Investigación básica

 

Regeneración miocárdica en Ambystoma mexicanum después de lesión quirúrgica

 

Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury

 

Alvaro Vargas–González,* Esteban Prado–Zayago,** Martha León–Olea,*** Verónica Guarner–Lans,* Agustina Cano–Martínez*

 

* Departamento de Fisiología, Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez.

** Criadero Tachipa Umbral, Maya 'Ik Centro.

*** Laboratorio de Histología, División de Neurociencias, Instituto Nacional de Psiquiatría.

 

Correspondencia:
Dra. Agustina Cano Martínez.
Departamento de Fisiología, Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez.
(INCICH, Juan Badiano No. 1 Col. Sección XVI, Tlalpan 14080. México D.F.).
Teléfono: 01 (555)5 73 29 11, Ext. 1278. Fax: 01 (555)5 73 09 26.
Correo electrónico: canagu@cardiologia.org.mx

 

Resumen

Se realizó resección ventricular en el corazón de Ambystoma mexicanum, se evaluó si la restitución del tejido resulta de hipertrofia o de hiperplasia. Por medio de una tinción tricrómica se encontró que 5 días después del daño en el espacio de la resección se encontró un coágulo rodeado de fibras de colágena (83 ± 6%), músculo (10 ± 3%) y zonas sin tejido (7 ± 2%). Una proporción de 50 ± 4 y 90 ± 2% correspondió a tejido muscular 10 y 30 días después de la lesión. La tinción con bis–Benzimida indicó que en la zona lesionada hay proliferación celular. En tanto que la inmunohistoquímica doble para actina sarcomérica a y antígeno nuclear de proliferación celular mostró que el tejido que restituyó el espacio se produjo por proliferación de cardiomiocitos con un valor máximo de 68%, 5 días después de la lesión. Nuestros resultados indican que el miocardio de A. mexicanum recupera su estructura mediante la hiperplasia de cardiomiocitos y sugieren que su capacidad regenerativa es mayor que la informada para mamíferos adultos (1%), y para otros vertebrados no mamíferos (32%). Esto hace de A. mexicanum un modelo idóneo para estudiar los mecanismos reguladores de la regeneración miocárdica per se, en vertebrados adultos in vivo.

Palabras clave: Resección ventricular. Cardiomiocitos. Proliferación celular.

 

Summary

Ventricular resection of the heart of Ambystoma mexicanum was performed and the type of tissue that restored the lesion and if it is by hypertrophy or hyperplasia of myocardium, were evaluated. Masson's trichrome stain indicated that 5 days after resection, the gap was occupied with a blood clot surrounded by collagen fibres (83 ± 6%) and muscle (10 ± 3%) and the rest of area (7 ± 2%) free of tissue. A proportion of 50 ± 4 and 90 ± 2% was muscular tissue, 10 and 30 days after injury. The evaluation with bis–Benzimide indicated cell proliferation in the injured area. The double immunohistochemistry for a–sarcomeric actin and proliferating cell nuclear antigen indicated that the tissue that occupied the injury–produced gap was originated by cardiomyocyte proliferation, which presented a maximum of 68%, 5 day after injury. Our results indicate that the myocardium of A. mexicanum recovers its structure through cardiomyocyte hyperplasia and suggest that the myocardial regenerative capacity is higher than the reported for adult mammals (1%) and other non–mammalian vertebrates (32%). This characteristic makes A. mexicanum a suitable model to study the mechanisms that regulate per se, the myocardial regeneration in adult vertebrates in vivo.

Key words: Ventricular resection. Cardiomyocytes. Cell proliferation.

 

Introducción

La capacidad regenerativa difiere entre los vertebrados dependiendo del estado de desarrollo y de su lugar en la escala filogenética, de modo que suele ser mayor en las etapas más tempranas de desarrollo y en los animales más antiguos.¹ En los anfibios urodelos la regeneración ocurre incluso en etapas tardías de la ontogenia, y en una variedad amplia de estructuras anatómicas que incluyen las branquias,² las extremidades y la cola,^3,4 las mandíbulas,⁵ la córnea, el cristalino y la retina,^6,7 después de su resección parcial o total.

Por mucho tiempo se pensó que el músculo cardíaco de los mamíferos adultos era un tejido con cardiomiocitos diferenciados terminalmente^8–10 que no podían reingresar a la etapa de síntesis de ADN y mitosis del ciclo celular. Tal postura se ha puesto en duda debido a que hay evidencias que indican la existencia de cardiomiocitos proliferantes en el corazón de mamíferos adultos después de daño miocárdico.^10–13 Sin embargo se ha reportado el equivalente a sólo 0.0002% de miocitos cardíacos en mitosis y 0.0011% de núcleos de miocito cardíaco en división, en el corazón de humano inmediatamente después de infarto y en insuficiencia cardíaca crónica respectivamente.¹⁰ Mientras que solamente 1% de las células cercanas a la zona lesionada presenta marca para antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) después del ligamiento de la arteria coronaria en ratas adultas.^12,13 El miocardio de los anfibios adultos responde a la lesión experimental con datos que sugieren el reingreso de las células a la etapa de síntesis de ADN y mitosis.^14,15 Sin embargo, entre los tipos celulares que suelen formarse después de lesión del miocardio se encuentran el músculo cardíaco y el tejido conectivo que se observa como una cicatriz fibrótica¹⁵ y no hay evidencias claras del tipo y proporción de las células en proliferación. Por lo anterior en el presente trabajo se evaluó la recuperación estructural del miocardio ventricular de A mexicanum después de lesión quirúrgica. Se evaluó el tipo de tejido con el que se ocupa el espacio resultante, así como si este tejido se produjo por hipertrofia o por hiperplasia.

 

Material y métodos

Material biológico

Se usaron 20 organismos adultos de A mexicanum de 8 a 12 meses de edad, obtenidos por reproducción en cautiverio en el Criadero "Tachipa Umbral" (Permiso SEMARNAP: INE–CITES–DGVS–CR–IN–0249–D.F./97). Los animales se transportaron al laboratorio donde se mantuvieron con luz y temperatura ambiente. Se alimentaron con peces vivos (charales, Chirostoma reganí y Chirostoma jordani jordani), ad libitum. El manejo y cuidado de los animales se hizo según los principios del Comité de Bioética del Instituto Nacional de Cardiología "Ignacio Chávez".

 

Resección ventricular y obtención del corazón

Los organismos se anestesiaron con una inmersión en solución de tricaína en agua 1:1,000 (w:v) (ICN Biomedicals). Se colocaron sobre una base fría a 4º C con el propósito de reducir su metabolismo y se realizó una toracotomía en condiciones de asepsia. Catorce organismos se sometieron a toracotomía y resección de 10 ± 2% del ventrículo, que alcanzó la cavidad ventricular, con una tijera para microcirugía. La herida se limpió y la cavidad torácica se cerró con hilo quirúrgico 3–0 después de la formación de un coágulo. Una vez recuperados de la anestesia, los animales se regresaron a las peceras, con las condiciones descritas previamente. La tasa de sobrevivencia fue de 85.7% después de la resección. En los organismos control (n = 6) se efectuó toracotomía sin resección ventricular. Los organismos se sacrificaron por decapitación en los días 5, 10 y 30 después de la cirugía, y se extrajo el corazón de 4 organismos lesionados y 2 controles en cada tiempo. Los animales recibieron una inyección i.p. de colchicina (300 mg/ kg) (Sigma Chemical), con el propósito de detener las células en división.^16,17

 

Procesamiento del tejido

Los corazones aislados se lavaron con solución salina, y se fijaron con formol al 10% en solución salina amortiguada con fosfatos (PBS), durante 8 horas, y se equilibraron en sacarosa al 30% a 4ºC. Se hicieron cortes por congelación en crióstato, transversales y seriados, de 10 µm de grosor, que se montaron en portaobjetos gelatinizados.

 

Tinción tricrómica de Masson

En un lote de cortes histológicos se revisó la estructura de la pared del ventrículo cardíaco con la técnica tricrómica de Masson (kit comercial, AccustainTrichrome Stain, Sigma Diagnostics), la cual tiñe el músculo de color rojo y el tejido fibroso de color azul, para identificar el tipo de tejido que restituyó la lesión. Los cortes se incubarón en solución de Bouin a 60° C durante 60 minutos, se tiñeron con hematoxilina de Weigert, seguida de una tinción con Escarlata de Biebrich y fucsina acida durante 5 minutos, y un tratamiento con ácido fosfotúngstico y fosfomolíbdico durante 10 minutos. Se tiñeron con azul de anilina durante 10 minutos, y se enjuagaron con ácido acético al 1% durante 2 minutos. Finalmente se deshidrataron con etanol al 95% y absoluto, y se aclaró con xilol. Se buscó tejido muscular cardíaco y fibras de colágena a través de microscopía de luz. Se revisaron 4 campos a 120X de 6 cortes por laminilla, en 5 laminillas por cada ventrículo. Se calculó el promedio porcentual de músculo y fibras de colágena en la zona de lesión, a través de la medición del área ocupada por estos tipos de tejido en las microfotografías correspondientes impresas, y la proporción de cada uno respecto al área total correspondiente al espacio resultante de la resección.

 

Tinción fluorescente con bis–Benzimida

La ocurrencia de proliferación celular en general, se evaluó con una técnica fluorescente usando bis–Benzimida, un cromógeno que se une de manera específica a los pares de adenina–timina del ADN e incrementa la fluorescencia nativa del ácido nucleico.¹⁸ Una serie de cortes se fijó con glutaraldehído al 2.5% en PBS. El tejido se lavó e incubó en una solución de 125 ug/mL de bis–Benzimida (Sigma, Chemical) durante 60 minutos en temperatura ambiente. Los cortes se lavaron con PBS, y se observaron con microscopía de fluorescencia. Los núcleos ovales o circulares con cromatina arreglada en forma heterogénea se consideraron como núcleos en división.^16,17

 

Inmunohistoquímica doble para actina sarcomérica α y PCNA

En otro lote de cortes se evaluó la presencia de miocitos cardíacos en proceso de proliferación. Se utilizó una técnica inmunohistoquímica doble para actina sarcomérica α y PCNA, usando un kit para inmunotinción doble (kit comercial, Dako EnVision Doblestain System). El tejido se rehidrató con PBS, y se expuso a peróxido de hidrógeno 0.03% para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Los cortes se trataron con suero normal de cabra para evitar la unión inespecífica. Se incubaron con un anticuerpo primario, monoclonal, anti–actina sarcomérica α (α–Sr–1, Dako A/S) de ratón, diluido 1:200 en amortiguador Tris–HCl pH 7.0 y BSA 1%, durante 30 minutos en temperatura ambiente. En seguida se incubó con un anticuerpo secundario anti–IgG de ratón, hecho en cabra, acoplado a un polímero unido a peroxidasa de rábano. Los cortes se expusieron a una mezcla de sustrato para peroxidasa y el cromógeno diaminobenzidina. El tejido teñido para actina sarcomérica α se procesó para la detección de PCNA. Se bloqueó la fosfatasa alcalina endógena. Se aplicó un anticuerpo primario, monoclonal, anti–PCNA (PC10, Dako A/ S) de ratón, diluido 1:100 en amortiguador Tris–HCl pH 7.0 y BSA 1%, durante 30 minutos en temperatura ambiente. Los cortes se incubaron con un anticuerpo secundario anti–IgG de ratón, hecho en cabra, marcado con un polímero acoplado a fosfatasa alcalina, y se expusieron a una mezcla de sustrato para fosfatasa alcalina y el cromógeno rojo rápido. Los cortes se contratiñeron con hematoxilina de Mayer (Sigma, Diagnostics). Lo cual hace que los núcleos PCNA positivos se observen de color azul oscuro a negro, debido a la combinación del rojo (rojo rápido) con el que se marca PCNA y el color azul–violáceo de la hematoxilina, mientras que los PCNA negativos presentaron un color azul–violáceo. La contratinción con hematoxilina es necesaria para efectuar la cuantificación de los núcleos PCNA positivos respecto al total de núcleos localizados en las fibras musculares en la zona regenerante (protocolo DAKO). Se prepararon controles negativos y positivos para actina sarcomérica a usando miocardio de rata, y controles negativos y positivos para el PCNA usando cortes de tejido hepático de sapo en regeneración. Se calculó la proporción de núcleos de cardiomiocitos PCNA positivos respecto a los PCNA negativos localizados en las fibras miocárdicas de la zona regenerante en 15 campos a 400X de al menos 3 cortes de 5 laminillas, por cada ventrículo.

 

Análisis de datos

Se comparó el valor promedio porcentual de músculo y fibras de colágena revelados por la técnica tricrómica, así como el promedio porcentual de núcleos positivos para PCNA en cardiomiocitos, en comparación con el control con la prueba t de Student. Los valores de P < 0.05 se consideraron significativos.

 

Resultados

Características histológicas del miocardio ventricular de A. mexicanum sin daño

La pared ventricular cardíaca de A. mexicanum control está formada por un miocardio compuesto por fibras musculares cuyas células mostraron un núcleo central teñido de negro y un citoplasma teñido de rojo con la técnica tricrómica de Masson. El miocardio carece de vasos sanguíneos evidentes, y se encuentra delimitado por un epicardio que tiene fibras de colágena, mismas que se tiñen de azul con esta técnica (Fig. 1–A).

 

Ocupación de la zona lesionada con tejido nuevo

Con la técnica tricrómica, en el día 5 después de la lesión, se encontró que la zona dañada estaba ocupada, parcialmente, por un coágulo rodeado por 83 ± 6% de fibras de colágena y 10 ± 2% de fibras musculares desorganizadas, con el espacio restante libre de tejido (Fig. 1–B). En el día 10 después de la lesión, en la zona de daño se encontró un 50 ± 4% de músculo cardíaco y sólo residuos de coágulo (Fig. 1–C). En el día 30 después de lesión, el coágulo se reabsorbió y se encontró un 90 ± 2% de tejido muscular cardíaco que ocupó la zona dañada previamente. La organización de las fibras musculares cardíacas y la estructura general de la pared ventricular fueron similares a las encontradas en el tejido control (Fig. 1–D), es decir con las fibras miocárdicas en forma de trabéculas (color rojo) y delimitadas hacia el exterior del ventrículo por el epicardio (color azul). Los valores provienen de al menos 15 campos en donde se localizó la lesión en cada condición experimental, y la región equivalente de cada control.

La Figura 2 muestra los resultados obtenidos con la tinción con bis–Benzimida. Se muestran sólo dos imágenes, correspondientes al control y 30 días después de lesión, por considerarse representativas de estos resultados. En el tejido control teñido con bis–Benzimida, los núcleos se observaron alargados y con su cromatina distribuida en forma homogénea (Fig. 2–A). Treinta días después de la lesión (Fig. 2–B) en la parte más externa del tejido regenerante, en las fibras miocárdicas se encontraron núcleos más largos y anchos, en pares, con más o menos el doble de diámetro respecto a los núcleos del tejido control, con forma oval o circular, y con la marca de bis–Benzimida en forma granular, lo que sugiere la dilución de la bis–Benzimida vía cariocinesis.^16,17,28 Se contaron al menos 500 núcleos en cada condición.

 

Proliferación de miocitos cardíacos

En el tejido control se observaron miocitos cardíacos identificables, con la inmunohistoquímica para actina sarcomérica a y PCNA, por sus estilaciones teñidas de color marrón, con núcleos PCNA positivos en la zona más cercana al epicardio y núcleos PCNA negativos (azul–violáceos) en las fibras miocárdicas (Fig. 3–A). Cinco días después del daño, en la zona cercana a la lesión, las fibras musculares cardíacas presentaron la marca para actina sarcomérica a pero no se observó la organización de las estriaciones. Se observaron fibras musculares multinucleadas y de cada 100 núcleos con marca para PCNA, distinguibles por una coloración negra, 68 correspondieron a núcleos localizados en fibras miocárdicas (68 ± 5%) (Fig. 3–B). Diez días después de la lesión, las fibras aún se observaron sin estriaciones, multinucleadas y con núcleos arreglados en pares con un promedio de 35 núcleos de cada 100 (35 ± 4%) con marca para PCNA (Fig. 3–C). En el día 30 después de daño se encontraron indicios de reorganización de las estriaciones en la zona alejada del borde de la lesión. Sin embargo en la zona más externa de la zona regenerante aún se localizó un promedio de 10 núcleos por cada 100 (10 ± 2%) con marca para PCNA en fibras con ausencia de estriaciones (Fig. 3–D). Los datos provienen del conteo de por lo menos 500 núcleos en cada condición.

 

Discusión

La pared ventricular cardíaca de A. mexicanum adulto presenta características estructurales que la asemejan al tejido cardíaco de vertebrados como los peces cartilaginosos y peces óseos,¹⁹ los reptiles como la tortuga Testudo horsfieldi,²⁰ y los anfibios²¹ incluyendo la rana²² en etapa adulta, ya que tiene una estructura que incluye un miocardio laxo, esponjoso, trabecular y delimitado por epicardio. Así mismo, tales características en el miocardio de A. mexicanum lo asemejan al músculo cardíaco de aves y mamíferos en estado embrionario,²³ cuando las células precardíacas aún pueden proliferar. Lo que sugiere que el miocardio de esta especie podría estar compuesto por miocitos con capacidad para proliferar pese al estado adulto de los organismos. La estructura del ventrículo del corazón embrionario de los vertebrados incluye cordones de miocardio que constituyen las trabéculas ventriculares.^23,24 Las trabéculas en las aves y los mamíferos, se pierden por compactación del ventrículo en la etapa final del desarrollo embrionario,^23,24 de manera que el miocardio queda formado poruña capa interna esponjosay una capa externa compacta.^21,25

En A. mexicanum la compactación del miocardio no ocurre y las trabéculas persisten en la edad adulta, como ocurre en otros anfibios,²⁵ por lo que es semejante al miocardio embrionario de aves y mamíferos.

Por otra parte, el miocardio ventricular de A. mexicanum carece de vasos sanguíneos evidentes, como se ha informado para otros urodelos.²⁶ Podría ser que las características esponjosa y trabecular del miocardio permitan que la sangre luminal, circulante a través del corazón, entre a los espacios trabeculares, bañe a cada célula del miocardio aun en ausencia de vasos, y que el oxígeno difunda desde la sangre al miocardio.¹⁹

 

Reparación de la lesión resultante de la resección ventricular

En este estudio presentamos evidencias de que después de eliminar una fracción de 10 ± 2% de la pared ventricular del corazón de A. mexicanum, el espacio se restituye gradualmente por tejido miocárdico que resulta de un proceso de hiperplasia. A diferencia de estudios previos realizados en anfibios, en los cuales no se precisa el fenotipo celular que prolifera y en los que se informa la formación de una cicatriz fibrosa.¹⁵ Nuestros resultados concuerdan con otro estudio realizado con la misma estrategia de lesión, y en la misma especie usada por nosotros;²⁷ sin embargo, el autor informó un valor máximo de proliferación de 12.8% en el día 21 después de la lesión, que es menor que el que encontramos nosotros (68 ± 5%) al día 5. Tal discordancia podría explicarse por la diferencia en el tiempo de análisis después de la lesión. Nosotros informamos la mayor proporción de cardiomiocitos en proliferación a los 5 días después de la lesión, en tanto que en el otro trabajo lo hacen a los 21 días después del daño. En nuestros resultados a los 10 y 30 días después de la lesión, la proporción de núcleos con marca para PCNA disminuye conforme transcurre el tiempo después de la lesión, lo cual concuerda con los resultados informados a los 21 días. Otra posibilidad es que las diferencias se relacionen con el hecho de que tal estudio se hizo con animales más viejos (4 años) ya que se ha propuesto que la capacidad regenerativa decrece con la edad¹ y nuestros resultados provienen de organismos de 1 año de edad. Por otro lado, nuestros resultados son concordantes con lo informado para pez cebra, en el sentido de que después de resección ventricular se presenta una recuperación gradual mediante la proliferación de cardiomiocitos, misma que aumenta progresivamente hasta un máximo al día 14 y después decrece hacia el día 30 a un 20% y hacia el día 60 aún permanece en 7%.²⁸ La presencia de fibras cardíacas multinucleadas, que es una característica poco frecuente en el tejido cardíaco sin daño, tanto enA. mexicanum como en N. Viridescens,²⁹ así como la desorganización de las estilaciones de los miocitos cardíacos encontradas en el día 5 después de la resección, se observa también en los miocitos proliferantes in vitro^30,31 Este cambio morfológico se considera como componente de la desdiferenciación que hace posible la proliferación de miocitos cardíacos.^30,31 Mientras que los signos de reorganización de las estilaciones en la zona más interna de la zona regenerante, junto con el hecho de que en el borde los núcleos se observaron más grandes y con la cromatina condensada como lo indica la tinción con bis–Benzimida, observados en el día 30 después del daño, sugiere una secuencia de desdiferenciación, proliferación y rediferenciación celular de la zona del epicardio hacia el miocardio. Se considera que este tipo de secuencia forma parte del mecanismo general de regeneración tisular en los anfibios urodelos adultos.³²

El hecho de que A. mexicanum es una especie cuyos organismos creceny alcanzan la madurez sexual pero conservan las características juveniles,³³ conlleva la retención de células indiferenciadas parcialmente en sus tejidos.³⁴ Esto podría incluir la retención de células precardíacas que proliferan y se diferencian hasta formar cardiomiocitos nuevos in situ cuando las condiciones lo requieren.

Los resultados del presente trabajo se apoyan en evidencias recientes de nuestro laboratorio en las que después del daño quirúrgico se afecta la frecuencia y fuerza de contracción del corazón de A. mexicanum (datos no mostrados). Parámetros que se recuperan gradualmente hasta llegar a sus valores básales entre el día 30 y 90 después de lesión quirúrgica.³⁵

En este trabajo se presentan evidencias de que el miocardio ventricular de A mexicanum recupera su estructura después del daño a través de la hiperplasia de miocitos cardíacos. Con un valor máximo de 68 ± 5% 5 días después de la lesión, en comparación con el valor máximo informado para otros vertebrados no mamíferos como N. viridescens¹⁵ (10%) y para pez cebra²⁸ (32%), 20 y 14 días después del daño, respectivamente. Lo que indica que el corazón de A mexicanum tiene una capacidad regenerativa mayor, lo que hace de esta especie un modelo idóneo para estudiar el proceso de regeneración del miocardio en los vertebrados adultos in vivo.

 

Conclusiones

Los resultados del presente trabajo nos permiten concluir que en el corazón del anfibio urodelo, A. mexicanum:

1. El espacio que queda después de la resección ventricular es ocupado de manera gradual por tejido muscular principalmente, sin presentarse fibrosis de reemplazo.

2. Tal tejido proviene de un proceso de hiperplasia de cardiomiocitos, no de hipertrofia.

3. La regeneración general incluye la restitución del tejido eliminado, así como su forma, sin rebasar los límites físicos del contorno del ventrículo, por lo que se trata de una regeneración de tipo epimórfica (Carlson, 2003).

4. Representa un modelo potencial para estudiar los mecanismos que regulan la regeneración miocárdica en vertebrados adultos in vivo, incluyendo la participación de factores de crecimiento, la regulación génica de la desdiferenciación, proliferación, rediferenciación, transdiferenciación y fusión celular potencialmente relacionadas con el proceso regenerativo. Lo cual permitiría tener los fundamentos básicos para a futuro abordar aspectos terapéuticos pertinentes.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen al Instituto Nacional de Cardiología "Ignacio Chávez" por el apoyo otorgado a través del proyecto 00–303 a ACM, y a la Universidad Nacional Autónoma de México por el apoyo por parte del Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado en su versión de Tesis Doctoral, proyecto 202331, a AVG.

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