Equipos y reactivos

Los radicales 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) y 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) pertenecen a la marca Sigma-Aldrich, al igual que Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), el 3-(4,5-dimethylthi-azol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Trolox de Sigma-Aldrich y el Dimethyl sulfoxide (DMSO). Los equipos utilizados fueron los siguientes; incubadora de células eucariotas con control de temperatura a 37 ^oC y mantenimiento de atmosfera al 5% de CO₂ de la marca Thermo Scientific, campana de flujo laminar equipada con filtros HEPA y lector de placas BMG LABTECH’s POLARstar Omega.

Líneas celulares y cultivo celular

Las LC L929 (tejido conectivo subcutáneo murino normal) y HeLa (carcinoma humano de cérvix) fueron obtenidas por parte de la American Type Culture Collection (ATCC), A594 (carcinoma alveolar humano), M12A^k.C3.F6 (linfoma de células B murinas) y RAW 264.7 (leucemia de macrófagos transformadas por el virus de Albenson) fueron proporcionadas por el Dr. Emil A. Unanue del Departamento de Patología e Inmunología de la Universidad de Washington. Todas las células fueron cultivadas en el medio de cultivo DMEM suplementado al 5% con suero fetal bovino (D5F), en una atmósfera al 5% de CO₂ a 37°C.

Obtención de resinas y extractos metanólicos

Las resinas de B. hindsiana y B. microphylla fueron colectadas directamente de los troncos de plantas ubicadas en la región de Bahía de Kino, en Hermosillo Sonora, México. Los extractos metanólicos fueron obtenidos a partir de las partes aéreas de A. cochliacantha, de A. constricta, y de J. macrocarpa ssp pungens, la corteza de B. laxiflora y las cáscaras del fruto de J. macrocarpa ssp punges. El material vegetal fue secado a temperatura ambiente para posteriormente ser molido en un molino tipo Wiley, y reposar en metanol (MeOH) a una relación 1:10 p/v de material vegetal durante 10 días, con periodos regulares de agitación. La solución metanólica obtenida se sometió a filtración para finalmente secarla a presión reducida a 40°C por rotaevaporación. El extracto crudo resultante fue secado a temperatura ambiente y almacenado en recipientes color ámbar a -4 °C hasta su uso posterior.

Capacidad reductora del radical ABTS

Se prepararon soluciones de las muestras a concentraciones seriadas de 200 µg/mL a 12.5 µg/mL, utilizando etanol (EtOH) como disolvente. Fueron disueltos 19.3 mg de ABTS en 5 mL de H₂O, a esta disolución se le agregaron 88 µL de K₂S₂O₈ 140 µM y se dejó reposar por 16 h en oscuridad a temperatura ambiente. Posteriormente se preparó una solución con EtOH a 0.7 de absorbancia con una longitud de onda de 730 nm, utilizando EtOH como blanco. Se colocaron 295 µL de la solución en los pozos de una placa de 96, al cual se le agregaron 5 µL de las soluciones de extractos y resinas diluidas en EtOH, se dejó reposar por 5 min a temperatura ambiente y finalmente se realizaron las lecturas en un lector de placas, utilizando una longitud de onda de 730 nm. Los resultados son expresados en microgramos equivalentes a trolox (μgET/mL) utilizando el mismo procedimiento para construir una recta con el antioxidante trolox a concentraciones de 10 a 200 µg/mL (^{Sridhar y Charles, 2019}).

Capacidad reductora del radical DPPH

Se prepararon soluciones de las muestras a concentraciones seriadas de 200 µg/mL a 12.5 µg/mL, utilizando MeOH como disolvente. El reactivo DPPH fue disuelto en MeOH y ajustado a una absorbancia de 0.7 a 515 nm. En una placa de 96 pozos se colocaron 280 µL de la solución DPPH/MeOH y se le adicionaron 20 µL de las soluciones de las muestras (volumen final 300 µL). Posteriormente, esta solución se dejó reposar por 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Por último, la placa fue leída a una longitud de onda de 515 nm en un lector de placas, utilizando MeOH como blanco. Se realizó el mismo procedimiento para la construcción de una curva de actividad antioxidante del trolox a concentraciones de 100 µg/mL a 5 µg/mL, y se expresaron los resultados en μgET/mL (^{Sridhar y Charles, 2019}).

Medición de la Viabilidad Celular Mediante el Ensayo MTT

El ensayo del MTT se basa en la reducción metabólica realizada por la mitocondria sobre este compuesto por la enzima succinato-deshidrogenasa, formando un compuesto coloreado llamado formazán. De esta manera se determina la funcionalidad de las mitocondrias de las células tratadas. La cantidad de células vivas es proporcional a la cantidad de formazán obtenido. Para evaluar la actividad antiproliferativa de las muestras, los extractos y resinas fueron disueltos en DMSO a 40 mg/mL, y posteriormente en D5F realizando soluciones seriadas de 400 µg/mL a 6.25 µg/mL. Se preparó una suspensión celular de 200,000 cel/mL que se distribuyó en una placa de 96 pozos colocando 50 µL de la suspensión en cada pozo. Se incubó la placa a 37 ^oC y atmósfera de 5% de CO₂ por un tiempo de 24 h. Posteriormente, se agregó a cada pozo 50 µL de las diluciones de las muestras y se dejó incubar en condiciones de cultivo por 48 h, con observaciones periódicas al microscopio en lapsos de 24 h a 48 h. Después de haber hecho las observaciones pertinentes en un lapso de 48 h, se realizó un lavado a la placa con una solución de soporte de fosfatos 1 X (PBS 1X) (excepto a las células M12A^k. C3.F6) y se añadió nuevamente 100 µL de D5F. Finalmente, se agregaron 10 µL de una solución de MTT de 5 mg/mL en PBS 1X y se dejó reposar por 4 h en condiciones de cultivo. Una vez concluido el tiempo de reposo, los cristales de formazán formados se disolvieron en 100 µL de isopropanol acidificado y las lecturas se realizaron en un lector de placas a una longitud de onda dual de 570 nm y 630 nm. Se utilizó como control concentraciones de DMSO de 0.01-0.25% en las LC, las cuales no mostraron ningún tipo de daño celular (^{Torres-Moreno et al., 2015}).

Índice de Selectividad

El índice de selectividad de los extractos y resinas, se refiere a la relación de la susceptibilidad a la inhibición del crecimiento entre la LC normal y la LC cancerosa: IC₅₀ LC normal / IC₅₀ LC cancerosa. En la cual, >1; indica que el tratamiento es selectivo hacia la LC cancerosa, y <1 cuando el tratamiento tiene mayor selectividad por la LC no cancerosa (^{Torres-Moreno, 2017})

Actividad antioxidante

El ABTS es un sustrato de la peroxidasa, que al oxidarse en presencia de H₂O₂ se produce el catión radical ABTS·⁺. En solución, este radical presenta un color verde intenso y puede ser monitoreado por espectrofotometría en un intervalo de longitud de onda de 600-750 nm. Al reaccionar el catión ABTS·⁺ con un antioxidante, éste se neutraliza a través de la captación de un electrón por parte del agente antioxidante. La neutralización del radical ABTS·⁺ en solución, se percibe por la decoloración gradual del verde intenso (^{Karadag et al., 2009}). Por otro lado, el radical DPPH tiene la característica de presentar un electrón desapareado en su estructura, que en solución presenta un color púrpura. La absorbancia máxima del DPPH en solución se presenta a una longitud de onda 515-517 nm en el espectrofotómetro. Estas características cambian cuando el DPPH acepta un protón, estabilizando la estructura del radical a DPPH-H, el cual presenta un color amarillo en solución (^{Tirzitis y Bartosz, 2010}).

Los extractos metanólicos de A. cochliacantha y B. laxiflora tienen un comportamiento de actividad antioxidante dosis dependiente, tanto para el método ABTS (Tabla 1) como para el DPPH (Tabla 2). En el resto de las muestras, la actividad antioxidante se mantiene estable sin diferencias estadísticamente significativas entre las concentraciones evaluadas. Los resultados obtenidos en ambas especies de Acacia, a pesar de pertenecer al mismo género, muestran que la capacidad estabilizadora de radicales libres no es igual, esto debido a que A. conchliacantha tiene mayor actividad antioxidante que A. constricta. Otra diferencia se observa al comparar los resultados obtenidos de A. cochliacantha y A. constricta, con los publicados por ^{Agrawal et al. (2010)} para Acacia nilotica. En este artículo se reporta una fuerte actividad antioxidante sobre el radical DPPH, donde a una concentración de 10 μg/ mL neutraliza más del 90% del radical. Para que A. cochliacantha pueda estabilizar la mitad de lo que A. nilotica inhibe con 10 μg/mL, es necesaria una concentración veinte veces mayor, es decir, A. cochliacantha tiene la capacidad de estabilizar el 45 % del radical DPPH solo a 200 µg/mL (Tabla 3). Esto sugiere que la cantidad de antioxidantes que contiene el género Acacia, no es homogénea entre sus especies (^{Agrawal et al., 2010}).

B. laxiflora presentó la mayor actividad antioxidante de las seis plantas evaluadas, en cambio, la capacidad estabilizadora de radicales libres de B. hindsiana y B. microphylla se mantuvo estable en todas las concentraciones estudiadas para ABTS, y sin capacidad estabilizadora del radical DPPH.

Un estudio de actividad antioxidante realizado sobre el extracto metanólico de corteza de Bursera simaruba indica una pobre capacidad de neutralizar a los radicales ABTS y DPPH, pues bien, la concentración en la que neutraliza el 50% del radical es de 0.525 mg/mL y 0.506 mg/mL para ABTS y DPPH respectivamente (^{Bah et al., 2014}). En cambio, el extracto metanólico de la corteza de B. laxiflora, a 200 μg/ mL, neutraliza el 46.9% del radical ABTS, y con 100 μg/mL, el 50.2% del radical DPPH (Tabla 3). Esto puede significar que los compuestos antioxidantes de Bursera se mantienen en la corteza, y al momento de formarse las resinas los antioxidantes no son secretados, o bien, estos si se encuentran presentes en las resinas, pero ya en su forma oxidada.

Actividad Antiproliferativa e Índice de Selectividad

Ciertos antioxidantes, como lo es el grupo de los flavonoides, son conocidos por su capacidad estabilizadora de radicales libres. Sin embargo, algunas moléculas de este grupo tienen la capacidad de inducir mecanismos que activan la muerte celular en células cancerosas, e inhibir la proliferación celular. Estos polifenoles modulan vías de señalización paralizando la progresión y desarrollo del cáncer, así como activando señales de muerte celular que pueden inducir la apoptosis en las células malignas y pre-cancerosas (^{Abbas et al., 2017}).

El extracto metanólico de las cáscaras de fruto de J. macrocarpa ssp.pungens exhibe la mejor actividad antiproliferativa en las cuatro LC cancerosas (Tabla 4) comparado con las otras muestras evaluadas. Adicionalmente, la LC menos susceptible al extracto es L929 (IC₅₀ 47.8 μg/mL), lo que indica un comportamiento del tipo selectivo contra las LC cancerosas (Tabla 5). Este comportamiento también lo presenta el extracto metanólico de las partes aéreas de la misma planta, pero con valores de IC₅₀ más elevados. Estudios de actividad antiproliferativa realizadas sobre Bonellia albiflora (Jacquinia albiflora), reportan, que el extracto metanólico de hojas posee una IC₅₀ de 47.05 μg/mL en HeLa (^{Moo-Puc et al., 2013}), lo que demuestra que su actividad en esta LC es mayor que el extracto de partes aéreas de J. macrocarpa ssp. pungens, pero con valores próximos a los observados para el extracto de las cáscaras del fruto. Es poco probable que los compuestos responsables por la actividad antiproliferativa en Jacquinia sean compuestos fenólicos, esto debido a que los extractos evaluados no poseen actividad antioxidante, además, solo se han reportado triterpenos glucosilados para especies de este género (^{García-Sosa et al., 2011}; ^{Vila-Luna et al., 2017}), por lo que probablemente, este tipo de compuestos sean los responsables por la actividad antiproliferativa en las LC cancerosas (^{Sofi et al., 2018}).

El género Bursera es estudiado actualmente por sus propiedades biológicas en sistemas in vitro. En el presente estudio, podemos observar actividades antiproliferativas importantes en las tres especies de Bursera, siendo el extracto metanólico de B. laxiflora el que demostró actividad antiproliferaiva del tipo selectivo en las LC cancerosas, debido a que la IC₅₀ para L929 no pudo ser calculada por no presentar cambios aparentes en la proliferación celular a la máxima concentración evaluada de 200 µg/mL (Tabla 3 y 4). No obstante, la resina de B. microphylla es la que presenta la mejor actividad antiproliferativa en las cuatro LC cancerosas, en comparación con las otras dos especies del género Bursera, siendo la LC humana de cáncer cervicouterino, HeLa, la más afectada por esta resina, donde solo es necesario 13.8 µg/mL para inhibir el 50% de la proliferación celular. Otros estudios han llegado más lejos; un claro ejemplo es el aislamiento de compuestos con actividad antiproliferativa de Bursera fagaroides. En B. fagaroides se aislaron lignanos que presentan fuerte actividad antiproliferativa contra diferentes líneas celulares. Los lignanos son compuestos fenólicos que presentan actividad antioxidante, que también han sido aislados de B. simuraba, y que pudieran explicar la actividad antioxidante y antiproliferativa de B. laxiflora (^{Rojas-Sepúlveda et al., 2012}).

La resina de B. microphylla, y el extracto metanólico de J. macrocarpa ssp. pungens son las únicas dos muestras que presenten IC₅₀ consideradas citotóxicas, con valores menores a 30 µg/mL, según lo establecido instituto nacional del cáncer de los Estados Unidos (American National Cancer Institute) (^{Ogbole, Segun y Adeniji, 2017}).