Aislamiento y selección de cepas bacterianas

Se utilizó suelo recolectado de la rizósfera de tomatillo silvestre en el estado de Coahuila, México para el aislamiento de las bacterias. Se pesó un gramo de muestra de suelo, se llevó a dilución seriada y se incubaron en cajas Petri con medio Rennie a 30 °C por 48 horas (^{Matsumoto et al., 2005}). Las colonias obtenidas se incubaron en medio Pikovskaya sólido a 30 °C por 48 horas. Se realizó una selección de aquellas colonias que presentaron halos de solubilización, las cuales fueron incubadas en medio Pikovskaya líquido por 48 horas a 30 °C a 120 rpm, filtrándose con papel filtro Whatman No. 42 para después diluírse 1 en 100 (^{Kumar et al., 2012}). La dilución fue medida en un Espectrómetro de Absorción Atómica GBC Xplor AA para determinar el calcio soluble presente (^{Sadzawka et al., 2004}). De todas las cepas, se seleccionaron las mejores tres con capacidad solubilizadora de calcio para ser probadas en campo. Se realizaron extracciones de ADN genómico de las tres cepas seleccionadas siguiendo la metodología proporcionada por Promega, proveedor del kit de extracción. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando la mezcla comercial GoTaq Green Master Mix, 2XTM (Promega, USA), con los primers PF27 y PR1429, según las especificaciones del fabricante. Los productos de PCR se enviaron al Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad LANGEBIO, CINVESTAV, Irapuato, Guanajuato para su identificación molecular.

Material vegetal y tratamientos

El experimento se llevó a cabo bajo condiciones de campo abierto en las instalaciones del departamento de Horticultura de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Buenavista, Saltillo, Coahuila, México, con ubicación geográfica de 25°21’22.52’’ de latitud norte y 101°2’9.88’’ longitud oeste, con una elevación de 1760 msnm con una precipitación media de 400 mm y una temperatura media anual entre 12 y 18 ◦C. Se utilizaron semillas de cempasúchil de crecimiento indeterminado proporcionadas por productores de la población de Atlixco, Puebla, México. Ocho tratamientos fueron evaluados: T0= testigo, T1= Bacillus sp., T2= B. cereus, T3= B. licheniformis, T4=Bacillus sp. + B. cereus, T5= Bacillus sp. + B. licheniformis, T6= B. cereus + B. lichenifomris, T7= Bacillus sp. + B. cereus + B. licheniformis, se aplicó una solución nutritiva Steiner sin Calcio. Las semillas de cempasúchil se sembraron en charolas de poliestireno con 200 cavidades, se colocó una semilla en cada cavidad, se utilizó como sustrato una mezcla de peat moss con perlita a una proporción 1:1. El trasplante se realizó un mes después cuando las plátulas alcanzaron una altura de 30 cm a doble hilera con 15 cm de separación en camas de 0.80 x 7 m, con 0.80 m de distancia entre camas.

Al momento del trasplante se aplicaron 20 ml de los tratamientos a la base de las plantas a una concentración de 107 UFC mL^-1, en un diseño de bloques completos al azar, con 3 repeticiones y 10 plantas por repetición. Se utilizó la solución nutritiva Steiner sin la adición de calcio. Se hicieron otras dos aplicaciones a los 30 y 60 días después del trasplante. Cuando inició la floración, los órganos de las plantas fueron seccionados en raíz, tallo, hoja y pétalos, posteriormente, se midió la biomasa. La determinación de carotenoides se obtuvo por el método descrito por ^{AOAC (1984)}.

Determinación de minerales

La determinación del calcio, magnesio y potasio se llevó a cabo mediante el método de espectrofotometría de absorción atómica en un EAA GBC xplor AA. la determinación de fósforo por el método de colorimetría en un espectrofotómetro UV-VIS Biomate V7-07. La determinación de nitrógeno mediante el método Micro-Kjeldhal, todos los anteriores siguiendo la metodología descrita por ^{Sadzawka et al. (2004)}.

Análisis estadístico

Para el procesamiento de los datos se realizaron análisis de varianza y pruebas de comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), utilizando el software InfoStat versión 2018.

Solubilización de Ca in vitro

De las 11 cepas probadas, las cepas C06, identificada como B. Cereus, C09 identificada como B. licheniformis y C04 identificada como Bacillus sp. fueron las que presentaron la mayor solubilización de Ca (Tabla 1). La cepa de B. cereus solubilizó el 24.5% del Ca disponible en el medio, la cepa de B. licheniformis, solubilizó el 23.4% del Ca del medio, y en tanto la cepa de Bacillus sp. presentó un 23.0% de Ca soluble. El género Bacillus tiene la capacidad de producir moléculas de ácido indol-3-acético (^{Glick, 2014}), que son capaces de solubilizar moléculas como el Ca₃(PO₄)₂ (^{Chauhan et al., 2017}), liberando los iones de (PO₄)-3 a la rizósfera, siendo así asimilables para las plantas.

Propiedades agronómicas y carotenoides totales en flor

El rendimiento floral obtenido por los diferentes tratamientos estudiados se muestra en la Tabla 2, donde las combinaciones de B. cereus y B. licheniformis y entre Bacillus. sp. y B. cereus, son estadísticamente iguales que el testigo. En experimentos similares, el género Bacillus no muestra incremento en los rendimientos, como sucede con Pseudomonas fluorescens (^{Amereshwar-Reddy & Saravanan, 2020}) y Azotobacter (^{Rolaniya et al., 2017}).

En cuanto a la biomasa de la raíz, la interacción entre las cepas B. cereus y B. licheniformis fue la que estadísticamente presentó mayor biomasa fresca en comparación del testigo, siendo un 62.9% mayor, así mismo, ésta combinación incrementó la biomasa seca de raíz en 86.1%. En cuanto a la biomasa de la parte foliar, la combinación de Bacillus sp. y B. licheniformis presentó una biomasa fresca de 27.8% superior al testigo. La producción de biomasa se ve favorecido al aplicarse cepas del género Bacillus en distintus cultivos como lo comprobaron ^{Castro-Barquero et al. (2015)} y ^{Sosa-Pech et al. (2019)} en distintos cultivos.

Se puede observar que el tratamiento compuesto por la combinación de las cepas Bacillus sp. y B. licheniformis fue el que presentó un mejor comportamiento en comparación de los demás, obteniendo un 18.5% más carotenoides totales que el testigo. El calcio exógeno al ser añadido en cultivos como el tomate (^{Wasti et al., 2016}) y al tabaco (^{Hu et al., 2018}) ha producido plantas con mayor contenido de carotenoides totales en condiciones de estrés hídrico, al contrario la aplicación del género Bacillus no resulta tan efectiva para la producción de carotenoides (^{Karamat & Ahmed, 2018}).

Contenido mineral

El contenido mineral en cada órgano de la planta se presenta en la Tabla 3. En el Ca2+ presente en la raíz, la interacción entre Bacillus sp. y B. licheniformis así como la cepa Bacillus sp. fueron los tratamientos con mayor contenido siendo superiores al testigo 102.2% y 62.0%. En el tallo se aprecia que la interacción entre B. cereus y B. licheniformis y la cepa individual B. cereus fueron los tratamientos que presentaron la más alta concentración de Ca2+, al ser superiores un 42.1% y 41.4% al testigo. En las hojas, la concentración de Ca2+ se observa que todos los tratamientos son estadísticamente superiores al testigo, destacando las cepas B. cereus y Bacillus sp. al superar al testigo por un 70.8% y 68.2%. La concentración de Ca2+ en los pétalos tuvo un comportamiento estadísticamente más uniforme, aun así, el tratamiento de la interacción entre las 3 cepas pesentó un incremento de 30.4% en contraste con el testigo. Las concentraciones encontradas en el presente estudio son superiores a los encontrados por ^{Sonmez et al. (2017)}.

Los resultados obtenidos sobre la concentración de Mg2+ en el cultivo de flor de cempasúchil al aplicar los distintos tratamientos muestran que en la raíz, las concentraciones estadísticamente más altas de Mg2+ se presentaron al aplicar B. licheniformis, la interacción entre B. cereus y B. licheniformis y la aplicación individual de B. cereus, superiores al testigo un 42.9%, 39.5% y 29.8% respectivamente. En hoja, en la interacción entre las tres cepas, la concentración de Mg2+ fue superior al testigo en un 62.6%. Las concentraciones de Mg2+ en el tallo estadísticamente más altas se presentaron al aplicar B. cereus y Bacillus sp. individualmente, superando al testigo en un 20.1% y 13.0%, respectivamente. En cuanto a la concentración de Mg2+ en los pétalos, no hubo diferencia significativa entre los diferentes tratamientos. ^{Jiménez-Gómez et al. (2020)} no encontraron señales de solubilización de Mg2+ por parte de B. halotolerans, mientras que en este estudio se presentan especies de Bacillus que incrementaron la concentración de Mg2⁺ en el cultivo de Tagetes erecta.

Las concentraciones de K⁺ de los órganos principales del cultivo de cempasúchil al inocular los distintos tratamientos dan como resultado que en la raíz el testigo fue el que tuvo la mayor concentración de K⁺ siendo estadísticamente igual a las concentraciones de K⁺ de las raíces de plantas inoculadas con las interacciones de B. cereus y B. licheniformis y a la interacción entre las tres cepas. En las hojas, prácticamente todos los tratamientos fueron superiores al testigo, con excepción de la interacción entre Bacillus sp. y B. cereus, siendo la aplicación de Bacillus sp. individualmente la que arrojó la concentración de K estadísticamente más alta, siendo un 86.1% superior al testigo. En el tallo todos los tratamientos, excepto la interacción entre las tres cepas, fueron superiores estadísticamente, en cambio los tallos de las plantas inoculadas con la interacción entre Bacillus sp. y B. licheniformis fueron los que mostraron una concentración de K mayor, un 52.5% superior al testigo. En los pétalos, la interacción entre las tres cepas y la interacción entre Bacillus sp. y B. licheniformis fueron los tratamientos donde la concentración de K fue la más alta, al ser superiores, respectivamente un 8.9% y 7.9% al testigo. Los resultados obtenidos son similares a los obtenidos por Somnez et al. (2017).

Las concentraciones de P son más altas con la aplicación de B. cereus y el testigo, siendo estadísticamente iguales. En las hojas, la interacción entre la cepa B. cereus y B. licheniformis es la que presenta la concentración más alta de P siendo un 38.8% superior al testigo. En el tallo, la cepa B. cereus, al aplicarse individualmente, mostró la concentración de P más alta, siendo un 25.4% mayor al testigo. Las concentraciones mayores en los pétalos se presentan en las interacciones de las cepas Bacillus sp. y B. licheniformis y Bacillus sp. y B. cereus, siendo 28.8% y 17.5% superiores al testigo. El género Bacillus tiene la capacidad de solubilizar los fosfatos presentes en el suelo por su capacidad productora de ácidos orgánicos (^{Glick, 2014}).

El contenido de N presente en los diferentes órganos del cultivo de Tagetes erecta en todos los órganos, al aplicar cualquiera de los tratamientos con Bacillus fue superior estadísticamente al testigo. En la parte radicular, el contenido más alto de N fue en las plantas inoculadas con B. lichenifomris siendo 183.8% superior al testigo. En las hojas, la aplicación individual de B. cereus y Bacillus sp. fueron los que mayor concentración de N presentaron, al ser 90.3% mayores al testigo. La concentración estadísticamente más alta de N se observó en la interacción entre Bacillus sp. y B. licheniformis siendo 150.5% mayor que el testigo. Y en los pétalos, se presentó en la interacción entre las 3 cepas que fue 183.8% superior al testigo. Al momento de aislar las bacterias se utilizó un medio selectivo para bacterias fijadoras de N siendo los resultados concordantes. Se ha demostrado que el género Bacillus tiene la capacidad biológica de fijar el Nitrógeno (^{Kuan et al., 2016}).