Muestreo de suelo y diseño experimental

Se utilizó como modelo de estudio un sistema de microcosmos conformados por suelo agrícola proveniente de un campo sembrado con alfalfa (Medicago sativa) en la Costa de Hermosillo, Sonora, México (29º00´37.1”N 111º07´59.3”W), el cual consistió en un cultivo rotatorio de 3 años de antigüedad, donde el uso de pesticidas fue nulo (Figura 1). Se tomaron 30 núcleos de muestras aleatorias de suelo separadas entre sí por un mínimo de 10 metros de distancia con un nucleador de 30 cm de profundidad (^{Calderón et al., 2017}). El suelo colectado fue mezclado y tamizado en una malla de 4 mm para crear una muestra compuesta. El suelo fue transportado al laboratorio de microbiología del Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora (DICTUS) donde se construyeron 164 microcosmos, los cuales consistieron en frascos de vidrio con tapón de algodón para permitir el intercambio gaseoso, ambos esterilizados previamente y 55 g del suelo previamente colectado (T0) (Calderón et al., 2017). Posterior a ocho días de aclimatación en condiciones de laboratorio, tres microcosmos del lote total fueron sacrificados en condiciones de esterilidad para posteriores análisis fisicoquímicos, mientras que los microcosmos restantes fueron divididos en diferentes grupos; el primero de ellos comprendido por 18 microcosmos denominado como grupo control (Figura 2). El lote de microcosmos restantes fue perturbado en condiciones de esterilidad con 2 formas diferenciadas de dos compuestos M-salfen distintos; níquel (Ni²⁺) y zinc (Zn²⁺), cada uno modificado a su vez por un grupo hidroxilo (OH) en su estructura (A), o dos grupos hidroxilos (B), respectivamente (Figura 2). Todos los compuestos M-salfen fueron sintetizados y caracterizados previamente en el laboratorio de Química Supramolecular de la Facultad de Química de la UNAM, (^{Hernández-Ramírez} y ^{Cano-Cruz, 2018}). Los compuestos Ni-salfen y Zn-salfen en sus diferentes formas, fueron aplicados a dos diferentes concentraciones establecidas con base a los límites máximos permitidos por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) para cada metal (^{McLean y Bledsoe, 1992}). La forma A y B de Ni-salfen se aplicó en concentraciones de 15 y 30 mg kg^-1 de suelo, respectivamente, denominados: NiSA15, NiSA30, NiSB15 y NiSB30; mientras que la forma A y B de zinc-salfen fue aplicada a 30 y 50 mg kg^-1 de suelo, respectivamente, denominados: ZnSA30, ZnSA50, ZnSB30 y ZnSB50 (Figura 2). Así, cada perturbación fue aplicada en grupos de 18 microcosmos al posterior a una semana de aclimatación. Todos los microcosmos fueron incubados a 25ºC durante 240 días manteniendo un intervalo de capacidad de retención de agua (WHC) entre 60-80%, tomando como puntos de muestreo los días; 8 (T1), 15 (T2), 30 (T3), 60 (T4), 120 (T5) y 240 (T6) (Figura 2). Así, para cada punto de muestreo, tres microcosmos de cada tratamiento fueron sacrificados en condiciones de esterilidad (n=18×6) y el suelo contenido fue dividido para posteriores análisis fisicoquímicos como porcentaje de humedad, pH y análisis de la reserva de nitrógeno inorgánico y el resto, fue congelado a -20°C hasta su procesamiento para las determinaciones de absorción atómica de metales.

Figura 1 Sitio de muestreo de suelo. Campo agrícola de Alfalfa (Medicago sativa) en el Departamento de Agronomía y Ganadería de la Universidad de Sonora, ubicado en la Costa de Hermosillo, Sonora, México.
Figure 1. Soil sampling site. Alfalfa (Medicago sativa) agricultural field in the Department of Agronomy and Livestock of the University of Sonora, located in the Hermosillo Coast, Sonora, México. 

Figura 2 Diseño experimental. Compuestos M-salfen de níquel y zinc. A) Forma A de Ni-salfen (NiA) con 4 anillos bencénicos y 1 grupo hidroxilo; B) forma B de Ni-Salfen (NiB) con 3 anillos bencénicos y 2 grupos hidroxilo; C) forma A de Zn-salfen (ZnA) con 4 anillos bencénicos y 1 grupo hidroxilo y D) forma B de Zn-salfen (ZnB) con 3 anillos bencénicos y 2 grupos hidroxilo.
Figure 2. Experimental design. M-Salphen compounds of nickel and zinc. A) A form of Ni-Salphen (NiA) containing 4 benzenic rings and 1 hydroxyl group; B) B form of Ni-Salphen (NiB) containing 3 benzenic rings and 2 hydroxyl groups; C) A form of Zn-Salphen (ZnA) containing 4 benzenic rings and 1 hydroxyl group and D) B form of Zn-Salphen (ZnB) containing 3 benzenic rings and 2 hydroxyl groups. 

Determinación del porcentaje de humedad, textura y pH

La determinación del porcentaje de humedad del suelo proveniente de los microcosmos perturbados fue realizada siguiendo la norma ^{ISO-10390:2005}, utilizando 5 g de suelo. Así mismo, la determinación del pH en los diferentes puntos de muestreo se realizó utilizando un electrodo de vidrio en una suspensión de suelo (1:5) en agua, la cual tuvo una conductividad específica no superior a 0.2 mS m^-1 a 25°C y un pH superior a 5.6 (Grado 2 de agua según ^{ISO 3696: 1987}). La determinación de textura del suelo se realizó de acuerdo a la norma ^{ISO 11277:2009}.

Determinación de la reserva de nitrógeno inorgánico y su funcionalidad

Las concentraciones de amonio y nitrato reflejan el balance neto entre los flujos de nitrógeno presente en el suelo, resultado de diferentes procesos de transformación del mismo, es por ello que se siguió la metodología modificada descrita por ^{Calderón et al. (2017)}, para cuantificación del funcionamiento general del ciclo del nitrógeno en el suelo. Para ello, la reserva mineral de nitrógeno fue extraída utilizando 15 g de suelo fresco, provenientes de cada microcosmo sacrificado, con 60 mL de una solución de KCl 1M y agitados durante 1 h a 80 rpm a temperatura ambiente para la posterior obtención de los filtrados, los cuales se almacenaron a -20°C hasta su cuantificación. La cuantificación de la concentración de la reserva de nitrógeno inorgánico comprendida por amonio (NH₄ ⁺), nitrito (NO₂ ^-) y nitrato (NO₃ ^-) fue realizada por el método colorimétrico previamente descrito por ^{Walkeley y Black (1934)} y ^{Keeny y Nelson (1982)}, utilizando un espectrofotómetro UV-VIS Spectrophotometer 752 (Bio-Equip, China).

Análisis de absorción atómica para la determinación de metales

La determinación del contenido de níquel y zinc se evaluó en los microcosmos provenientes de cada perturbación en los puntos de muestreo T1 y T6 (8 y 240 días, respectivamente). Además, el suelo sin ser sometido a ninguna perturbación (control) también fue analizado. Para ello, 10 g de suelo fueron previamente digeridos en un horno de microondas marca Anton Paar, modelo Multi WavePRO, empleando HNO₃. Para la calibración de la cuantificación se empleó un estándar certificado marca High-Purity Standards Cat QCS-27, Lote 1826134 y posteriormente las cuantificaciones fueron realizadas empleando un equipo de espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado, generado por microondas (MP-AES) marca Agilent modelo MPES 4200 en la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación y la Industria (USAII) de la Facultad de Química (UNAM).

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron en el programa R Studio (versión 3.6.1), utilizando los siguientes paquetes; ggplots2 (^{Wickham, 2016}), agricolae (^{Mendiburu y Simon, 2009}), ggfortify (^{Horikoshi et al., 2019}) y vegan (Oksanen et al., 2008), se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía (α=0.05) seguido de la prueba post-hoc de Tukey para la separación de medias. Se realizó también un análisis de coeficientes canónicos para determinar la recuperación en el tiempo de los tratamientos y un análisis multivariado de componentes principales (PCA) para comparar los diferentes perfiles.

Funcionalidad del ciclo del nitrógeno y movilización de níquel y zinc

El efecto causado por las perturbaciones aplicadas con las diferentes configuraciones de compuestos M-salfen sobre la reserva de nitrógeno inorgánico, reveló diferencias estadísticamente significativas en función del tiempo y tratamiento aplicado (p<0.05) (Figura 3 y Tabla 1). A los 8 días después de la perturbación, se observó un aumento de la concentración únicamente de amonio, como indicador de la reserva de nitrógeno inorgánico. Sin embargo, entre tratamientos no se encontraron diferencias significativas (p<0.05); mientras que la concentración de nitrito y nitrato se mantuvo baja y no se observaron diferencias significativas entre tratamientos (p<0.05) (Tabla 1). Lo anterior podría deberse a que las bacterias fijadoras de N₂ como Azotobacter y Bradyrhizobium, así como las reductoras de nitrito con la enzima reductasa de asimilación de nitrito (sirohaem-Nir), se aclimataron en todos los microcosmos, ocasionando la acumulación del amonio (^{Cabello et al., 2004}; ^{Isobe y Ohte, 2014}; ^{Daims et al., 2016}; ^{Stein y Klotz, 2016}).

Figura 3 Análisis de Componentes Principales (PCA) de tratamientos con M-salfen de níquel y zinc incluyendo control, durante el tiempo. A) Tratamientos perturbados con Ni-salfen y control; B) Tratamientos perturbados con Zn-salfen y control.
Figure 3. Principal Component Analysis (PCA) of treatments with M-Salphen of nickel and zinc including control, over time. A) Disturbed treatments with Ni-Salphen and control; B) Disturbed treatments with Zn-Salphen and control. 

A los 15 y 30 días posteriores a las perturbaciones, la reserva de amonio disminuyó en todos los tratamientos y no se observaron diferencias (p<0.05) de pH entre tratamientos, observándose en promedio un pH de 9 los primeros 30 días (Tabla 1). Los primeros 60 días posteriores a las perturbaciones, posiblemente corresponden a un periodo de aparente estabilidad en los indicadores del ciclo del nitrógeno, donde los microorganismos que dirigen dicho ciclo se mantuvieron en un periodo de aclimatación ante los metales acoplados a M-salfen primeramente, transportando los metales dentro de la célula, posiblemente mediante el sistema de captura de magnesio CorA, el cual es rápido e inespecífico para metales como Co(II), Ni(II), Zn(II) y Mn(II), y es dependiente del gradiente quimiosmótico existente a través de la membrana citoplásmica (^{Spain, 2003}; ^{Azarbad et al., 2015}; ^{Das et al., 2016}).

A los 60 días posteriores a las perturbaciones se encontraron las mayores concentraciones de amonio, nitrito y nitrato en el suelo en todo el estudio. Así, la respuesta del NH₄ ⁺ ante la perturbación con M-salfen, se diferenció entre tratamientos a los 60 días (p<0.05), en donde el compuesto NiSA15 mostró la mayor concentración (3.7 mg kg^-1 suelo) siendo diferente, significativamente (p<0.05), respecto a los tratamientos perturbados con NiSB30, ZnSA50, ZnSB30 y ZnSB50. El aumento en la acumulación de amonio pudo deberse al favorecimiento del desarrollo de bacterias y arqueas fijadoras de N₂, así como a la baja proliferación de las bacterias oxidadoras de amonio (AOB) (^{Daims et al., 2016}; ^{Stein y Klotz, 2016}). En estudios previos, ^{Miller et al. (2007)}, demostraron que la concentración de NH₄ ⁺ en el suelo debería ser mínimo tres órdenes de magnitud menor que la concentración de nitrato, con el fin evitar una posible toxicidad en las raíces de las plantas. Aunado a lo anterior, la alta concentración de esta especie nitrogenada en el medio, puede aumentar la capacidad de intercambio catiónico saturando la reserva soluble de toda la reserva de nitrógeno en el suelo, ocasionando así una acumulación de nitrito y nitrato. Por otra parte, la acumulación de amonio en el sistema, puede provocar la inhibición del crecimiento de raíces y brotes que se asocian con la clorosis de las hojas y con desequilibrios iónicos en las plantas, así como la alteración de los gradientes de pH, causando acidificación a través de las membranas o causando estrés oxidativo (^{Liu y von Wirén, 2017}). En el presente estudio se observó que, con el aumento en la concentración de amonio en el suelo, éste se acidifica pasando de un pH básico a neutro.

Respecto al NO₂-, se observó una respuesta diferente estadísticamente significativa (p<0.05) entre los tratamientos NiSA15 y ZnSA50 (68.5 mg kg^-1 suelo y 27.5 mg kg^-1 suelo, respectivamente). Este resultado se puede comparar con lo publicado por ^{Nelson et al. (2016}), quienes demostraron que, en la mayoría de los suelos agrícolas, independientemente del tipo de suelo y perturbación abiótica relacionada con el cambio de pH, temperatura, humedad, cuando existe una acumulación de nitrito, este puede deberse a que el primer paso de la desnitrificación ha sido estimulado.

Referente a la concentración de NO₃-, el compuesto NiSB15 fue el que obtuvo la mayor concentración (6.9 mg kg^-1 suelo), siendo este tratamiento diferente significativamente (p<0.05) respecto al control y todos los tratamientos de Zn-salfen, independientemente de la forma y concentración. Los estudios previos, que han evaluado el efecto de la contaminación del suelo con Níquel como metal pesado en el ciclo del nitrógeno del suelo, han sido enfocados al proceso de fijación de N₂, encontrando que, con la aplicación de solución nutritiva de NiCl₂ 1 mM, el suelo aumentó la actividad de hidrogenasa, enzima implicada en la fijación de nitrógeno de los nódulos de Rhizobium japonicum, 52 días después de la perturbación y excediendo la dosis del tratamiento control en aproximadamente un 45% para observar que, el efecto promotor desapareció en el día 100, aparentemente como resultado del aumento de la toxicidad del metal (^{Weisany et al., 2013}). En este sentido, en nuestro estudio, los resultados obtenidos con los compuestos NiSB30 y ZnSA30, demostraron de igual manera no presentar diferencias significativas de pH entre la mayoría de los tratamientos (p<0.05) (Tabla 1).

A los 120 días posteriores a las perturbaciones iniciales, se observó un panorama similar al ya observado en los días 15 y 30 en los tres indicadores de las especies nitrogenadas cuantificadas, resultando en una disminución significativa respecto a los 60 días del tratamiento. Respecto a la concentración de amonio, se observó una diferencia significativa entre los tratamientos de los compuestos NiSA15. NiSA30 y NiSB15 respecto a ZnSB50, siendo este último el de mayor concentración (1.6 mg kg^-1 suelo). Por otra parte, un efecto interesante se observó en todos los tratamientos comparado con el muestreo anterior (60 días), donde el nitrito fue consumido casi en su totalidad, reduciéndose en aproximadamente 60%, sin embargo, la concentración de nitrato evaluada en este tiempo de muestreo demostró diferencias significativas (p<0.05) respecto al control para los tratamientos NiSA30, ZnSB50 y ZnSA50.

En lo que corresponde al pH, en este tiempo se encontraron diferencias significativas (p<0.05) respecto al control para todos los tratamientos excepto NiSA15 y ZnSB50, viéndose que NiSB15 mostró el mayor pH (7.6), por otra parte, ZnSA30 y ZnSA50, mostraron el menor potencial (7.1 y 7.0, respectivamente). En estudios previos, se ha reportado que Nitrospirae Linaje II, perteneciente a las bacterias tipo comammox, puede realizar el proceso de nitrificación completo, sin expeler nitrito al medio (^{Daims et al., 2016}; ^{Van Kessel et al., 2015} y ^{Hu y He, 2017}), por lo tanto, la presencia de nitrato, pero no de nitrito, podría deberse a la presencia y desarrollo de este tipo de bacterias, agregando que se ha reportado que la nitrificación aumenta con la disminución de pH (^{Aislabie y Deslippe, 2013}).

Al final del experimento, es decir, alcanzados los 240 días posteriores a las perturbaciones iniciales, el NH₄ ⁺ en todos los tratamientos mostró un aumento de concentración respecto a los muestreos anteriores de 60 y 120 días. A los 240 días las diferencias significativas (p<0.05) pudieron observarse en los microcosmos perturbados con el compuesto ZnSA30 respecto al control y NiSA15 (1.5 mg kg^-1 suelo y 1.4 mg kg^-1 suelo). La especie NO₂- presentó un aumento en la concentración para todos los tratamientos respecto al del muestreo de 120 días. La cuantificación de nitrato a los 240 días fue mayor para todos los tratamientos respecto a los tiempos anteriores muestreados, excepto para los microcosmos muestreados a los 60 días, mostrando diferencias significativas entre los microcosmos perturbados con el compuesto NiSB15 y el control (p<0.05). El pH nuevamente no mostró diferenciación significativa entre tratamientos (p<0.05).

Al inicio del estudio en todos los tratamientos y el control se observó un intervalo de pH entre 9.2-8.9; mientras que a los 120 días el pH disminuyó dentro de un intervalo de 7.6-7.1, manteniéndose así hasta los 240 días, por lo que se observó un efecto en este parámetro de un suelo con pH básico a neutro para todos los tratamientos (Tabla 1). El pH es un factor muy importante que afecta la movilidad de los metales en la matriz del suelo (^{Giller et al., 1998}) y la mayoría de éstos, tienden a estar más biodisponibles a pH ácido porque son menos fuertemente adsorbidos por las partículas del suelo, excepto el As, Mo, Se y Cr, que son más móviles a pH alcalino (^{Galán Huertos y Romero Baena, 2008}).

Los resultados de la cuantificación de los metales al inicio y final de los tratamientos mediante absorción atómica mostraron que, entre los tratamientos con Ni-salfen y el control, se tuvo un aumento en la concentración del metal entre los 8 y 240 días para todos los compuestos empleados con mayor contraste en NiSA30 a los 240 días (Figura 4A), sugiriendo una acumulación del níquel en el suelo. Así mismo, en los tratamientos con Zn-salfen, se observó que los tratamientos con ZnSA30 y ZnSB30 redujeron la concentración del metal al final del experimento al mismo nivel que el control, respecto al inicio de las perturbaciones. Los resultados referentes a las perturbaciones causadas con ZnSA50 y ZnSB50 mostraron un ligero aumento sin embargo, la reducción de la concentración de metal no se alcanzó como en el control (Figura 4B), esto puede deberse a la disminución del pH, favoreciéndose la asimilación de compuestos metálicos en el suelo, incluyendo los aplicados y los que se encontraban naturalmente asociados a las partículas del suelo, al inducir la resistencia en la microbiota presente, por medio de la aparición de genes de resistencia (^{Galán Huertos y Romero Baena, 2008}; ^{Ojuederie y Babalola, 2017}). De esta manera, los resultados obtenidos en el presente trabajo, podrían sugerir su posible utilización como una alternativa para la biorremediación de suelos contaminados con níquel y zinc, sin embargo, es necesario seguir investigando sobre la citotoxicidad de dichos compuestos sobre la microbiota y plantas que yacen en el suelo. En la última década, diferentes esfuerzos han sido realizados con el objetivo de implementar técnicas de biorremediación que utilicen microorganismos en conjunto con plantas (fitoextracción), que movilicen los metales de la matriz del suelo por biosorción (^{Khan et al., 2016}; ^{Ojuederie y Babalola, 2017}).

Figura 4 Movilización de níquel y zinc bajo la perturbación con M-salfen.
Figure 4. Mobilization of nickel and zinc under disturbance with M-Salphen. 

Recuperación de la funcionalidad del ciclo del nitrógeno

El análisis de coeficientes canónicos, mostrados en la Figura 5, muestra que la recuperación de la funcionalidad del ciclo del nitrógeno a lo largo del estudio no fue lineal. A los 15 días posteriores a las perturbaciones, únicamente se observaron diferencias puntuales como la mostrada para el tratamiento ZnSA50 y, posteriormente, a los 30 días para NiSA15. Sin embargo, hasta los 60 días posteriores a la perturbación, los tratamientos fueron claramente diferenciados, mostrando una posible resistencia de la comunidad microbiana hasta los 60 días posteriores a las diferentes perturbaciones con los compuestos M-salfen. A los 120 días, que es el doble del tiempo anterior, se obtuvo un perfil similar de todos los tratamientos respecto al control y, finalmente, a los 240 días posteriores a la perturbación inicial, los tratamientos se diferenciaron entre sí con mayor contraste entre NiSB30 y ZnSA50, ambos respecto al control (Figura 5). Varios autores (^{Azarbad et al., 2015}; ^{Das et al., 2016}) han estudiado la respuesta en la comunidad microbiana y su funcionalidad, a contaminación con metales pesados, conllevando a resultados diferentes entre ellos, pero la mayoría confluye en el hecho de que después de un tiempo relativo de exposición a los metales, aumenta la aparición de genes resistentes. ^{Azarbad et al. (2015)}, discutiendo, además, la dificultad que existe para plantear un mecanismo por contaminación con metales pesados, que cada sistema depende de diversos factores como son el tipo de suelo y metales contaminantes, el tiempo de exposición al metal y la tasa de adaptación de las comunidades microbianas ante la perturbación. Se observó de igual manera, que el amonio fue la especie que menos difirió entre el control y tratamientos durante los 240 días, lo que indicó mayor estabilidad entre el tipo de compuesto utilizado para la perturbación y el tiempo. Desde el punto de vista de la agronomía, el amonio resulta la principal fuente inorgánica de nitrógeno para las plantas y, es comúnmente utilizado como fertilizante. Tan solo en la última década, varios estudios han revelado que su aplicación desencadena múltiples respuestas fisiológicas y morfológicas, así como, cambios específicos en la expresión génica, el metabolismo, el estado redox o la arquitectura del sistema radicular de las plantas (^{Isobe y Ohte, 2014}; ^{Hirsch y Mauchline, 2015}). Además, su propiedad insoluble le confiere la capacidad de no filtrarse hacia aguas subterráneas a través del suelo, aumentándose así la probabilidad de su asimilación por parte de otros organismos, a diferencia del nitrato que es más fácilmente movilizado, pudiendo ocasionar la eutrofización del medio (^{Hirsch y Mauchline, 2015}). Por otro lado, el nitrato fue la especie que indujo mayormente la diferenciación entre tratamientos, sobre todo a los 60 días, en donde se pudo observar una concentración ascendente en NiSB30 < ZnSB30 < NiSA30 < ZnSA30 < NiSB15 < NiSA15< ZnSA50 < ZnSB50, lo cual sugiere que, independientemente del metal y la estructura de M-salfen utilizado, la concentración de 30 mg kg ^-1 de suelo fue la que indujo la mayor concentración de nitrato en el suelo.

Figura 5 Efectos de M-salfen sobre la recuperación de la funcionalidad del ciclo del nitrógeno. Se representa una curva de respuesta principal de las concentraciones de la reserva de nitrógeno inorgánico y pH a lo largo del tiempo. Los coeficientes canónicos indican la distancia entre la concentración de la reserva de nitrógeno inorgánico en las muestras de todos los tratamientos en relación con el control no perturbado.
Figure 5. Effects of M-Salphen on the recovery of nitrogen cycle functionality. A main response curve of the inorganic nitrogen reserve concentrations and pH over time is represented. The canonical coefficients indicate the distance between the concentration of the inorganic nitrogen pool in the samples of all treatments in relation to the undisturbed control. 

Los análisis de componentes principales (PCA), demostraron la correlación de las diferentes variables fisicoquímicas, evaluadas respecto a la reserva de nitrógeno inorgánico como proxy de la funcionalidad del ciclo del nitrógeno en el suelo evaluado, demostrando que, los cambios ocurridos en el sistema, se correlacionaron con el tiempo del efecto causado por la perturbación aplicada con los compuestos tipo M-salfen (Figura 3). El perfil obtenido a los 240 días, mostró el aparente incremento y recuperación de los indicadores del ciclo del nitrógeno en todos los tratamientos, pudiendo indicar que, la comunidad microbiana que dirige el ciclo del nitrógeno, termina al final del estudio en un estado alternativo estable, como lo plantea (^{Shade et al., 2012}), que puede suceder ante perturbaciones ambientales y, lo describe mediante un análisis multivariado, así como en el presente estudio.

Finalmente, basados en el análisis de coeficientes canónicos y PCA, desde el punto de vista económico y agronómico, el mejor momento para obtener beneficios respecto a la aceleración de la nitrificación, corresponde a 60 días después de la aplicación de M-salfen, en específico NiSB15. De manera general, los resultados obtenidos apuntan a que los compuestos M-salfen de níquel aplicados, podrían tener una propiedad catalizadora de la amonificación y nitrificación. ^{Shimazaki (2013)}, reportó previamente que, algunos complejos de tipo M-salfen, han sido utilizados también como catalizadores en conversión molecular orgánica, al igual que ^{Escárcega-Bobadilla et al. (2013)} demostraron la propiedad catalizadora de un compuesto Zn-salfen trinuclear, favoreciendo la fijación de dióxido de carbono en la formación de carbonatos cíclicos orgánicos. Por otro lado, los compuestos M-salfen de zinc, resultaron depresores de la amonificación y nitrificación en el suelo.

Con base en los resultados obtenidos en el presente trabajo, se puede sugerir su posible utilización como una alternativa para la biorremediación de suelos contaminados con níquel y zinc, sin embargo, es necesario seguir investigando sobre la citotoxididad de dichos compuestos.

Así mismo, se ha demostrado que la biorremediación in situ con bacterias, se puede llevar a cabo con microorganismos disimilatorios reductores usando compuestos orgánicos como ligandos donadores de electrones, de tal manera que los metales pesados puedan ser complejados y precipitados (^{Lovley et al., 2004}). Para el presente estudio, los resultados sugieren que pudo ocurrir una estimulación de las bacterias reductoras de nitrito, lo cual provocó una disminución en el pH y causó la liberación de níquel y zinc de las partículas del suelo, simulando una especie de “cosecha” de ambos metales, reflejándose lo anterior en el incremento de níquel y zinc a los 240 días en todos los tratamientos, a excepción del caso de ZnSA30 y ZnSB30. Esto último puede atribuirse a que, la concentración aplicada no fue suficiente para inducir cambio en el pH del suelo, de tal manera que indujeran la disociación de iones de Zn externos.