Preparación del frijol

El frijol fue sometido a los siguientes tratamientos: con remojo y sin remojo previo a la cocción, cocción con adicción de epazote, laurel o sin especias (control); y cocción en olla de barro o en olla de presión. Para la preparación de los frijoles cocidos se pesaron y lavaron 150 g de frijol por tratamiento. El frijol con remojo se sometió a inmersión en 1000 mL de agua a temperatura ambiente durante 12 horas. El frijol sometido al tratamiento de cocción en olla a presión se cocinó con un litro de agua durante 45 minutos a temperatura de 121°C, y el destinado a tratamiento en olla de barro se cocinó con dos litros de agua durante 3 horas a 96 °C. Antes de la cocción, epazote fresco (0.39 g), laurel seco (0.07 g), o ninguna especia fueron adicionadas. Los frijoles en combinación con el caldo de la cocción fueron enfriados a temperatura ambiente y homogenizados para su posterior análisis.

Determinación del contenido de ácido fítico

El contenido de fitatos se determinó mediante el método reportado por ^{Al-Kaisey et al. (2003)}. Para el frijol cocido en olla de barro se tomó una muestra de 6 g de frijol y 6 mL de caldo; para el frijol cocido en olla a presión se pesaron 6 g de frijol y 12 mL de caldo (cantidades de agua proporcionales al agua restante después de cocción). La absorbancia fue medida a 830 nm (Espectrofotómetro UV-VIS marca Varian, modelo Cary, Walnut Creek, CA, EUA), para determinar el contenido de fósforo insoluble en la sal férrica. Los valores de absorbancia de las muestras obtenidos en el espectrofotómetro se interpolaron en una curva de calibración construida utilizando ácido fítico como estándar (Sigma-Aldrich), en concentraciones entre 0 y 10 mg/g. El ácido fítico fue calculado asumiendo que contiene 28.2% de fósforo (^{Al-Kaisey et al., 2003}). El contenido de ácido fítico fue expresado en mg/g de materia seca.

Determinación del contenido de oligosacáridos (rafinosa, estaquiosa y verbascosa)

El contenido de oligosacáridos fue determinado por el método de ^{Sánchez-Mata et al. (1998)} , utilizando una mezcla de 4.5 g de frijol cocido mezclados con 4.5 ml de caldo para el tratamiento de cocción en olla de barro, y 4.5 g de frijol y 9 g de agua para el tratamiento de cocción en olla de presión (cantidades de agua proporcionales al agua restante después del proceso cocción). Las muestras se analizaron por HPLC (Varian, modelo 9012 Q, EUA), utilizando una columna YMC PBMN de 5 µm, 4.6x250 mm y 120Å (WATERS, PB12S05-2546WT, EUA), con detector de índice de refracción (32 × 10.6 RIU/FS), y acetonitrilo-agua 60:40 como fase móvil con un flujo de 1 mL/min. Los valores obtenidos fueron interpolados en las curvas de calibración, las cuales se realizaron utilizando estándares ultrapuros de rafinosa, estaquiosa y verbascosa (Fluka). El contenido de estos oligosacáridos fue expresado en mg/g de materia seca.

Contenido de inhibidor de tripsina

El contenido de inhibidor de tripsina se determinó colorimétricamente siguiendo el método descrito por ^{Hamerstrand et al. (1981)} , utilizando un espectrofotómetro (UV-VIS marca Varian, modelo Cary, Walnut Creek, CA, EUA) a 392 nm contra el blanco. La muestra de frijol cocido utilizada fue una mezcla de 3g de frijol y 3 mL de caldo de cocción, para el tratamiento en olla de barro; mientras que para el tratamiento en olla de presión la muestra consistió en una mezcla de 3 g de frijol y 6 mL de caldo de cocción.

Análisis microbiológico

Para evaluar el desarrollo microbiano de la bacteria Pseudomona alcalígenes una muestra de frijol cocido de cada tratamiento (150 mL de caldo de cocción y 150 g de frijol cocido) fue homogeneizada con un equipo Stomacher (IUL, modelo 181/520, EUA) durante 90 segundos y posteriormente inoculada con 100 µL de suspensión bacteriana conteniendo 1x10⁹UFC. El homogeneizado de frijol se almacenó a 4 ºC y se muestreó diariamente por un periodo de cinco días para determinar la carga psicotrófica, preparando diluciones seriadas en agua peptonada, las cuales se sembraron en cajas Petri con agar Pseudomona y se incubaron a 28 °C durante 24 horas, para realizar el conteo microbiano.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se estableció un diseño experimental factorial con tres repeticiones por tratamiento y tres factores que se definieron en la cocción del frijol (olla a presión y olla de barro), remojo (con y sin remojo) y adición de especias (laurel, epazote y control). Luego de comprobar los supuestos teóricos normalidad y homogeneidad de varianza, los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza factorial y las diferencias significativas entre tratamientos se verificaron por la prueba de rango múltiple de Tukey p ≤0.05 con el paquete estadístico SAS 9.3 (SAS Institute, 2016).

Ácido fítico

El análisis de varianza del ácido fítico muestra diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) en los factores de remojo, cocción y en la doble interacción de remojo-cocción y especias-cocción. No se observó efecto significativo del uso de especias en la disminución del contenido de ácido fítico y así mismo, no se detectaron diferencias estadísticas en la triple interacción remojo-especias-cocción (p> 0.05).

En la Figura 1 se puede apreciar el efecto de los factores y de la interacción entre ellos. Se obtuvieron resultados muy claros, los cuales muestran como la cocción en olla a presión ejerce un mayor efecto en la disminución del ácido fítico. Sin embargo, esta disminución fue más marcada cuando existe un previo remojo (en promedio 4.2 mg/g y 5.7 mg/g, respectivamente). La Figura 1 muestra como la cocción bajo presión por si sola es capaz de disminuir el contenido de este factor antinutricional siendo esta la forma de preparación del frijol más adoptada en la actualidad en las diferentes comunidades, así como en la industria para la preparación de frijol precocido (^{Revilla, 2015}).

Figura 1 Efecto del remojo, del uso de especias (laurel y epazote) y del método de cocción (olla a presión o de barro) sobre la concentración de ácido fítico en frijol ‘Pinto Saltillo’ (mg/g base seca). Las barras en las columnas indican la desviación estándar de tres repeticiones por tratamiento para P<0.05.
Figure 1. Effect of soaking, use of spices (bay leaf and epazote), and cooking method (pressure cooker or clay), on the concentration of phytic acid in 'Pinto Saltillo' beans (mg / g dry base). Bars indicate the standard deviation of three repetitions per treatment for P<0.05. 

También se pudo apreciar que el contenido de fitatos en la combinación especia-cocción en olla de barro y sin remojo fue significativamente menor (p ≤ 0.05); es decir, cuando el frijol es cocido en olla de barro sin remojo el uso de estas especias disminuiría la concentración de este antinutriente (Figura 1), lo que realza el valor de estas especias que tradicionalmente han sido empleadas por los pobladores de México pudiendo mejorar la disponibilidad de minerales importantes en la nutrición humana.

Aunque no se han detallado los posibles cambios provocados por el uso de la presión en la cocción de leguminosas, varios autores concuerdan en el efecto beneficioso de este método en la disminución del contenido de ácido fítico y otros factores antinutricionales durante la preparación de leguminosas de forma general, posiblemente, se atribuya a cambios en la estructura química de estos compuestos. De acuerdo con ^{Carter y Manthey (2019)} la cocción promueve cambios estructurales en la superficie de la cubierta de semillas y el interior de estas. Al respecto, ^{Rehman y Shah (2005)} informaron que al incrementar la temperatura en cocción a presión hasta 121°C por 90 minutos y a 128°C por 20 minutos el contenido de ácido fitico disminuye de 28.0 - 51.6% respecto a la cocción ordinaria. Las investigaciones de ^{Kon (1979)} , refieren que con la cocción a presión se ejerce un mayor rompimiento de algunas células del frijol donde se incluyen los nutrientes y antinutrientes, los cuales se liberan al medio de cocción y consecuentemente se produce una reducción de ácido fítico en la leguminosa. Lo anterior concuerda con las afirmaciones de ^{Grewal y Jood (2006)} que atribuyen a este fenómeno a la destrucción de éste factor antinutricional por el tratamiento térmico.

El remojo disminuyó considerablemente la concentración de ácido fítico en el frijol (Figura 1). ^{Alonso et al. (2000)} , reportan una reducción significativa en la concentración de ácido fítico después de someter el frijol a un remojo por 12 horas. La reducción en ácido fítico por el remojo ha sido explicada por diferentes investigadores que afirman es el resultado de un efecto de drenaje durante la hidratación (^{Beleia et al., 1993}). Lo anterior concuerda con ^{Grewal y Jood (2006)} quienes refieren que la pérdida de ácido fítico en las semillas remojadas se debe a la lixiviación de los iones de fitato dentro del agua por la influencia de la concentración de gradiente (diferencia en el potencial químico) lo cual gobierna la velocidad de difusión. Otras investigaciones concuerdan en que la pérdida de ácido fítico podría también atribuirse a la difusión del agua de remojo a la semilla de frijol lo que podría causar un incremento en la actividad de las fitasas presentes en las leguminosas (^{Udensi et al., 2007}) ya que, de acuerdo con ^{Eskin y Wibe (1983)} hay un aumento en la actividad de las fitasas al disminuir el nivel de fitatos como resultado de la hidratación en frijol faba.

Los resultados antes planteados indican que la cocción en barro puede limitar, en mayor medida la disponibilidad de minerales importantes para la nutrición humana, como Ca, Fe, Mg y Zn; por un mayor contenido de ácido fítico en cada porción de frijol consumido, ya que cuando un mineral se une al ácido fítico se vuelve insoluble, precipita y no se absorberá en el intestino, contribuyendo a desarrollar deficiencias de minerales en las personas que utilizan la olla de barro para la cocción de frijol. Esto puede ser un importante problema para las poblaciones de países en vía al desarrollo, sobre todo en los países del continente americano y en África donde el frijol es un alimento básico y constituye una fuente importante de proteínas y minerales (^{Escalante-Estrada et al., 2014}).

Oligosacáridos

Rafinosa, estaquiosa y verbascosa son los α-galacto-oligosacáridos encontrados comúnmente en las leguminosas (^{Gomes Basso Los et al., 2018}). En el presente trabajo, el frijol ‘Pinto Saltillo’ solo presentó rafinosa y estaquiosa; no detectándose verbascosa. Estos resultados concuerdan con ^{Pérez-Ramírez et al. (2018)} quienes no obtuvieron verbascosa en frijol de esta misma variedad.

Los factores remojo, especia y cocción de frijol afectaron significativamente la concentración de los oligosacáridos rafinosa y estaquiosa (p ≤ 0.05). En la Figura 2 se puede observar claramente el efecto positivo de todos los factores sobre la disminución de los α-galacto-oligosacáridos, siendo el remojo el factor que disminuyó en mayor proporción el contenido de ambos compuestos (Figura 2), lo que concuerda con ^{Shimelis y Rakshit (2007)} en frijol común y con ^{Talari et al. (2018)} y ^{Jood et al. (1985)} quienes encontraron que el contenido de los oligosacáridos tanto rafinosa como estaquiosa en diferentes leguminosas se reduce altamente cuando son remojadas, de manera proporcional al tiempo de remojo. Favorablemente, el carácter soluble en agua de los oligosacáridos hace que sea posible su eliminación a través del remojo de las leguminosas (^{Serna-Cock et al., 2019}; ^{Njoumi et al., 2019}) por lo tanto, la práctica de remojo antes de la cocción, en sus diferentes variantes, no solo ayuda a la cocción más rápida de sus granos sino que también mejora sus cualidades nutricionales a través de la disminución del contenido de oligosacáridos rafinosa y estaquiosa.

Figura 2 Efecto del remojo, uso de especias (laurel y epazote) y método de cocción (olla a presión o de barro), en la concentración de α-galacto-oligosacáridos rafinosa (A) y estaquiosa (B) en frijol ‘Pinto Saltillo’ (mg/g base seca). Las barras en las columnas indican la desviación estándar de tres repeticiones por tratamiento para P<0.05.
Figure 2. Effect of soaking, use of spices (bay leaf and epazote), and cooking method (pressure cooker or clay), on the concentration of α-galactooligosaccharides raffinose and stachyose in 'Pinto Saltillo' beans (mg/g dry base). Bars indicate the standard deviation of three repetitions per treatment for P<0.05.  

En aquellos tratamientos sin remojo, el efecto tanto del método de cocción como del uso de especias fue considerablemente significativo en la disminución de oligosacáridos (P<0.05). Sin previo remojo, el frijol cocido en olla de barro mostró una considerable reducción en la concentración de rafinosa y estaquiosa, en comparación con la cocción en olla a presión; sugiriendo que un tiempo prolongado de cocción disminuye la concentración de estos oligosacáridos (Figura 2). Esto concuerda con lo reportado por ^{Iyer et al. (1980)} quienes encontraron una menor concentración de oligosacáridos en frijoles sometidos a cocción por 90 min en comparación con una cocción por 15 min. ^{Njoumi et al. (2019)} encontraron una considerable disminución de rafinosa y estaquiosa en lentejas, garbanzos y habas, después de un periodo de cocción de 1 h a temperatura de ebullición, atribuyendo este efecto a la activación de enzimas α-galactosidasas inherentes en las leguminosas, las cuales encuentran condiciones óptimas a esta temperatura.

La cocción con presión sin remojo mostró la mayor concentración de α-galacto-oligosacáridos y es aquí donde se puedo observar el efecto de las especias, en donde tanto el epazote como el laurel lograron una considerable disminución en la concentración de rafinosa y estaquiosa (P<0.05) (Figura 2). Estos resultados muestran la importancia del uso de especias en la cocción del frijol, cuando este no es sometido a un previo remojo.

La reducción de rafinosa y estaquiosa en frijol mediante la aplicación de las especias (epazote y laurel) (Figura 2), es un resultado científico importante que sustenta la tradición cultural de México, del uso de especias para evitar las flatulencias. Comprobando el criterio de los antepasados mexicanos dada la disminución de esos compuestos que comúnmente están relacionados con la producción de gases a nivel intestinal. Resaltando la importancia de rescatar las tradiciones que se pierden en el tiempo por la adopción de prácticas culinarias que facilitan la preparación de los alimentos pero que pueden disminuir su valor alimenticio.

No existe fundamento hasta el momento, que explique cómo el uso de estas especias disminuye el contenido de rafinosa y estaquiosa, se sugiere la presencia de α-galactosidasas en ambas plantas, epazote y laurel; con una mayor actividad de esta enzima en las hojas de laurel, dado que se observa una mayor disminución de oligosacáridos con el uso de esta especia (Figura 2). Cabe señalar que no se han realizado estudios relacionados con esto, lo cual lleva a seguir supuestos teóricos que podrían significar una importante fuente de futuras investigaciones. Enzimas α-galactosidasas han sido encontradas en hojas de cebada (^{Chrost et al., 2004}; ^{Chrost et al., 2007}), en tallos de caña de azúcar (^{Chinen et al., 1981}), en la planta del melón (Chrost y Schmitz, 2000), en hojas de calabacines (^{Gaudreault y Webb, 1982}; ^{Gaudreault y Webb, 1983}) , así como en hojas de espinaca (Gatt y Baker, 1979).

Inhibidor de trispsina

En cuanto al Inhibidor de tripsina se pudo apreciar que el remojo y la cocción afectaron, significativamente (P<0.05) el contenido de este factor antinutricional lo cual no sucedió con las especias ya que no hubo diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo, las interacciones remojo-cocción, especia-cocción y la triple interacción remojo-especia-cocción mostraron también diferencias estadísticamente significativas.

En el análisis de los factores que mostraron interacción (Figura 3) se pudo apreciar porcentajes de reducción entre 94.52 y 98.82% para los tratamientos cocción en barro sin remojo y sin especias y cocción en presión con la especia laurel y con remojo, respectivamente. La cocción en presión por si sola es capaz de reducir el inhibidor de tripsina en mayor cantidad que la olla de barro, pero la cocción con presión y remojo previo por 12 h es aún más efectiva en la reducción de este factor antinutricional que la presión sin remojo. ^{Corzo-Ríos et al. (2020)} encontraron una pérdida del 100% de la actividad de los inhibidores de tripsina, después del tratamiento térmico bajo presión por 45 minutos. De acuerdo con ^{Corzo-Ríos et al. (2020)}, los inhibidores de tripsina son proteínas termolábiles que se desnaturalizan durante los tratamientos térmicos de cocción del frijol, perdiendo su actividad.

Figura 3 Efecto del remojo, uso de especias (laurel y epazote) y método de cocción (olla a presión o de barro), en la reducción de la actividad del inhibidor de tripsina (%) en frijol ‘Pinto Saltillo’ (mg/g base seca). Las barras en las columnas indican la desviación estándar de tres repeticiones por tratamiento para P<0.05.
Figure 3. Effect of soaking, use of spices (bay leaf and epazote), and cooking method (pressure cooker or clay), on the reduction of the trypsin inhibitor activity (%) in beans 'Pinto Saltillo'. Bars indicate the standard deviation of three repetitions per treatment for P<0.05.  

La reducción del inhibidor de tripsina, mediante tratamientos térmicos, ha sido un aspecto ampliamente estudiado debido que estas enzimas disminuyen la actividad de las enzimas proteasa y reducen la digestibilidad de la proteína bruta (PB) y de los aminoácidos (^{de Coca-Sinova et al., 2008}; ^{Valencia et al., 2008}) por lo que, mediante estos tratamientos se logran un mayor aprovechamiento de las proteínas que contienen las leguminosas.

Se ha señalado que los tratamientos térmicos y el remojo previo son capaces de reducir este factor antinutricional, en gran medida, en varias especies de leguminosas. La reducción de este factor antinutricional consecuencia de un remojo previo puede deberse a la solubilidad del inhibidor de tripsina que le permite su migración de la semilla al medio de remojo.

Varios autores (^{Hernández and Escuerdo, 1993}; ^{Bilbao et al., 2000}) han informado que la cocción y el remojo son capaces de reducir este antinutriente en frijol. ^{Barampama y Simard (1994)} encontraron una reducción de 97.78% al remojar los frijoles y utilizar cocción tradicional. Sin embargo, en esta investigación se encontraron mayores porcentajes de reducción del inhibidor de tripsina cuando se coció el frijol en olla a presión luego de ser remojado por 12 h (98.3% de reducción), al cocer el frijol en presión con la adición de laurel luego del remojo (98.8%) y al cocer el frijol en presión con la especia epazote luego del remojo (98.5%).

Así mismo, ^{Egounlety y Aworh (2003)} han informado de la reducción de este antinutriente con remojo y cocción en leguminosas de importancia económica como la soya (Glycine max Merr.), Caupí (Vigna unguiculata L. Walp) y frijol molido (Macrotyloma geocarpa Harms) y en guisante (Pisum sativum L.) (^{Ma et al., 2018}), Sin embargo, no existen reportes de la disminución del inhibidor de tripsina comparando la cocción en olla de presión y en olla de barro en frijol común.

Así mismo, hasta la fecha no existen reportes de la reducción del inhibidor de tripsina en frijol común cuando se combinan la cocción con las especias epazote y laurel lo que es relevante dado que se combinan la forma de preparación que más se usa en la actualidad con las especias que tradicionalmente se han empleado en la preparación de este grano.

Crecimiento microbiano

La Figura 4 muestra el efecto del uso de olla de barro versus olla a presión sobre el crecimiento microbiano psicrotrófico durante el almacenamiento de frijoles. Existe un mayor efecto de inhibición microbiana cuando se usa presión en comparación con la olla de barro (Figura 4B). Esto podría deberse al mayor efecto de inhibición microbiana de la alta temperatura de cocción utilizada en la olla a presión (121ºC).

Figura 4 Inhibición del crecimiento de bacterias psicotróficas, durante el almacenamiento a 4°C durante 5 días, de frijol ‘Pinto Saltillo’ cocinado en olla a presión o en olla de barro, con la adición de epazote o laurel (A), y sin la adición de especias (B). Figure 4.Psychotropic bacteria inhibition during storage at 4 ° C for 5 days, of ‘Pinto Saltillo’ beans cooked in a pressure cooker or a clay pot, with the addition of epazote or bay leaf (A), and without the addition of spices (B). 

El efecto de la inhibición psicrotrófica microbiana debido a la adición de laurel y epazote se muestra en la Figura 4. El día 1, para olla a presión, y los días 1 y 2 para olla de barro, no se observó inhibición microbiana, incluso una inhibición negativa en los frijoles, es decir un incremento en la población bacteriana. Esto podría atribuirse al hecho de que las hojas de laurel y epazote fueron agregadas sin lavado previo y sin sanitización, y es sabido que las especias pueden ser una importante fuente de contaminación microbiana (^{McKee, 1995}). A pesar de esto, posteriormente, se observó una inhibición microbiana psicrotrófica significativa en frijoles que contienen laurel y epazote durante el almacenamiento. Algunos autores han encontrado una alta actividad antifúngica de las hojas de laurel y de epazote (^{Akdemir Evrendilek, 2015}; ^{Erenpreiss et al., 2006}; ^{Suhr and Nielsen, 2003}).

El uso tradicional de epazote y laurel para cocinar frijoles, y el método de cocción afectaron la calidad microbiana durante el almacenamiento. Los frijoles con epazote y laurel exhibieron inhibición psicrotrófica microbiana, a partir del día 2 de refrigeración (Figura 4). El efecto inhibitorio del laurel fue más pronunciado en el tratamiento de cocción en olla de presión, mientras que el epazote tuvo un mayor efecto inhibitorio cuando el frijol fue sometido a cocción en olla de barro. Los tratamientos a presión mostraron menores cargas microbianas en todo momento durante el almacenamiento en comparación con los tratamientos de barro (Figura 4).