Aislamiento e identificación de los hongos fitopatógenos

Se recolectaron plantas de frijol con síntomas de marchitez y necrosis de raíz y tallos por Rhizoctonia solani y Fusarium sp., las raíces y tallos se lavaron con agua corriente, las cuales se secaron bajo campana de flujo laminar durante 12 horas. Se cortaron porciones de tejido sano y enfermo, y se desinfectaron externamente con hipoclorito de sodio al 3%, lavándose tres veces consecutivas con agua destilada estéril para eliminar el exceso de desinfectante. Posteriormente, se colocaron en toallas estériles para secarse. Los fragmentos de raíces y tallos fueron sembrados en medio de cultivo PDA (BD, Bioxon, Dickinson and Company, México) y se incubaron en una incubadora (LumistellMR IEC-41, México) a 26±2°C por siete días. F. oxysporum fue identificado fenotípicamente de acuerdo con las características morfológicas descritas por ^{Leslie y Summerell (2006)} ; la identificación de R. solani se determinó por los criterios de ^{Sneh et al. (1991)} . Se utilizó el método de cultivos monospóricos para la purificación de F. oxysporum y punta de hifa para el caso de R. solani, los aislamientos fueron conservados bajo refrigeración en agar inclinado a 4 °C.

Corroboración molecular de los hongos

Extracción de ADN de los hongos

Cepas axénicas de los hongos desarrollados en medio de cultivo PDA de siete días de edad, se rasparon con la ayuda de una espátula para la obtención de micelio. La extracción fue realizada por el método de ^{Nicholson et al. (2001)} , usando buffer que contenía EDTA 10 mM, Tris HCl 10 mM pH 8.0, SDS 0.5%. El ADN extraído fue resuspendido en 25 μL de TE. La integridad y calidad del ADN se verificó en gel de agarosa al 1%, bajo electroforesis horizontal aplicando un voltaje de 100 volts por 40 min.

Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se amplificó la región ITS1 e ITS4 (Internal Transcribed Spacer), mediante una mezcla de amplificación en volumen final de 20 μL, compuesto por 13.58 μL de agua MQ, 2.0μL de buffer MgCl (10X), 0.32μL de MgCl2 (25mM), 0.4μL de dNTP´s (10mM), 0.5μL de cada iniciador ITS1 (5´TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3´) e ITS4 (5´TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3´) (10 μM), 0.5 μL de DMSO, 0.2 μL de ADN Taq-polimerasa 1 U y 1 μL de ADN (40 ng/μL). Las reacciones de amplificación se efectuaron usando un termociclador (Bio-Rad T100™ Thermal Cycler California USA) bajo el siguiente programa: 1 ciclo de 94 °C 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 45 s, 53 °C por 45 s y 72 °C 1 min; finalizando con un ciclo de polimerización de 72 °C por 7 min. Las bandas amplificadas se observaron en un gel de agarosa al 1.0% a 90 V por 60 min (^{Nicholson et al., 2001}).

Secuenciación de productos de PCR

Los productos de PCR fueron incrementados y purificados por medio de kit GeneAll®ExpinTM PCR SV, y se secuenciaron por el laboratorio Macrogen Online Sequencing Order System (Rockville, MD, United States), las secuencias obtenidas, se analizaron en la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), usando el programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) para secuencias altamente similares. Cada secuencia obtenida se le depuró la parte inicial y final para aumentar la sensibilidad del análisis (^{Castro del Ángel et al., 2019}).

Bacterias endófitas

Dos aislamientos de Bacillus amyloliquefaciens cepa 53 y B. amyloliquefaciens cepa 21 fueron tomadas de la colección de microorganismos del laboratorio de Fitopatología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Con estos aislamientos se formaron dos consorcios: uno a una concentración de 1x106 ufc y otro de 1x108 ufc.

Formación de consorcios

Se determinó la compatibilidad entre las cepas que mostraron los niveles más altos de antagonismo y mantuvieron su acción continua sobre los fitopatógenos. La compatibilidad se realizó en placas de Petri considerando el antagonismo solo y combinado de las cepas de bacterias endófitas desarrollando la ecuación de Sueke et al. (2010), se consideró la siguiente expresión matemática: , donde: Efecto A= Efecto en A cuando es probado en combinación de B / Efecto en A solo y Efecto B= Efecto en B cuando es probado en combinación de a / Efecto en B solo. La aceptación del efecto fue a partir de los siguientes posibles resultados en la mezcla: ≤ 0.5, sinergismo; 0.5-1.0, aditivo; 1.0-4.0, indiferencia y > 4, antagonismo.

Microorganismos y condiciones de cultivo

El inóculo bacteriano se preparó con una asada de las cepas 21 y 53, ambas se cultivaron en medio líquido papa dextrosa (PD) y se incubaron en un agitador rotatorio (Labnet, Orbit 1000, USA) a 120 rpm a 26 ± 2 °C durante siete días. Después de la incubación, las esporas se recuperaron mediante centrifugación en una centrifuga (Clay Adams Dynac II Centrifuge, United States) a 3500 rpm y se resuspendieron en agua destilada estéril; la suspensión se ajustó en una cámara de Neubauer, la concentración utilizada fue 1x106 ufc/mL y 1x108 ufc /mL. Las suspensiones de los endófitos se conservaron en refrigeración a 4 ºC durante 24 h.

Los conidios de F. oxysporum se recuperaron raspando la placa de Petri y suspendiéndolos en 500 mL de agua destilada estéril, y finalmente se ajustó a 1x106 conidios/mL. El inóculo de R. solani se obtuvo mediante la metodología de Schneider et al. (1997) modificada; se colocaron 300 g de grano de trigo en matraces de 1000 mL con 100 mL de medio PD y se esterilizaron en autoclave durante 30 min por tres días consecutivos. Los matraces se inocularon con tres discos de 5 mm de diámetro con micelio del patógeno de siete días de edad, los cultivos se incubaron a 22 ± 2 °C durante 21 días.

Establecimiento del ensayo

Semillas de frijol (Phaseolus vulgaris CV. Pinto Saltillo) se sembraron en macetas de 5 Kg de capacidad con suelo pasteurizado, recolectado de parcelas donde anteriormente se había cultivado frijol, el método utilizado fue pasteurización que consistió someter el suelo a 80 ºC en autoclave durante 3 veces consecutivas y dejando enfriar entre cada vez. Al momento de la siembra se realizó la inoculación de los fitopatógenos; para el caso de F. oxysporum con una suspensión de 1x106 conidios/mL; para R. solani 10 semillas de trigo con esclerocios y micelio de R. solani de 21 días de edad. Los tratamientos estudiados se reportan en la tabla 1. Los consorcios se inocularon tres veces: una al momento de la siembra, la segunda a los 25 días después de la emergencia y la tercera a los 45 días después de la emergencia. Es importante mencionar que los experimentos se establecieron por separado, es decir un ensayo para F. oxysporum y otro para R. solani. Los consorcios son una mezcla de especies de Bacillus: la diferencia entre estos consiste en dos niveles de inóculo en cada uno de ellos. El experimento se estableció en un diseño de bloques al azar bajo condiciones de invernadero con siete repeticiones por cada tratamiento, una maceta fue considerada una repetición que contó con dos plantas de frijol.

Determinación de actividad enzimática

El material vegetal utilizado para la extracción consistió en 1 g de hojas de frijol de 45 días de edad, previamente lavadas y secas, se maceraron en mortero con una solución amortiguadora de fosfatos pH 7.3 0.1 M, relación 1:2 (m/v). Posteriormente las muestras se centrifugaron a 12 500 rpm durante 15 min a 4 °C, el sobrenadante fue separado para la determinación de la concentración de proteínas (PR), y actividad de fenilalanina amonio liasa (PAL) y peroxidasa (POD). La inoculación de los consorcios se realizó mediante aplicación a la raíz utilizando un aspersor manual (Truper 10929, México) de 1 L de capacidad y la inoculación de los hongos fitopatógenos se llevó a cabo con una jeringa hipodérmica con aplicación de 25 mL al suelo (^{Castro del Ángel et al., 2019}). Las muestras se colectaron a las 0, 6, 12 y 24h después de la aplicación de los tratamientos, las muestras en el tiempo de 0 h fueron colectadas antes de la inoculación (^{González-Gallegos et al., 2015}), el ensayo se desarrolló por triplicado.

Cuantificación de proteínas (PR)

Se determinó según el método de Bradford, utilizando como patrón albúmina de suero bovino (Bradford, 1957). Para la preparación del reactivo Bradford. Se pesaron 10 mg de azul de Coomassie G-250, se adicionaron 5 mL de etanol al 95 % v/v y 10 mL de ácido fosfórico al 85% v/v y se aforó a 100 mL con agua destilada, esta solución se filtró con papel Whatman No. 2 y se almacenó en frasco ámbar a 4 °C.

Preparación de la solución concentrada de albúmina sérica bovina (BSA) 1000 μg/mL.

Se disolvieron 4 mg de BSA en 4 mL de agua destilada y se homogeneizó la solución. Después, se hizo una curva de calibración a partir de diferentes concentraciones de BSA, las soluciones se prepararon con concentración de 100-1000 μg/mL, a partir de BSA y agua destilada (Buffer), llevándolas a un volumen final 1 mL.

Determinación de proteínas por la técnica de Bradford

Se mezclaron en un tubo de vidrio 100 μL de cada una de las concentraciones de BSA con 5 mL de reactivo de Bradford, después de 5 minutos se realizó la lectura en el espectrofotómetro (Jenway 7305 Spectrophotometer, UK) a una longitud de onda de 595 nm, ajustando el cero de absorbancia con el blanco.

Partiendo de la Ley de Beer-Lamber, se realizó una curva ordenando en el eje X las concentraciones y en el eje Y las absorbancias, luego se realizó la regresión lineal y se obtuvo la ecuación Y=mx+b y el R2.

Determinación de la actividad de fenilalanina amonio liasa (PAL)

Se tomaron 0.9 mL de L-Fenilalanina 1 mg/mL, se adicionó 0.1 mL de extracto enzimático e incubó a 40°C durante 30 min en un termociclador (Bio-Rad T100™ Thermal Cycler, California USA) a 300 rpm. La reacción se detuvo con 0.25 mL de ácido clorhídrico 5 N. Las muestras se colocaron en baño de hielo y se les adicionó 5 mL de agua destilada. Los valores de absorbancia se determinaron a una λ = 290 nm en un espectrofotómetro (Jenway 7305 Spectrophotometer, UK) y se calculó con un coeficiente de extinción molar de 17.4/mM/cm (^{Trotel et al., 2007}). Una unidad de actividad enzimática se definió como equivalente a la producción de 1 μmol de ácido transcinámico producido por minuto por mg de proteína (^{Rodríguez et al., 2006}).

Determinación de la actividad de peroxidasa (POD)

El ensayo fue realizado en un espectrofotómetro (Jenway 7305 Spectrophotometer, UK) a 610 nm usando rojo de fenol como sustrato, el volumen total de la reacción fue de 1 mL a 37°C. A 20 µL del extracto enzimático se le adicionaron 50 µL de rojo de fenol al 0.2% (m/v), 930 µL de solución amortiguadora de citrato de sodio pH 4.2, 50 mM. La reacción dió inicio con 10 µL de peróxido de hidrogeno 1 mM, dejando transcurrir 3 min, para detener la reacción se adicionaron 40 µL de hidróxido de sodio 2 N. La absorbancia se registró a 610 nm y se calculó con un coeficiente de extinción molar de 22 000 M/cm, para el producto oxidado. Se expresó la actividad de peroxidasa como milimoles de rojo de fenol que se oxidan por gramo de tejido fresco por minuto (^{Yedidia et al., 1999}).

Análisis estadístico

Las medias obtenidas de la concentración de proteína y de la actividad enzimática fueron sometidas a un análisis de varianza y prueba de separación de medias por el método de prueba de rangos múltiples de Tukey al 0.05 de significancia en el programa SAS versión 9.0 para Windows.

Aislamiento e identificación de los hongos fitopatógenos

Las cepas de hongos aisladas de plantas de frijol con síntomas de marchitez y pudrición de raíz fueron identificadas por características morfológicas. Se observó micelio algodonoso con tonos purpuras a partir de los cuatro días de edad, las características microscópicas fueron microconidios sin septos, ovales, elípticos a reniformes (^{Khan et al., 2021}). Las clamidosporas de posición intercalar y terminal, individualmente o en pares, con una apariencia lisa circular de doble pared. Las macroconidias observadas eran fusoides y alantoides con tres a cinco septos y en forma de gancho (Figura 1A) las características observadas corresponden a las reportadas por ^{Leslie y Summerell (2006)} para Fusarium oxysporum. Las características consideradas para la identificación de Rhizoctonia solani fueron observadas como micelio incoloro a los primeros 3 días de desarrollo, pero se volvió amarillento a color marrón claro a las dos semanas de edad, con células alargadas y ramificaciones que crecieron en ángulos aproximadamente rectos a la hifa principal, estaban ligeramente constreñidos en la unión, y con una pared transversal cerca de la unión, estas características corresponden a las reportadas por (^{Sneh et al., 1991} y ^{Al-Fadhal et al., 2019}), se pueden observar en la Figura 1B.

Figura 1 Estructuras morfológicas de Fusarium oxysporum desarrollado en medio clavel agar (A) y crecimiento de Rhizoctonia solani en medio PDA (B).
Figure 1. Morphological structures of Fusarium oxysporum grown on carnation agar medium (A) and Rhizoctonia solani grown on PDA medium (B). 

Corroboración molecular de los hongos

La confirmación de la identificación morfológica de las especies se obtuvo mediante secuenciación de la región intergénica ITS1 e ITS4, las secuencias obtenidas comparadas en BLAST dieron como resultado a Fusarium oxysporum con clave de acceso JN624887, máximo score de 915, y Rhizoctonia solani con clave de acceso JX050236.1 y máximo score de 1216, ambas con 99% de identidad (Tabla 2). ^{Singha et al. (2016)} identificaron molecularmente aislados de Fusarium amplificando la región del espaciador transcrito interno (ITS) del ADN ribosómico conservado utilizando los cebadores ITS1 e ITS4. Todas las secuencias de ITS se compararon en busca de espacios y similitudes. Por otra parte, ^{Basbagci et al. (2019)} identificó aislamientos de R. solani morfológicamente y los corroboró mediante secuenciación de la región ITS1 e ITS4 a partir de ADN genómico.

Formación de los consorcios

La evaluación en cultivo dual permitió conocer que entre las cepas de bacterias endófitas no existió antagonismo entre ellas al evaluarlas simultáneamente sobre los hongos en estudio (Figura 2). El efecto combinado de B. amyloliquefaciens cepa 53 y B. amyloliquefaciens cepa 21contra F. oxysporum fue de 2.06 mientras que para R. solani fue de 1.98, de acuerdo con Sueke et al. (2010) el efecto encontrado fue nulo, es decir no existió antagonismo, ni sinergismo entre cepas, sin embargo, fueron seleccionadas para ser evaluadas en el cultivo de frijol en diferente tamaño de inóculo. En otro contexto, ^{Yanti et al. (2021)} , reportan consorcios de Bacillus como inductores del crecimiento vegetal en el cultivo de tomate, al respecto, estos autores seleccionaron los consorcios más prometedores por métodos cualitativos observando la zona de inhibición entre ellos en presencia de Sclerotium rolfsii.

Figura 2 Inhibición in vitro de Fusarium oxysporum (A) y Rhizoctonia solani desarrollado en medio PDA (B).
Figure 2. In vitro inhibition of Fusarium oxysporum (A) and Rhizoctonia solani grown in PDA medium (B). 

Determinación de actividad enzimática

Los tratamientos indujeron la actividad proteica de los sistemas ensayados. La actividad mostrada en plantas de frijol, con respuesta a F. oxysporum y R. solani se ve incrementada a partir de las 6 h en todos los tratamientos, mostrando una tendencia a disminuir con el paso de las horas. Las plantas con exposición directa a F. oxysporum muestran los valores más altos de proteína, sin embargo la exposición del consorcio 2 no presenta diferencia significativa frente a este. A las doce horas las plantas inoculadas con los consorcios 1 y 2 e inoculados simultáneamente con F. oxysporum muestran la actividad más alta en comparación con el tratamiento individual de F. oxysporum (P<0.0001), lo que demuestra que se está expresando la respuesta de defensa de la planta frente al patógeno por la acción de los consorcios bacterianos aplicados. Por otra parte, las plantas coinoculadas con el consorcio 2 y el patógeno, se mantiene la actividad constante desde las 6 h y hasta las 24 h mientras que el consorcio 1 la actividad declina a partir de la 12 h de estudio. Los consorcios 1 y 2 en ausencia del patógeno también inducen la actividad proteica en comparación al testigo absoluto (P<0.0001). La actividad de proteína debe formar parte del mecanismo de defensa de la planta de frijol, y es la responsable de la inducción de resistencia desarrollada por la planta después del tratamiento con los consorcios y la infección por el patógeno. La inducción de resistencia se asocia a las proteínas relacionadas con la patogenia (proteínas PR) como grupo de las proteínas antifúngicas relacionadas con la defensa inducibles más importantes, que incluyen defensinas, tioninas, proteínas similares a la osomtina, proteínas similares a la taumatina, quitinasas, glucanasas, oxalato oxidasa u proteínas similares a la oxalato oxidasa y proteínas de transferencia de lípidos (^{Moosa et al., 2017}). La inducción y acumulación de proteínas PR protegen a las plantas de futuras infecciones, su activación es muy importante, ya que son un componente indispensable de las respuestas inmunitarias innatas en plantas en condiciones de estrés biótico o abiótico (^{Jain y Khurana, 2018}).

Determinación de la actividad enzimática de PAL

Los mayores niveles de actividad se expresaron en las plantas tratadas con los consorcios 1 y 2 en presencia de F. oxysporum a los diferentes tiempos de muestreo (P<0.0001), por ello se puede considerar que los consorcios estimulan la defensa de la planta ante al patógeno encontrándose los valores más significativos en los tratamientos antes mencionados. El incremento en la actividad de PAL de la vía de los fenilpropanoides aumenta la producción de ácido transcinámico a partir de fenilalanina, el cual es trasformado a través de otras dos reacciones enzimáticas hasta paracumaril CoA; precursor de un amplio grupo de productos que incluyen la lignina, los fenilpropenos y los flavonoides (^{Glas et al., 2012}). ^{Ardila et al. (2007)} reportaron que la actividad PAL se activa a partir de las 6 h postinoculación de Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raza 2 en plantas de clavel, encontrándose los picos máximos a las 12 h y disminuyó a las 24 h, sin embargo, en este ensayo los valores más altos de PAL se obtuvieron hasta las 24h. Al respecto ^{Duba et al. (2019)} reportaron que la actividad PAL inmediatamente y 24 h después de la inoculación, en líneas de trigo evaluadas fue significativamente (p ≤ 0.01) mayor en plantas inoculadas con F. culmorum. ^{Singh et al. (2020)} con inoculaciones de Trichoderma asperellum y ácido ascórbico en semillas de tomate, las plantas tratadas mostraron una mayor acumulación de contenido total de fenol y una mayor actividad PAL, POD, quitinasa y polifenol oxidasa en comparación con las plantas no tratadas. En otro apartado, la determinación de PAL en plantas de frijol contra R. solani; en todos los tratamientos existe incremento en la actividad enzimática desde las 6 h hasta las 24 h en comparación con el testigo. Se encontró que los consorcios 1 y 2 sin inoculación del patógeno, son mayores que el testigo libre de cualquier tratamiento, lo que se relaciona con un posible cambio en la activación de mecanismos de defensa que generan los consorcios aplicados sobre plantas de frijol antes de que se inocule el patógeno. La capacidad de los hongos patógenos para inducir resistencia sistémica está determinada por la actividad de la fenilalanina amonio liasa, relacionada con el metabolismo de los compuestos fenólicos, la vía metabólica de las fitoalexinas y la inducción de la síntesis de ácido salicílico (SA). En la vía de biosíntesis de SA, el ácido corísmico se convierte en SA a través de la fenilalanina. El ácido cinámico se convierte en productos intermedios de PAL y luego se convierte en SA. El ácido salicílico es un mensajero secundario en el proceso de inducir resistencia al estrés biótico en las plantas (^{Barna et al., 2012}). La PAL cataliza el primer paso en la vía biosintética del fenilpropanoide a través de la desaminación de la fenilalanina en ácido transcinámico, un precursor de las vías biosintéticas de la lignina y los flavonoides. (^{Jun et al., 2018}, ^{Gho et al., 2020}). La PAL juega un efecto importante en la síntesis de metabolitos secundarios y el proceso de resistencia al estrés (^{Zhen y DeGang, 2017}). Por su parte, ^{Rais et al. (2017)} estudiaron rizobacterias para la inducción de diferentes vías en plantas de arroz a través de la producción de varios metabolitos. Reportan, que Bacillus spp. inducen enzimas como la superóxido dismutasa, peroxidasa, polifenol oxidasa y fenilalanina amonia-liasa contra la infección por Pyricularia oryzae. Como se observa en este trabajo, la inducción de esta enzima por los consorcios puede ser relevante en los mecanismos de defensa de las plantas de frijol a las enfermedades.

Determinación de la actividad enzimática de POD.

La expresión de la actividad de POD en plantas de P. vulgaris no presenta diferencias significativas ante los diferentes tratamientos que se aplicaron, en los diferentes tiempos a los que se realizó el ensayo. Sin embargo, a las 12 y 24 h de muestreo las plantas tratadas con los consorcios en ausencia de R. solani presentan mayor actividad de POD en comparación a las plantas sin ningún tratamiento. En adición se puede observar que a las 6 h el testigo absoluto presenta aumento en la actividad POD, pero el incremento de la actividad peroxidasa, que se detecta en las plantas libres de cualquier tratamiento, es posiblemente debido al efecto de la herida que se hace, pues dicha actividad no progresa a través del tiempo. Por otra parte, ^{Ezziyyani et al. (2005)} reportan que a las 24 y 96 horas postaplicación, se produce un incremento de actividad peroxidasa y que la actividad aumenta con el tiempo posterior a la inoculación. La mayor actividad se da a las 96 h en plantas tratadas con T. harzianum. Por lo tanto, ^{Shoaib et al. (2019)} asumen que la supresión de Sclerotium rolfsii está directamente relacionada con el aumento de la actividad de las enzimas peroxidasa, catalasa, polifenol oxidasa y fenilalanina amonio liasa, por lo que proporciona la base para la resistencia en garbanzo. En otro contexto, ^{Khanna et al. (2019)} sugieren que los aspectos favorables de Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia gladioli en la modulación de las características de crecimiento y la expresión de defensa antioxidante de Lycopersicon esculentum para enfrentar el estrés oxidativo generado bajo la infección por nemátodos. A su vez, ^{Sahni y Prasad (2020)} indican que Pseudomonas sp. y vermicomposta aplicadas simultáneamente las actividades de las enzimas POD y PAL fueron altas en las plantas de garbanzo después de inocularse con S. rolfsii. Sus actividades máximas aparecieron a las 48 h después de la exposición al patógeno.