Cepas de TH

Thraustochytrium kinnei VAL-B1 y EMA-T5 fueron aisladas de agua marina en la costa chilena de la ciudad de Valparaíso (Centro, 33°03′47″S) y la antártica chilena (Sur, 75°00′30″S). Durante el período de muestreo la salinidad y temperatura del agua fue de 34,4 ppm y 16°C en Valparaíso y 33 ppm y 3°C en la antártica, lo cual muestra condiciones de adaptación diferenciada para cada cepa aislada. El aislamiento se llevó a cabo empleando el método de polen de pino (^{Gaertner, 1968}; ^{Bremer, 2000}), con el cual se obtienen buenos resultados. Se toman 10 mg de polen de pino y se añaden a la muestra de agua (10 mL) manteniéndose por un período de 7 días a una temperatura de 25°C. Los granos de polen con los microorganismos adheridos son separados por filtración (filtro de nailon, 20 μm) y esparcidos sobre una placa de Petri con agar B: extracto de levadura (EL) 2 g/L, peptona (PEP) 2 g/L, agar 10 g/L, glucosa 5 g/L y sales en agua ANM preparada a una concentración final de 70 % p/v que contiene 300 mg/L de antibióticos (sulfato de estreptomicina y penicilina G) respectivamente, para evitar la proliferación de bacterias. Las placas fueron incubadas a 25°C hasta obtener colonias visibles. Luego colonias individuales fueron subcultivadas de nuevo en placas con agar B hasta obtener aislados puros, los cuales fueron comprobados por inspección en microscopio óptico (Zeiss, Estándar 20, Alemania), tal y como se aprecian en la figura 1.

Figura 1 Aislados puros en placa de Petri de VAL-B1(A) y EMA-T5 (B).
Figure 1. Pure isolates in a Petri dish of VAL-B1 (A) and EMA-T5 (B). 

Identificación genética

Las células colectadas desde las placas de agar fueron suspendidas en agua destilada (200 μL) y centrifugadas (8000 xg, 5 min. a 4°C). El precipitado fue re suspendido con buffer de lisis (200 μL; 0,25 MTris-Cl; 0,1 M Na2-EDTA; 2 % p/v SDS; 0,1M NaCl a pH 8,2). El ADN fue extraído con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitado con etanol. Los fragmentos de ADN secuenciados (ABI-3100, Applied Biosystem, California, USA) con números de acceso KF718865 y KF709393 fueron comparados con los disponibles en la base de datos de GenBank (Nacional Center for Biotechnology Information, USA: NCBI página http://www.ncbi). Las secuencias determinadas en este trabajo fueron alineadas con otras secuencias del gen que codifica para el ARN de la subunidad pequeña ribosomal 18S rRNA de organismos relacionados, obtenidas desde el Banco de Genes NCBI, utilizando el programa Clustal X (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/). Para las dos cepas identificadas, hubo un 99 % de coincidencia con Thraustochytrium kinnei de los fragmentos secuenciados.

Condiciones de cultivo

El inóculo se preparó transfiriendo células de la placa de agar en 50 mL de medio estéril B2 (para 1 L: glicerol, 10 g, EL, 2 g, glutamato de sodio (GS), 2 g y ANM filtrada a una concentración final de 70 % p/v). Se incubaron matraces de 250 mL por 48 h a 25°C con agitación orbital a 180 rpm. El material obtenido se utilizó para inocular (10 % v/v, densidad óptica del inóculo 0,4 a 600 nm) los fermentadores de 1 L que contenían 900 mL de medio, durante 7 días. Los experimentos con el GP y GC se trabajaron con valores de concentración de 1,10 y 20 g/L, empleándose un control. Las soluciones con la fuente de carbono y nitrógeno fueron esterilizadas separadamente (121 °C, 15 min.) y mezcladas para obtener la concentración requerida. Después de la esterilización, el pH del medio fue ajustado (con HCl o NaOH) a 6,8. Los datos empleados para realizar la curva de crecimiento se obtuvieron de cada fermentador utilizado cada 24 h. Los resultados corresponden al promedio de experimentos realizados por triplicado.

Cuantificación de biomasa

La biomasa fue separada por centrifugación (6000 xg, 15 min a 4 °C); el precipitado fue lavado tres veces con agua des ionizada y liofilizado, determinándose gravimétricamente la concentración de biomasa seca. Las muestras se guardaron a -20 °C para posteriormente extraer los AGP. Los resultados obtenidos fueron el promedio de experimentos realizados por triplicado.

Cuantificación de AGP

Las muestras de biomasa liofilizada (30 a 50 mg) fueron empleadas para extraer los AGP por transesterificación directa. Los AGP extraídos con hexano fueron separados por centrifugación (4000 g y 20 °C) y cuantificados por cromatografía gaseosa (Agilent, 7890A) equipado con columna capilar DB-23 (60 m de largo, 0,25 mm de diámetro y 0,25 μm de espesor) empleando el software ChemStation. La temperatura de la columna fue programada desde 50 °C hasta 260 °C con una velocidad de incremento de 10 °C/min. Se utilizó detector de ionización de llama (FID) con gas helio como transportador (200 °C). El inyector se mantuvo a 250 °C y el volumen de inyección fue de 1 μL. Los picos de los metil esteres ácidos grasos (FAMEs) fueron identificados y cuantificados utilizando un estándar de ácidos grasos (Supelco 37 Component FAME Mix, Sigma Aldrich, USA). De igual forma se empleó como estándar interno en la muestra, metil éster ácido tricosiánoico, C23:0 (Sigma Aldrich, USA).

Análisis estadístico

Los datos fueron sometidos en un análisis de varianza (ANOVA) y las diferencias significativas se identificaron mediante la prueba de comparación entre las medias con un nivel de significación del 5 % (p ˂ 0.05). Antes de realizar ANOVA fue necesario comprobar si los datos tenían correlación y sus variaciones tendieran a ser igual. Muestras por triplicado se realizaron a lo largo de toda la experimentación. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo empleando el software SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc., Chicago, IL). Los resultados fueron expresados como medias ± SD (desviación estándar) para cada experimento.

Producción de biomasa

Los resultados para los cultivos de VAL-B1 y EMA-T5 empleando GP y GC se pueden apreciar en la Figura 2. En ambos casos se ve que los mayores valores de producción de biomasa se obtienen al usar GC como sustrato con una concentración de 20 g/L, siendo el quinto día el de mayor crecimiento (VAL-B1: 6,033 g/L y EMA-T5: 6,984 g/L). Al comparar estos resultados con los obtenidos usando GP a 20 g/L, se nota que la producción de biomasa es mayor en más de 400 %, representando una diferencia significativa en la transformación de la fuente de carbono. También se aprecia, que a medida que aumenta la concentración del sustrato en cada una de las fuentes de glicerol, el crecimiento celular de los microorganismos también tiende a incrementarse. La razón de este comportamiento está dada por el hecho de que los TH aprovechan de mejor forma la mayor presencia de nutrientes en los residuos, como es el caso del GC, versus lo que pueden transformar al emplear el GP. ^{Scott et al. (2011)}, generaron 31,66 g/L de biomasa al quinto día de cultivo, usando GC con la cepa Thraustochytrium sp. ONCT18. ^{Pyle et al. (2008)}, obtuvieron 8,1 g/L de masa celular al emplear la cepa S. limacinum SR-21 (ATCCMYA-1381) usando GC obtenido a partir de biodiesel del aceite de soya. ^{Raghukumar (2008)}, usando A. limacinum obtuvo 22,1 g/L empleando GC en un cultivo batch y ^{Silva et al. (2015)}, obtuvieron 14,1 g/L al emplear la cepa AS4-A1 Ulkenia sp. de la misma fuente anterior. Por tal razón, se corrobora que al utilizar GC como sustrato residual y fuente de crecimiento para los TH, se obtienen mayores valores de producción de biomasa que al emplear como fuente pura de carbono GP, donde los TH sólo se valen del único componente presente en el sustrato, versus la variedad que se puede encontrar en un componente residual.

Figura 2 Crecimiento de biomasa para cepas de TH en función del tiempo (a) VAL-B1 en GC; (b) VAL-B1 en GP; (c) EMA-T5 en GC y (d) EMA-T5 en GP. C: concentración de biomasa, GC: glicerol crudo y GP: glicerol puro. Datos expresados son medidas de tres réplicas ± desviación estándar para cada experimento (p ˂ 0.05).
Figure 2. TH strains biomass growth as a function of time (a) VAL-B1 in GC; (b) VAL-B1 in GP; (c) EMA-T5 in GC and (d) EMA-T5 in GP. C: biomass concentration, GC: crude glycerol and GP: pure glycerol. Data expressed are measures of three replicates ± standard deviation for each experiment (p ˂ 0.05). 

Perfil de AGP

Los perfiles de AGP para cada una de las cepas crecidas tanto en GP como para GC se pueden ver en la Tabla 1. Los mayores valores en porcentaje de ácidos grasos totales (AGT) para ambas cepas, se obtuvieron para DHA y EPA, al hacer crecer los cultivos en GP y empleando una concentración de 20 g/L. En el caso de VAL-B1 los valores de los perfiles de DHA y EPA estuvieron por encima del 50 % y 8 % respectivamente y para EMA-T5 se obtuvo valores superiores al 43 % y 8 % para los mismos AGP. Algo importante es la presencia del DPAn6 en ambos casos con valores por encima de 1 %, dado que este ácido graso poliinsaturado de cadena muy larga es un precursor en la generación del DHA y por tal razón podría estar aportando en los valores finales de la obtención del DHA (^{Gupta et al., 2012}; ^{Armenta y Valentine, 2013}). Al usar GC como sustrato en el crecimiento de las dos cepas de Thraustochytrium kinnei, se aprecia al igual que cuando se emplea GP, que a medida que aumenta la concentración en el medio de cultivo también se incrementa el perfil de los AGP. Al respecto, se puede decir que los mayores valores en porcentaje en p/p base seca de AGT para DHA y EPA se dan al usar 20 g/L de GP. En este caso, se observa que tanto para VAL-B1 como para EMA-T5 los valores de composición para DHA y EPA están por encima del 8 % y 40 % respectivamente, no habiendo diferencias significativas entre ambas cepas. Tanto para los cultivos crecidos en GP como en GC se nota que existe una correlación directa en el aumento de la producción de los AGP, a medida que se aumenta la concentración de sustrato en los respectivos cultivos (^{Pérez-García et al., 2011}; ^{Chang et al., 2013}). Esto demuestra que los TH son capaces de aprovechar en forma eficiente el glicerol, tanto puro como crudo, con el fin de transformarlo en AGP con una alta importancia a nivel de procesos industriales (^{Beligon et al., 2016}; ^{Shene et al., 2018}).

Otro aspecto tiene que ver con el hecho de que, aunque ambas cepas pertenecen a la misma especie, Thraus- tochytrium kinnei, provienen de habitas con condiciones climáticas muy diferentes. VAL-B1 fue aislada de la zona cen- tral chilena y EMA-T5 de la zona subantártica, donde existe una diferencia apreciable en la temperatura de sus aguas. No obstante, los valores obtenidos en el perfil de AGT para los diferentes AGP al usar GC como sustrato, no muestran diferencias significativas. Al usar GP tampoco existen diferencias apreciables en el caso del AA, EPA, DPAn6 y DPAn3, sin embargo al analizar el DHA se nota que hay un aumento en el % p/p base seca de la cepa VAL-B1 versus la EMA-T5, lo que podría explicarse en parte a que VAL-B1 tiene mejores condiciones ambientales de temperatura, salinidad, suministro de nutrientes y oxígeno en las aguas de la zona central versus las que puede tener EMA-T5 en las gélidas aguas de la zona subantártica (^{Rosa et al., 2011}; ^{Loperena et al., 2012}; ^{Caamaño et al., 2017}).

Rendimiento y producción de omega 3 y 6

El rendimiento de ácidos grasos omega 3 y 6, aumenta al emplear GP como sustrato tanto en VAL-B1 como en EMA-T5 (Tabla 2). Para ambas cepas se obtienen los mayores valores de omega 3 en EPA y DHA. Sin embargo, el mayor rendimiento se da para DHA, donde con VAL-B1 se producen 91,80±8,78 mg/g siendo superior un 13,28 % con respecto a lo que se obtiene con EMA-T5. Es interesante indicar que, aunque ambas cepas pertenecen al mismo género y que su producción de biomasa en GP es muy similar, ya que no hay diferencia significativa, los valores de producción tanto en omega 3 y 6 favorecen más a VAL-B1. Por tanto, se puede decir que la biotransformación que realiza VAL-B1 del GP, presenta mayor afinidad de condiciones que las que tiene EMA-T5, dado que ella no se halla en su entorno habitual de condiciones extremas, y por esta razón sus valores de producción de AGP son menores a los que se pudiesen encontrar, si efectivamente estuviera produciendo en las condiciones naturales de su hábitat. Estudios precedentes indican que cuando TH están sometidos a condiciones extremas, sean bajas temperaturas o altas concentraciones de salinidad, la forma en que ellos reaccionan a dicho estrés es produciendo más metabolitos primarios, en este caso AGP (^{Rosa et al., 2011}; ^{Loperena et al., 2012}; ^{Wang et al., 2019}). No obstante, como los cultivos de EMA-T5 fueron trabajados en condiciones de temperatura de 25 °C y salinidad de 29 ppm, con una fuente de ANM enriquecida con sales específicas, esta puede ser la explicación de que los ácidos grasos omega 3 y 6 sean menores en comparación con lo producido por VAL-B1, que crece y está adaptada a las condiciones que se emplearon para los experimentos. Sin embargo, es de destacar, que el aprovechamiento que hacen tanto VAL-B1 como EMA-T5 de las dos fuentes de glicerol (GP y GC), presentan a lo menos valores similares o mayores rendimientos cuando se les compara con otras cepas de TH en la producción del EPA y DHA. Por ejemplo, con A. limacinum SR21 que usa GC, y que produce 22,1 g/L de biomasa y 32,2 mg/g, las dos cepas aquí estudiadas tienen un rendimiento mayor al 55 % para producir omega 3, con una cantidad de biomasa tres veces menor que la indicada (^{Raghukumar et al., 2008}). ^{Chang et al. (2015)}, uso 50 g/L de glicerol crudo con Aurantochytrium sp. y obtuvo un rendimiento de 91 mg/g de DHA, valor que no está muy lejos del máximo obtenido con VAL-B1 que fue de 82,68 mg/g. En el caso de EPA, Thraustochytrium sp ONCT18 produce con GR 31,66 g/L de biomasa y tiene un rendimiento de 8,52 mg/g según lo indicado en el estudio de ^{Scott et al. (2011)}; y las dos cepas estudiadas aquí con 4 veces menos de cantidad de biomasa tienen un rendimiento por encima de 80 % al producir este omega 3. Cuando se compara la producción de ácidos grasos omega 6 de EMA-T5 con las de otras especies de TH, se aprecian valores similares de rendimiento (10-13 mg/g) al usar GP como fuente de carbono en los cultivos (^{Adarme-Vega et al., 2014}; ^{Gupta et al., 2015}; ^{Singh et al., 2015}).

La producción de omegas 3 y 6, presenta un comportamiento diferente al hallado en los datos de rendimiento. Al comparar el GC versus el GP en las dos cepas estudiadas, los valores tienden a disminuir en la mayor parte de los omegas (contrario a lo que presento el rendimiento), excepto en el caso de la omega 3 DHA donde se nota una alta producción comparado con el GC, obteniéndose un valor máximo de producción de 1167,71 ± 70,88 mg/L con VAL-B1 al utilizar GP como sustrato. En el caso de EMA-T5 hay un aumento del 26,56 % al comparar el GP con el GC, sin embargo, aunque el valor de producción de DHA es alto - 633,39 ± 73,33 mg/L- con GP, este valor es menor al compararlo con el de VAL- B1 (ver Tabla 2). Un estudio realizado por ^{Ethier et al. (2011)}, empleando S. limacinum SR21 con una concentración de GP de 90 g/L en un cultivo continuo, produjo 1740 mg/L de DHA, un valor cercano a lo reportado por ^{Pyle et al. (2008)} quién obtuvo 1630 mg/L de DHA usando la misma cepa con GC obtenido de la producción de biodiesel a partir de aceite de soya como sustrato y mayor un 49 % que lo reportado en este estudio con VAL-B1 creciendo en GP.

No obstante, la alta producción de DHA que obtuvieron ^{Ethier et al. (2011)}, difiere significativamente de los máximos valores que reportaron ^{Huang et al., 2012}, en donde A. limacinum SR21 produjo 20300 mg/L empleando 50 g/L de GP y usando un cultivo continuo.

Porcentaje total de AGP omega 3 y 6

Las cepas al crecer en GP generaron mayores cantidades de omega 3 y 6, destacándose el DHA producido por VAL-B1 con valores por encima del 52 % de AGT (ver Figura 3). En el caso de la omega 6, el DPAn6 obtenido en GP con la cepa anterior fue el más alto con un valor de 1,59 % de AGT. Al tomar en conjunto el contenido total de omega 3, tanto VAL-B1 como EMA-T5 presentan valores de porcentaje total de ácidos grasos por encima del 50 %, destacando que VAL- B1 produce 62,07 % lo cual es un valor representativo cuando se compara con otras cepas usando el mismo sustrato. ^{Chang et al. (2015)}, reportó un valor total de omega 3 de 53 % AGT usando Aurantochytrium sp. con GP a una concentración de 4 % (p/v), obtuvo además 49 % AGT omega 3 empleando Thraustochytrium sp a la misma concentración de GP y 20 % AGT omega 3 con Ulkenia sp. a las mismas condiciones de GP. ^{Singh et al. (2015)}, empleo GP al 3 % (p/v) y obtuvo 47 % DHA en cultivos con Schizochytrium sp. S31 al séptimo día, valor superior 3 veces al obtenido con EMA-T5 en este estudio para omega 3 DHA con 15,41 % AGT (ver Figura 3). Caso contrario a lo anterior, ^{Chang et al. (2015)}, obtuvo con GC y empleando Aurantochytrium sp. mayores valores para omega 3 que los que reportó Singh et al. (2015), por encima del 50 % para dos cepas de la misma familia. En este caso, dichas cepas de TH presentaron condiciones de adaptación distintas, ya que fueron aisladas y crecidas con otros valores de temperatura y salinidad.

Figura 3 Contenido total de omegas 3 y 6 en cepas de VAL-B1 y EMA-T5 en concentración de sustrato de 20 g/L para GP y GC. Omega 3: DHA, EPA y DPAn3, y Omega 6: AA y DPAn6.
Figure 3. Total content of omegas 3 and 6 in VAL-B1 and EMA-T5 strains at a substrate concentration of 20 g / L for GP and GC. Omega 3: DHA, EPA and DPAn3, and Omega 6: AA and DPAn6. 

Además de lo anterior, ^{Chi et al. (2007)}, reportó con Schizochytrium limacinum un contenido de DHA de 33,6 % empleando GC obtenido de biodiesel industrial, siendo superior al reportado por ^{Pyle et al. (2008)}, quién obtuvo 24,5% de DHA con la misma cepa y sustrato. No obstante, ^{Singh et al. (2015)}, empleo GP al 3 % (p/v) con Schizochytrium sp. S31 suplementado con hidroxitolueno butilado, y obtuvo un 54,76 % más de DHA que ^{Chi et al. (2007)}, y el mismo valor obtenido en este estudio con VAL-B1 y GP (52 % AGT de DHA).

Los porcentajes totales de AGP omega 3 en esta investigación, empleando GP son muy similares a los obtenidos en otros estudios, lo cual indica que dicho sustrato es aprovechado de igual forma por varias especies de TH y que efectivamente hay una afinidad importante por esta fuente de carbono. GC es una alternativa interesante, ya que es un subproducto que puede emplearse para obtener omega 3 y 6 de una fuente que no sea pura y aprovechar el menor costo que podría tener en un proceso productivo.