rendimiento en la producción de astaxantina, publicados en las bases de datos de MEDLINE/Pub-Med, SciELO, y EBSCO, de 2003 a 2013.
Descripción de artículos
Se revisaron todos los artículos originales encontrados en inglés y español publicados en las bases de datos de MEDLINE/PubMed, SciELO y EBSCO de 2003 a 2013, de estudios sobre factores de estrés para optimizar la producción de astaxantina. Los criterios de inclusión fueron: Haematococcus pluvialis, optimización de producción de astaxantina y factores de estrés. Se realizó la búsqueda con las palabras clave: "Haematococcus pluvialis", "astaxantina", "producción de astaxantina", "astaxanthin", "astaxanthin production". En la búsqueda electrónica se encontraron 5120 artículos sobre H. pluvialis. Al aplicar los criterios de inclusión y el rango de fecha de publicación de 2003 a 2013, quedaron 30 artículos potenciales, de los cuales se analizó el resumen de cada uno y se eliminaron 15 que no cumplieron con los criterios de inclusión, por lo que quedaron 15 estudios para el análisis y evaluación en esta revisión.
En esta revisión bibliográfica se incluyeron 15 estudios. Se analizaron principalmente los factores de estrés medioambientales y bioquímicos que tuvieron un efecto en la producción de astaxantina por H. pluvialis. Estos estudios se realizaron en México,34España,38 China,42 Turquía49 y Hong Kong;50 uno en cada país; cuatro en Corea del Sur40,41,52,54 y seis artículos se desarrollaron en Japón.35,37,39,45,46,48 El factor más evaluado fue la intensidad de luz seguida por la modificación de los componentes del medio de cultivo. En tres artículos se propone un diseño específico de fotobiorreactor como principal factor.41,45,46 En un artículo se evaluó la fase del ciclo de vida más propicia para ser transferida a la etapa de inducción de astaxantina.52Katsuda et al., efectuaron una serie de investigaciones donde se evaluó el efecto de la longitud de onda (azul) utilizando lámparas LEDs.34,48 Hong et al. (2012), se enfocaron en obtener una cepa fotosensible y determinaron el efecto provocado por intensidades moderadas y altas.54 El método de cuantificación más utilizado es el de cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) acoplado a un detector de matriz de fotodiodos y una columna de fase reversa C18.34, 35,37,38,39,45,46,48,50,54 Sin embargo, también se usó espectrofotometría UV-visible.40,41,42,49,52 Los autores reportan el uso de curvas de calibración con estándares para el cálculo de las concentraciones de pigmentos. Enseguida se muestra una breve descripción de los estudios incluidos (Figura 2).
Katsuda et al. (2004),34 estudiaron el efecto de diferentes longitudes de onda, (625, 525, 470, 410, 380 nm) a diferentes intensidades de luz en el crecimiento celular y acumulación de astaxantina en H. pluvialis, la fuente de luz utilizada provino de lámparas de LEDs (diodos emisores de luz), estos tienen como característica una emisión espectral estrecha. Los resultados obtenidos demuestran que utilizar luz roja (625 nm) en el cultivo permitió aumentar la densidad celular, mientras que usar luz azul (380-470 nm) indujo un cambio morfológico en la célula y mejoró la acumulación de astaxantina. El método de cuantificación del pigmento fue por cromatografía líquida de alta eficiencia. El equipo utilizado fue un sistema LC-10Shimadzu equipado con una columna de fase reversa Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6 mm x 150 mm. La fase móvil fue metanol a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las lecturas de absorbancia se realizaron con un detector de matriz de fotodiodos (SPD-M10A, Shimadzu). Los autores realizaron una curva de calibración con estándares para la cuantificación de los pigmentos.
Domínguez-Bocanegra et al. (2004),35 realizaron un estudio para determinar el efecto de los siguientes factores medioambientales: intensidad de luz, aireación y nutrientes en el crecimiento celular y producción de astaxantina. El diseño experimental planteado se enfocó en realizar una serie de combinaciones de los factores, en donde la intensidad de luz se mantuvo constante (177 μmol fotón/m-2/s-1), una vez obtenidos los resultados se ejecutó el análisis de ANOVA y se procedió a determinar la mejor combinación. De acuerdo con el análisis de varianza se encontró un efecto significativo en los tres factores evaluados (p < 0.001) se realizó el análisis de comparación múltiple y se decidió trabajar con medio BAR a una nueva intensidad de 345 μmol fotón m-2 s-1 en los siguientes estudios para la evaluación de la producción de astaxantina. Con base en los resultados experimentales se concluyó que las condiciones óptimas para el crecimiento celular son: medio BBM a 28 °C con luz continua fluorescente blanca (177 μmol fotón/m2/s) y aireación continua (1.5 % CO2). Asimismo, la combinación de medio BAR suplementado con 1 g/L de acetato de sodio, iluminación continua (345 μmol fotón m-2 s-1) y aireación condujeron a la máxima producción de astaxantina. Para la cuantificación de astaxantina implementaron el método de Jian-Ping et al.36 El cual se requiere de un HPLC acoplado a un detector de matriz de fotodiodos, una fase móvil que consiste de metanol (69 %), acetonitrilo (11.5 %) y agua (2.5 %). La velocidad de flujo fue de 1 ml/min. Los autores no especifican el tipo de columna empleada. Se utilizó un estándar comercial de astaxantina marca Hoffmann-La Roche para la curva de calibración.
Lababpour et al.37 desarrollaron un estudio para determinar el efecto que presentan los siguientes factores: concentración de nutrientes, pH, método de adición de nutrientes e iluminación con luz roja y azul (LEDs): así como, el efecto de sus interacciones en la concentración y acumulación de astaxantina en H. pluvialis. Para la inducción de astaxantina, la concentración del medio de cultivo fue de medio 2x, pH de 6.8, intensidad de luz roja (8 μmol fotón/m2/s) para posteriormente cambiar a luz azul (12 μmol fotón/m2/s). Los resultados revelan que el cambio de longitud de onda afectó positivamente la acumulación de astaxantina alcanzando concentraciones de 76 μg/ml, valor mucho mayor que el reportado por Katsuda et al. que fue de 42 μg/mL. El método de cuantificación del pigmento fue por cromatografía liquida de alta eficiencia. El equipo utilizado fue un sistema LC-10 Shimadzu equipado con una columna de fase reversa Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6 mm x 150 mm. La fase móvil fue metanol a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las lecturas de absorbancia se efectuaron en 470 nm y 680 nm y se realizaron con un detector de matriz de fotodiodos (SPD-M10A, Shimadzu). Los autores realizaron una curva de calibración con estándares para la cuantificación de los pigmentos.
Orosa et al.38 llevaron a cabo un estudio para determinar las concentraciones óptimas de nitrato de sodio, acetato de sodio y malonato de sodio, con el propósito de mantener el crecimiento celular y maximizar la acumulación de astaxantina en H. pluvialis. De acuerdo con el diseño experimental se determinó que a concentraciones de 0.25, 0.5, 0.75 y 1.0 g/l de nitrato, la densidad celular aumentó en forma lineal, en concentraciones de 0.15 g/l se presentó una disminución en la proporción de clorofila a/carotenoides llegando a un valor de 1 en el día 15 del experimento, el cual es un buen indicador fisiológico de deficiencia de nitrato en la célula. Con respecto a acetato y malonato, concentraciones de 2% provocaron inhibición en la tasa de crecimiento celular. Sin embargo, una concentración de 0.25% causó un aumento en la tasa de crecimiento celular y acumulación de astaxantina por célula. Los resultados obtenidos revelan que concentraciones bajas de nitrato de sodio, acetato de sodio y malonato de sodio permiten mantener la tasa de crecimiento constante y a la vez promueven la síntesis de carotenoides.
La cuantificación de los carotenoides se realizó con un equipo de HPLC marca Hewlett Packard acoplado a un detector de matriz de fotodiodos y una columna de fase reversa Hypersil C18 25 x 4 mm. La fase móvil consistió en A (agua), B (metanol) y C (acetona). El gradiente se corrió de la siguiente manera: 0 min 9 % A, 76 % B, 15 % C; 9 min 5 % A, 45 % B, 50 % C; 15 min 4 % A, 38 % B, 58 % C; 17 min 3 % A, 27 % B, 70 % C; 22 min 3 % A, 27 % B, 70 % C; 25 min 100 % C; 26 min 100 % C, la velocidad del flujo fue de 1 ml/min. Las longitudes de onda programadas fueron 444 y 476 nm. Se utilizaron estándares de b-caroteno (Sigma) y astaxantina, cantaxantina y equinenona (F. Hoffman. La Roche Ltd.) para la curva de calibración.
Lababpour et al. (2005)39 realizaron un estudio para evaluar el efecto del método de alimentación (fed-batch) e iluminación con luz azul (LEDs) en la producción de astaxantina en H. pluvialis. La adición de nutrientes por el método fed-batch mantuvo la actividad fisiológica de las células y el cambio de luz de roja a azul aceleró la acumulación de astaxantina. Por otra parte valores de pH superiores a 9.5 suprimen la síntesis de carotenoides. Se comparó el resultado con un estudio realizado previamente donde se utilizó el método de reemplazo de medio y el rendimiento obtenido es superior al reportado, por lo que se concluye que el método de alimentación fed-batch, luz azul y no ajuste de pH son parámetros efectivos para la producción de astaxantina en fotobiorreactores. La concentración de astaxantina se cuantificó por medio de un sistema HPLC (LC-10; Shimadzu) equipado con una columna de fase inversa (Cosmosil 5C18-ms-II, 4.6 x 150 mm). La fase móvil utilizada fue metanol a una velocidad de flujo de 1 cm3/min. La longitud de onda programada fue 470 y 680 nm utilizando un detector de matriz de fotodiodos (SPD-M10A; Shimadzu).
Kim et al. (2006)40 plantearon el uso de lámparas intermitentes como fuente de luz, con el propósito de aumentar la producción de astaxantina en H. pluvialis, las pruebas experimentales se diseñaron para evaluar el efecto de luz intermitente localizadas tanto en el interior como en el exterior del fotobiorreactor a intensidades de 65.6 y 16.4 μE/m2/s respectivamente. La fuente de luz exterior, obtuvo rendimientos por fotón por lo menos 60% mayor que la luz continua, mientras que la luz interior presentó un incremento en el rendimiento por fotón de 400%. Se observó que a pesar de que las intensidades aplicadas son bajas, hubo resultados positivos en la acumulación de astaxantina basándose en el rendimiento por fotón utilizado, ante esto, utilizar intensidades altas de luz intermitente de preferencia localizadas en el interior del fotobiorreactor podría mejorar de manera positiva la acumulación de astaxantina. La cuantificación de las xantofilas se realizó con un espectrofotómetro modelo HP8453B, Hewlett-Packard, el disolvente de extracción fue acetona. Realizaron una curva de calibración con estándares de astaxantina sintética (A9335, Sigma-Aldrich). Los resultados de concentración de astaxantina fueron calculados con la ecuación mg/l=0.0045 x Densidad óptica475.
Suh et al. (2006)41 plantearon el uso del fotobiorreactor de doble región. El propósito del diseño fue mantener simultáneamente el crecimiento celular en la región interna y estimular la síntesis de astaxantina en la región externa del fotobiorreactor. El objetivo fue simplificar el proceso de producción de dos etapas de astaxantina a partir de H. pluvialis. De acuerdo con el diseño experimental, las condiciones de estrés fueron intensidad alta de luz y deficiencia de nitrógeno. La máxima acumulación de astaxantina fue de 357 mg/ml en la región exterior del fotobiorreactor, mientras que, la concentración celular en la región interior fue de 4.0 x 105 cel/mL. Los resultados demuestran que el diseño del fotobiorreactor estimuló la producción de astaxantina utilizando altas intensidades de luz y deficiencia de nitrógeno y al mismo tiempo mantuvo el crecimiento celular en la región interna utilizando la misma fuente de luz. Para la cuantificación de astaxantina se utilizó un espectrofotómetro modelo HP8453B, Hewlett Packard.
He et al. (2007)42 llevaron a cabo un estudio en el cual se enfocaron en evaluar el efecto de la combinación de intensidad de luz y deficiencia de azufre, hierro y fosfato en el cultivo de H. pluvialis para la producción de astaxantina. De acuerdo al diseño experimental, se utilizaron dos medios de cultivo diferentes, las variables de pH y temperatura se mantuvieron constantes. Para la determinación de astaxantina por célula a intensidad de luz de 100 μmol fotón/m2/s se utilizó medio BG11, los resultados indicaron que el medio en deficiencia de azufre fue el que acumuló la mayor concentración de astaxantina. Para la determinación de carotenoides por célula se utilizó la mezcla de medio Euglena Gracilis y Jaworski (1:1), las combinaciones experimentales se describen en la Tabla 1, de acuerdo con los resultados, al décimo primer día en deficiencia de azufre se presentó la mayor acumulación de carotenoides por célula. Con base en los resultados obtenidos, la deficiencia de azufre generó un ambiente celular estresante superior que los demás factores evaluados. El método de cuantificación fue el planteado por Boussiba y Vonshak.43 Utilizaron un espectrofotómetro (UV-1601, Shimadzu). La longitud de onda programada fue de 492 nm. La cantidad de astaxantina se calculó aplicando el coeficiente de absorción de 2220 en dimetilsulfóxido de acuerdo con Steinbrenner y Linden (2001).44
Ranjbar et al. (2008) 45 realizaron un estudio para evaluar el efecto que causa la interacción entre la reducción de nutrientes por medio de dilución e intensidad de luz alta en la acumulación de astaxantina por H. pluvialis, se ejecutaron 4 corridas a diferentes condiciones de cultivo en un fotobiorreactor de columna de burbujas, durante las primeras 300 horas a los cultivos se les adicionó medio inorgánico estándar concentrado (fed-batch). Después de las 300 horas de cultivo, a las corridas dos, tres y cuatro se les extrajo la mitad de cultivo y se sustituyó por agua esterilizada, en la corrida cuatro, la intensidad de luz se disminuyó a 21.5 μmol fotón/m2/s. De acuerdo con los resultados obtenidos, la aplicación del método fed-batch junto con iluminación a 48.5 μmol fotón/m2/s presentó el mejor efecto en el crecimiento celular, mientras que una reducción en la concentración de nitratos por debajo de 4 mM e intensidad de 48.5 μmol fotón/m2/s dio como resultado los mejores valores de astaxantina. La cuantificación de astaxantina se llevó acabo por medio de HPLC (LC-10; Shimadzu), una columna de fase inversa (Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6 mm x 150 mm) la fase móvil consistió en metanol a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El equipo fue acoplado a un detector UV-visible (SPD-10AV). La concentración de astaxantina se determinó por medio de una curva de calibración preparada con muestras de astaxantina libre.
Ranjbar et al. (2008)46 efectuaron un estudio para determinar el efecto que presenta la interacción entre altas intensidades de luz, deficiencia de nitrógeno y el tipo de circulación del líquido en el cultivo de H. pluvialis y la acumulación de astaxantina. El tipo de fotobiorreactor usado fue airlift (tubo interno tipo bucle). Los resultados se compararon con los obtenidos en otro estudio realizado por los mismos autores,45 donde se utilizó un fotobiorreactor de columna de burbujas, las condiciones de cultivo y parámetros de estrés son similares al estudio previo. Con los resultados se observó que una reducción en la concentración de nitratos por abajo de 4 mM e intensidad de 48.5 μmol fotón/m2/s mejoró un 16% la acumulación de astaxantina. Posteriormente se aplicó una intensidad de 94.3 μmol fotón/m2/s, la cual aumentó 35 % la concentración de astaxantina después de las 720 horas. De acuerdo con los resultados se concluyó que el diseño del fotobiorreactor airlift incrementó la densidad celular y la producción de astaxantina significativamente. La cuantificación de astaxantina se llevó acabo por medio de HPLC (LC-10; Shimadzu), una columna de fase inversa (Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6 mm x 150 mm) la fase móvil consistió en metanol a una velocidad de flujo de 1 ml/min.
El equipo fue acoplado a un detector UV-visible (SPD-10AV). La concentración de astaxantinasedeterminópormediodeuna curva de calibración preparada con muestras de astaxantina libre. el procedimiento se basó del método de Yuan y Chen, (1998).47 (Tabla 2).
Katsuda et al. (2008)48 investigaron el efecto de la frecuencia e intensidad de luz en la síntesis de astaxantina en H. pluvialis. El efecto de luz intermitente dio mejores resultados que luz continua. De acuerdo con los resultados, la concentración final de astaxantina en luz intermitente a 18 μmol fotón/m2/s y una intensidad de luz incidente de 12 μmol fotón/m2/s fue de 35 μg/ml siendo superior a la obtenida en condiciones de luz continua de 12 μmol fotón/m2/s, el cual fue aproximadamente de 27 μg/ml. El tiempo de cultivo fue de 300 horas. Por lo tanto se determinó la utilidad de luz intermitente en el cultivo de microalgas. La cuantificación se realizó con un HPLC (LC-10; Shimadzu), con una columna de fase reversa (Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6 x 150 mm). Se utilizó metanol como fase móvil a una velocidad de flujo de 1 mL/min. El equipo se acopló a un detector UV-visible (SPD-10AV; Shimadzu). Además se reporta que se realizó una curva de calibración usando estándares de astaxantina marca Sigma Aldrich. El procedimiento fue siguiendo el método de Yuan y Chen (1998).47
Imamoglu et al. (2009)49 realizaron una investigación para comparar el efecto de la interacción entre diferentes medios de cultivo y dos niveles de intensidad de luz, con el propósito de mejorar la tasa de acumulación de astaxantina en H. pluvialis. Se evaluó la combinación de cinco medios de cultivo a dos niveles de intensidad lumínica, los mejores resultados se obtuvieron a partir del medio de cultivo libre de nitrógeno con 546 μmol fotón/m2/s y agua destilada con 546 μmol fotón/m2/s. El estudio determinó la interacción que existe entre la intensidad de luz y la concentración de nutrientes en el medio, de acuerdo con los resultados la combinación óptima elegida fue agua destilada y una intensidad de luz de 546 μmol fotón/m2/s. en base con lo obtenido se concluye que la reducción de nitratos en el medio junto con altas intensidades de luz resultaron ser una combinación óptima. Sin embargo, el uso de agua destilada como medio, obtuvo resultados favorables en la síntesis de astaxantina. Tomando como criterio el factor económico, utilizar agua destilada en sustitución del medio de cultivo original resulta ser más barato que utilizar medio libre de nitratos. En sistemas de producción de tamaño industrial el ahorro resultaría favorable. Para la determinación de astaxantina se utilizó dimetilsulfoxido como disolvente de extracción. Se realizaron lecturas de absorbancia a 490 nm. Así también desarrollaron una curva de calibración utilizando un estándar de astaxantina pura (Acros Co.).
Wu et al. (2010) 50 desarrollaron un diseño factorial 3x3x3 a diferentes intensidades de radiación ultravioleta (UV-B) y varios intervalos de tiempo para evaluar el efecto en la acumulación de astaxantina en cultivos de H. pluvialis. De acuerdo con los resultados, la radiación UV-B tuvo un efecto negativo en la tasa de células vivas (P<0.01) pero no presentó efecto significativo en el incremento del peso seco celular (P>0.05). Sin embargo, influyó de manera positiva en la acumulación de astaxantina (P<0.01) obteniendo concentraciones de 3.2 mg/g con respecto a los resultados del experimento control. Las células fueron expuestas a 3 y 5 W/m2 de UV-B por 60 minutos para evaluar la actividad antioxidante enzimática y los resultados demostraron que la enzima glutatión peroxidasa presentó una alta actividad en presencia de luz UV-B como factor de estrés. El estudio permitió demostrar que la radiación UV-B tiene un efecto negativo en la tasa de supervivencia de las células, sin embargo, aceleró la acumulación de astaxantina. La cuantificación de astaxantina se realizó por medio de HPLC de acuerdo al procedimiento de Boussiba et al. (1999).51
Choi et al. (2011) 52 evaluaron el comportamiento de seis inóculos en diferentes fases de crecimiento, el propósito fue determinar la mejor fase del ciclo de vida de H. pluvialis para ser transferida a la segunda etapa del proceso de producción de astaxantina, se utilizaron métodos de cultivo batch y semicontinuos, en ambos se confirmó que el inóculo número seis el cual se encuentra en una fase de vida senescente con un tamaño celular grande, en condiciones altas de irradiación, deficiencia de nitrógeno y adición de acetato, es la mejor opción para la acumulación de astaxantina. La cuantificación de astaxantina se realizó utilizando dimetilsulfóxido y efectuando lecturas a 492 nm con un espectrofotómetro de acuerdo al método propuesto por Davis (1976).53
Hong et al. (2012)54 realizaron un estudio para evaluar el comportamiento de una cepa fotosensible (mutante) de H. pluvialis en la producción de astaxantina. Se efectuó una lesión parcial en el fotosistema II del aparato fotosintético de las células. La cepa PP-PS #160 mostró el mejor rendimiento en la producción de astaxantina. Se realizó un análisis al extracto obtenido y se determinó que la distribución del ester de astaxantina no presenta diferencias de la obtenida por cepas silvestres. Las características fotosensibles y fotoinducibles de la cepa mutante se mantuvieron inalteradas durante un año y medio. La luz requerida para producir 1 g de astaxantina se redujo 76%, por el contrario la proliferación celular se vio reducida en la fase vegetativa. Los resultados demuestran que la cepa fotosensible aumentó el rendimiento de astaxantina en condiciones de luz moderada (70 μE/m2/s). La cuantificación de astaxantina se efectuó por medio de HPLC (Shimadzu) equipado con un detector UV-visible (SPD-10A, Shimadzu).55
Con base en la descripción de los 15 artículos podemos notar que el diseño experimental propuesto varió de estudio a estudio, así como, las condiciones de cultivo, diseño del fotobiorreactor y los factores de estrés. El rango para el volumen de trabajo fue de 50 a 2000 mL, tiempo de cultivo de 4 a 36 días, los medio de cultivo más utilizados fueron Basal Bold35,38,40,41 y Kobayashi.34,37,39,48 En general, se puede observar una heterogeneidad en el diseño y factores evaluados en los estudios analizados. El factor luz (intensidad y longitud de onda) fue el más estudiado, debido a que es el que causa un mayor impacto en la respuesta fisiológica de las células.56 Un aspecto importante a destacar de esta revisión es que solo se encontró un artículo latinoamericano.35 Mientras que Japón es el país con mayor número de estudios realizados, seguido de Corea del sur.
Conclusiones
A pesar del uso biotecnológico prometedor, la aplicación de microalgas a escala industrial ha sido escasa, debido a los altos costos de producción que conlleva. Es por eso que existe la tendencia hacia disminuir los costos de operación. Con el propósito de mejorar la síntesis de astaxantina, hasta el momento se han realizado varios estudios para determinar los mejores factores de crecimiento y producción de astaxantina a partir de H. pluvialis. Existen muchos avances en el uso de nuevas fuentes de iluminación por ejemplo fibra óptica y LEDs a determinadas longitudes de onda. Sin embargo, las opciones disponibles hasta el momento todavía son pobres en términos de rendimiento general. En el campo de la genética, se investiga en la obtención de cepas fotosensibles, y en la reducción del tamaño de la antena molecular de la clorofila con el propósito de mejorar la eficiencia fotosintética. Sin embargo, aún hace falta realizar más investigaciones en esta área, que requerirá una mejor comprensión del efecto de los factores de crecimiento y estrés que permitan mejorar los resultados en la producción de astaxantina.
