Recolecta de insectos

Se recolectaron adultos de C. dimidatus durante los meses de junio y julio del 2018 en huertas de guayaba de la localidad de Colomos, municipio de Calvillo, Aguascalientes (21° 52’ 33.9” L, 102° 39’ 39.8”, 1,728 msnm). Se depositaron en recipientes de plástico de 15 cm de diámetro por 25 cm de alto y se mantuvieron con una dieta a base de guayaba fresca y hojas de guayabo (^{Brito et al., 2008}) en una cámara bioclimática (marca Binder^®) a una humedad relativa de 30% y fotoperiodo de 12:12 h luz/oscuridad a 25°C en el día y 24°C durante la noche, la crianza de los insectos se desarrolló en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro campus Saltillo. La identificación del insecto fue realizada en base a las características reportadas por (^{Muñiz-Vélez y González, 1982}; ^{Salas-Araiza y Romero-Nápoles, 2012}) insectos de color rojizo con pubescencia densa de color amarilla en forma de “V” invertida en el pronoto que se extiende hasta el húmero, crestas elitrales, mesosterno cóncavo entre las coxas medias, así como la distribución regular de puntos más o menos profundos en el metasterno.

Extractos vegetales

La semilla de jícama (Pachyrhizus erosus) y la pimienta (Piper nigrum L.) se adquirieron en el mercado local de Saltillo. Ambos materiales se trituraron en un molino (Hamilton Beach® modelo Custom Grind™ Deluxe) hasta obtener un polvo fino, y se almacenaron a temperatura ambiente en recipientes cerrados en oscuridad hasta su uso.

La extracción se realizó con el sistema Soxhlet, de acuerdo a la técnica propuesta por ^{Biswas et al. (2013)}, en una relación 1:4 de material vegetal finamente molido (62.5 g) y etanol (250 mL). El solvente se llevó a ebullición generando un flujo continuo sobre el material vegetal situado en la cámara de extracción a una temperatura de 65 °C durante cinco ciclos. Una vez obtenido el extracto, se colocó en frascos ámbar y se refrigeró a una temperatura de 4 °C.

Selección de cepas de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae patogénicas para C. dimidiatus

Los aislamientos de Beauveria bassiana (BbC2, BbC4, BbC18, BbC20) y dos de Metarhizium anisopliae (MaC10 y MaC21), fueron proporcionados por el laboratorio de toxicología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro; las cuales se cultivaron en cajas Petri que contenían medio Agar Papa Dextrosa adicionado con 0.04 % de extracto de levadura (PDAy), a 25 + 2 °C. Se prepararon las suspensiones de esporas como lo indica ^{Quintela y McCoy (1997)} , las cuales se dispusieron en matraces Erlenmeyer conteniendo 50 mL de agua destilada estéril y Tween 80 al 0.05 %. La concentración de la suspensión de esporas se determinó en un hemocitómetro, ajustándose a 1 x 10⁵, 1 x 10⁷ y 3 x 10⁸ conidios/mL.

Para cada repetición se seleccionaron diez insectos adultos sin sexar con tres repeticiones por tratamiento, tomando para los ensayos a los insectos que mostraron una mayor movilidad y que no presentaban movilidad anormal. Los adultos se sumergieron en las suspensiones de esporas fúngicas durante 30 s, y se colocaron en papel secante por 3-5 minutos para retirar el exceso de humedad y posteriormente se mantuvieron en cajas Petri revestidas con papel filtro (^{Quintela y McCoy, 1997}) en la cámara bioclimática, bajo las condiciones descritas anteriormente. Se registró la mortalidad de los picudos cada 24 h durante 10 días después de la inoculación. Para confirmar la muerte por infección del hongo, los insectos muertos se colocaron en hipoclorito de sodio al 5 % durante 30 s y se enjuagaron en tres ocasiones, antes de colocarlos en cámaras húmedas a 25 °C (^{Brito et al., 2008}). Con los datos obtenidos se estimó el porcentaje de mortalidad corregida (MC) con la fórmula de ^{Abbott (1925)} [MC= ((% Mortalidad tratamiento - % mortalidad testigo)/(100 - % mortalidad testigo))*100], en los tratamientos que así lo requirieron, siendo el porcentaje de mortalidad el criterio de selección

Actividad insecticida de extractos vegetales contra C. dimidiatus

Para la preparación de las diferentes concentraciones de los extractos; los extractos crudos obtenidos se considerados al 100 %, del cual se preparó una concentración madre al 80 % (v/v) con agua destilada estéril, está concentración se diluyó en series al 50 %. Las concentraciones finales evaluadas fueron 80 %, 40 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2.5 % y 1.25 % más un testigo negativo con agua destilada estéril. A todos los tratamientos se les agregó Tween 80 (0.05 %, v/v). Los adultos se sumergieron en las preparaciones durante 30 s, y se colocaron en papel secante por 3-5 minutos para retirar el exceso de humedad y posteriormente se mantuvieron en cajas Petri revestidas con papel filtro; a temperatura de 25+ 1 °C, con una humedad relativa de 30 % y fotoperiodo de 12:12 h luz/oscuridad (^{Quintela y McCoy, 1997}). Se hicieron observaciones de comportamiento (locomoción y alimentación) y mortalidad cada 24 h durante tres días (^{Brito et al., 2008}). Se ajustaron los datos de mortalidad como se indicó en la sección anterior. Las líneas de respuesta dosis-mortalidad para cada extracto se obtuvieron mediante regresiones lineales y análisis estadístico Probit y así determinar las CL₅₀ y las dosis sub-letales CL₂₅ y CL₁₀ para continuar con el bioensayo de combinación de extractos vegetales con hongo entomopatógenos.

Aplicación de los hongos patogénicos en combinación de los extractos vegetales sobre C. dimidiatus

Todas las preparaciones de las combinaciones de los entomopatógenos (a 1X10⁸ conidias/mL) y los extractos de plantas (CL₅₀ y dosis subletales) se hicieron en Tween 80 (0.05 %) (^{Quintela y McCoy, 1997}). Una concentración subletal a aquella que no causa mortalidad de los insectos, pero que provoca un aumento en la susceptibilidad del huésped a las infecciones fúngicas (^{Brito et al., 2008}).

Para cada tratamiento (dosis subletal/hongo entomopatógeno), para cada repetición se seleccionaron diez insectos adultos con tres repeticiones por tratamiento. Los insectos se trataron como se indicó anteriormente, sumergiéndolos por 30 segundos en una preparación que contenía la mezcla de la suspensión de esporas y de los extractos vegetales. Las condiciones del ensayo y el registro de mortalidad se realizaron como se indicó anteriormente. La mortalidad de los insectos en los tratamientos fue ajustada con la fórmula de ^{Abbott (1925)} . Adicionalmente, se confirmó la micosis de los insectos muertos, colocando los insectos muertos en cámaras húmedas. Los datos de la mortalidad se sometieron a un análisis Probit por el método de máxima verosimilitud para determinar la CL₅₀ y el tiempo letal medio (TL₅₀) para cada tratamiento.

Diseño experimental y análisis de datos

Las evaluaciones fueron realizadas bajo un diseño completamente al azar, las líneas de respuesta dosis-mortalidad para cada extracto se obtuvieron mediante regresiones lineales y análisis estadístico Probit. Los datos de mortalidad se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA). Las medias se compararon utilizando la prueba de Tukey a un nivel de significancia de α = 0.05 utilizando con el software estadístico SAS System V.9.1.

Selección de B. bassiana y M. anisopliae patogénicas para C. dimidiatus

Los resultados de las seis cepas de hongos entomopatógenos evaluadas, solo tres cepas de B. bassiana fueron patogénicas a C. dimidiatus. Estas tres cepas mostraron variaciones en su virulencia, siendo la cepa BbC4 (en concentración de 3x10⁸ conidias/mL) la que ocasionó la mayor mortalidad (53 %), seguida por la cepa BbC18 con 27 % y por último la cepa BbC20 con 19 %, mientras que las cepas BbC2, MaC10 y MaC21 no mostraron patogenicidad. En el Tabla 1 se muestran las CL₅₀ de las cepas de B. bassiana patogénicas al picudo. Con base a los resultados obtenidos, las cepas seleccionadas para probar la actividad insecticida de las mezclas de esporas fúngicas y extractos vegetales fueron: BbC4, BbC18 y BbC20.

Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{Cherry et al. (2005)} en donde confirmaron una mayor mortalidad de insectos C. maculatus tratados con B. bassiana fue mayor (100 %) que los tratados con M. anisopliae (83 %). Se han reportado efectos de B. bassiana en otros curculiónidos, como el gorgojo del arroz Sitophilus oryzae L. (Coleóptera: Curculionidae), en el cual causó una mortalidad del 75.8 % a concentración de 3.9x10⁷ conidias/mL, después de 25 días de la aplicación del tratamiento (^{Sheeba et al., 2001}). Por otra parte, se ha reportado que el picudo de la guayaba (C. psidii) muestra una alta tolerancia a las infecciones fúngicas, dado que en estudios previos se observó que aislados de B. bassiana causaron mortalidad variable de 48-73 % (^{Brito et al., 2008}).

Actividad insecticida, CL₅₀ y concentraciones subletales de extractos vegetales contra C. dimidiatus

La mortalidad que fue registrada para el extracto crudo de pimienta al 40 % fue superior al 80 % mientras que con el extracto de semilla de jícama se obtuvo una mortalidad del 82.8 %. En la Tabla 2, se muestran los valores estimados para las CL₅₀, CL₂₅ y CL₁₀ de los extractos crudos de pimienta y semilla de jícama.

Con respecto a la actividad insecticida de los extractos de pimienta, se han aislado varias amidas con actividad insecticida, tales como la pipericida, (E, E) -N- (2-metilpropil) -2,4,12-tridecadienamida, y (E, E, E) -11- (1,3-benzodioxol-5) yl) -N- (2-metilpropil) - 2,4,10-undecatrien-amida (^{Miyakado et al., 1989}; ^{Su y Horvat, 1981}) ). Estos han causado efectos tóxicos para las moscas domésticas (Musca domestica L.), gorgojos del arroz (Sitophilus oryzae L.) y el gorgojo del caupí (Callosobruchus maculatus F.) (^{Scott y McKibben, 1978}; ^{Su y Horvat, 1981}). Además, se han registrado en el gorgojo del maíz (Sitophilus zeamais) porcentajes de mortalidad de 83-100 % a concentraciones del 1-4 % (^{Salvadores et al., 2007}). En adultos de Sitophilus zeamais se ha reportado un 79.25 % de repelencia con extractos de pimienta, con relación al testigo (^{Assis Cardoso et al., 2014}).

Con el extracto de semilla de jícama al 80 % se presentó una mortalidad de 82.76 %; además, se observó una disminución en la alimentación en los insectos tratados, en comparación con la actividad de los insectos del testigo. En ambos extractos, las concentraciones que causaron los mayores porcentajes de mortalidad fueron mayores a los valores reportados por ^{Andrés et al. (2009)} , quienes encontraron que la rotenona de las oleorresinas de la semilla de jícama en concentraciones de 0.05 y 0.06 g/mL, controlaron en semilla de frijol almacenado la incidencia de Acanthoscelides obtectus (Say.) en 95 y 100 %, respectivamente. La rotenona es el principal metabolito secundario presente en las oleorresinas extraídas de las semillas de jícama que presentan acción por contacto, ingestión o como repelente. Este flavonoide actúa en la mitocondria inhibiendo el transporte de electrones del NADH para la fosforilación de ADP a ATP, por lo tanto, el insecto disminuye el consumo de oxígeno, sufre depresión respiratoria y ataxia que causa convulsiones, parálisis y muerte (^{Silva et al., 2002}). En otro estudio, ^{González et al. (2008)} realizaron experimentos en campo contra adultos de C. dimidiatus, registrando un nivel de control similar al producido con malatión y la mezcla de ajo + semilla de jícama (7.25 y 6.98 % de fruta dañada, respectivamente) comparado con los testigos que presentaron niveles de daño del 28 % en la fruta.

Aplicación de los hongos entomopatógenos en combinación de los extractos vegetales sobre C. dimidiatus

Las cepas de B. bassiana (BbC4, BbC18 y BbC20) mostraron una interacción positiva cuando fueron evaluadas de manera simultánea con las CL₅₀, CL₂₅ y CL₁₀ de los extractos vegetales. La combinación de las cepas con el extracto de pimienta aumentó significativamente (p < 0.05) la mortalidad en comparación de la aplicación individual de los hongos (BbC18 y BbC20). Mientras que, en combinación de los hongos con las CL₅₀, CL₂₅ y CL₁₀ del extracto de semilla de jícama, se observó una mortalidad de 90 % (Tabla 3), siendo las combinaciones de los BbC18 y BbC20 con las CL25 y CL10 las que superaron la mortalidad registrada en los insectos únicamente tratados con B. bassiana. Adicionalmente se observó un cambio en el comportamiento de los insectos como un menor consumo de alimento y menor movilidad. Esto pudo deberse a que este hongo produce toxinas como la bassianolide que actúa como factores de virulencia y la beauvericina que es tóxica para algunos insectos, y que se ha reportado juega un papel significativo en la virulencia (^{Vega et al., 2012}).

^{Brito et al. (2008)} , señalan que es poco probable que las aplicaciones de hongos entomopatógenos por sí solas sean eficientes para el control del gorgojo de la guayaba C. psidii, dada su alta tolerancia a las inoculaciones fúngicas en condiciones ideales de laboratorio; sin embargo, ^{Brito et al. (2008)} obtuvieron aumentos significativos en la mortalidad y la velocidad de muerte del hospedador utilizando aceite vegetal e imidacloprid. Por su parte, ^{Malik et al. (2016)} lograron una mortalidad del 100 % en el picudo rojo de las palmeras (Rhynchophorus ferrugineus) después de 15 días de tratamiento con B. bassiana (1 × 10⁶ conidios/mL) en combinación con imidacloprid (1 µl/L). Estos estudios sugieren que el uso de simultáneo de un insecticida químico mejora la patogenicidad de los hongos entomopatógenos. Ya se ha establecido que los insecticidas sintéticos causan cambios fisiológicos o estrés químico en los insectos y posteriormente, las esporas de los hongos penetran fácilmente en la cutícula del insecto y la penetración exitosa produce un crecimiento vegetativo del hongo que afecta la nutrición y finalmente causan la muerte (^{Inglis et al., 2001}; ^{Shahina et al., 2009}).

El estudio de ^{Jaramillo et al. (2005)} reportaron el efecto aditivo de aplicaciones conjuntas de imidacloprid y M. anisopliae para el control del insecto Cyrtomenus bergi. Estos autores encontraron un aumento en la mortalidad del 40 % al 88 % cuando se combinó el hongo con este insecticida (imidacloprid). Además, se ha reportado que la combinación de extracto de higuerilla/extracto de Chile/B. bassiana redujo poblaciones de Sphenarium purpurascens Charp en un 81 % en condiciones de campo (^{Jorge et al., 2016}), aunque también se ha demostrado que en altas concentraciones inhibe la germinación y disminuye la viabilidad de las conidias de B. bassiana (^{Mamprim et al., 2014}).

Cabe destacar que ^{Ali et al. (2018)} , al evaluar la compatibilidad de extractos vegetales (eucalipto y neem) con hongos entomopatógenos (B. bassiana y M. anisopliae), para el control de S. avenae obtuvieron mortalidad de 54-87 % en las mezclas, así como un efecto negativo en la fecundidad al ser tratadas con B. bassiana/extracto de eucalipto.

Los aislamientos de B. bassiana en combinación con las CL₅₀ de pimienta y semilla de jícama mostraron diferencias en los valores de TL₅₀ con respecto a las dosis subletales, requiriendo un menor tiempo de muerte a la CL₅₀ de ambos extractos (Tabla 4). Los menores tiempos de respuesta se observaron con la combinación CL₅₀+BbC20 (extracto de pimienta), siendo un tiempo de 5.8 días para el extracto de pimienta y de 3.8 días para el tratamiento con semilla de jícama. Estos valores son similares con lo reportado por ^{Brito et al. (2008)} , para el control de C. psidii, donde ellos registraron valores de 5.3-8.9 días en aislados de B. bassiana en combinación con un insecticida químico (Imidacloprid). Sin embargo, ^{Suárez-Gómez (2009)} estimó un TL50 para B. bassiana sobre Sitophilus zeamais de seis días después de la aplicación a una concentración de 1x10⁶ conidias/mL. Los aislamientos de hongos entomopatógenos con TL₅₀ mayores de 14 días se consideran no patogénicos (^{Samuels et al., 1989}). Debido a que los TL50 de las dosis subletales con el extracto de semilla de jícama en este estudio, se registraron por debajo de los valores reportados, por se consideran favorables para el control del picudo. Lo anterior concuerda con los efectos sinérgicos reportados por ^{Quintela y McCoy (1997)} , quienes analizaron la sinergia entre combinaciones de entomopatógenos (B. bassiana y M. anisopliae) y el imidacloprid, logrando reducir el tiempo letal (TL50) en poblaciones de Diaprepes abbreviatus hasta en 2.0 y 2.5 días. Asimismo, obtuvieron un 96 % de mortalidad en combinación de B. bassiana con 500 ppm de imidacloprid.