Conectando con el metabolismo

Aunque las modificaciones genéticas han sido exitosas, la ingeniería genética aún se enfrenta con problemas metabólicos propios de la célula que disminuyen la producción de biomoléculas de interés comercial, dificultades que hoy en día no se han resuelto. Aunque los modelos convencionales como S. cerevisiae y Escherichia coli son fáciles de modificar, presentan limitaciones para utilizar a la lignocelulosa como fuente de carbono, debido a que no tienen la maquinaria necesaria para degradar a la lignocelulosa y asimilar a la xilosa, uno de los componentes más abundante de la lignocelulosa. La asimilación de la xilosa se realiza por la xilosa reductasa que toma a la xilosa y la transforma en xilitol, el cual, es oxidado por la xilitol deshidrogenasa a xilulosa, que al ser fosforilada por la xilulocinasa produce la xilulosa-5-fosfato, que se metaboliza en la vía de las pentosas fosfato. S. cerevisiae es capaz de crecer en xilulosa pero no en xilosa, y sólo utiliza a esta última en presencia de glucosa cuando se sobreexpresan los genes de una aldosa reductasa inespecífica, GRE3, y de la xilitol deshidrogenasa, ScXYL2 (^{Toivari, Salusjarvi, Ruohonen & Penttila, 2004}). Para que S. cerevisiae sea capaz de asimilar xilosa, la vía del catabolismo de la xilosa se ha insertado en el genoma de la levadura utilizando el sistema CRISPR/cas9, obteniéndose como producto el alcohol primario butanodiol. La deshidrogenación del butanodiol produce saborizantes, combustible, resinas, pinturas y solventes. Su hidrogenación genera octano, combustible de alta calidad para la aviación (^{Das et al., 2020}; ^{Hakizimana, Matabaro & Lee, 2020}).

En E. coli se ha explorado la vía de Weimberg para lograr la conversión de xilulosa a 2-oxoglutarato (alfa-cetoglutarato), intermediario del ciclo de Krebs, sin la pérdida de átomos de carbono en forma de CO_2, que ocurre cuando se produce el 2-oxoglutarato a partir de la xilulosa-5-fosfato o el piruvato a partir del 2-ceto-3 desoxi-D-xilonato (vía de Damh), la cual al entrar a la vía de las pentosas fosfato produce el gliceraldehído3-fosfato, un intermediario de la glucólisis (Figura 1) (^{Rossoni et al., 2018}). Aunque esta es una cepa prometedora, quedan por resolver los efectos de los subproductos de la degradación de la lignocelulosa.

Figura 1 Asimilación de la D-xilosa a través de las vías de las pentosas fosfato, Weimberg y Dahms. Las reacciones de las vías de las pentosas fosfato y Dahms son nativas de E. coli. Las cinco reacciones de la vía de Weimberg (color naranja) requieren enzimas de Caulobacter crescentus. La hidrólisis de la xilonolactona puede ocurrir espontáneamente y, en E. coli, la deshidratación del xilonato es catalizada por la actividad de yjhG/yagF (familia de D-xinolato deshidratasa). Modificada de (^{Rossoni et al., 2018}). 

Otro reto de la bioingeniería es la inserción de los genes que codifican para las moléculas de interés y que éstas no resulten tóxicas para el microorganismo. En S. cerevisiae se ha logrado la inserción de la bisaboleno monoterpeno sintasa y la cineol sintasa, que participan en la síntesis de terpenos que se pueden utilizar como biocombustible. De manera natural, la levadura tiene a la sintasa bifuncional farnesil pirofosfato sintasa, codificada por el gen Erg20, la cual tiene actividad de geranil pirofosfato y farnesil pirofosfato sintasa. A partir del isopentenil pirofosfato y del dimetilalil pirofosfato, esta enzima sintetiza el geranil pirofosfato (GPP, C10), pero casi no lo libera al medio, sino que lo utiliza para la síntesis del farnesil pirofosfato. Debido a esto, la poza de GPP es pequeña, lo cual afecta la síntesis del monoterpeno cineol y la del sesquiterpeno bisaboleno, que al ser hidrogenado genera el bisabolano, el cual tiene propiedades de biocombustible (Figura 2). Los sesquiterpenos son el resultado de la condensación de dos moléculas de IPP con una de DMAPP, el incremento en la síntesis de sesquiterpenos se ha intentado en E.coli y S. cerevisiae a través de la sobreexpresión de la farnesil pirofosfato sintasa o la bisabolano sintasa (^{Das et al., 2020}). Sin embargo, la poza de GPP es clave para la producción de estos terpenos, ya que si ésta es pequeña, no se incrementa la producción de los terpenos (Figura 3). Para incrementar el flujo se han creado mutantes como la ERG20 k197G, que expresa a la geraniol sintasa de Ocimum basilicum y puede producir 5 mg/L de geraniol (^{Zhao et al., 2017}).

Figura 2 Vías metabólicas de R. toruloides. Glucólisis, ciclo de Krebs en la mitocondria, biosíntesis y degradación de ácidos grasos, triacilgliceroles y fosfolípidos, biosíntesis de isoprenoides. Abreviaturas: GA-3P, gliceraldehído-3-fosfato; DHA, dihidroxiacetona; DHAP, dihidroxiacetona fosfato; G3P, glicerol-3-fosfato; LPA, ácido lisofosfatídico; PA, ácido fosfatídico; DAG, diacilglicerol; TAG, triacilglicerol; SE, ésteres de esterol; AGL, ácidos grasos libres; CL, cuerpos lipídicos; OAA, oxaloacetato; α-KG, α-cetoglutarato; AcAcCoA, aceto-acetil-CoA; HMG-CoA, hidroximetilglutaril-CoA; MVA, mevalonato; MVA-5P, mevalonato-5-fosfato; MVA-5PP, mevalonato-5-difosfato; IPP, isopentenil difosfato; DMAPP, dimetilalil pirofosfato; GPP, geranil pirofosfato; FPP, farnesil pirofosfato, GGPP, geranilgeranil pirofosfato; AMP, adenosín monofosfato; IMP, inosina monofosfato. Modificada de (^{Wen et al., 2020}). 

Figura 3 Biosíntesis de isoprenoides. La vía del MEP/MVA produce los intermediarios DMAPP e IPP. El DMAPP, es el precursor de los isoprenos e isopentanol. La condensación del DMAPP e IPP produce el GPP y el FPP, precursores de los monoterpenos (pineno y limoneno) y los sesquiterpenos (bisabolano, amorfadieno y farneseno), respectivamente. Abreviaturas: DXP, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato; DXS, DXP sintasa; DXR, DXP reductoisomerasa; MEP, 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato; IspD (-)-trans-isopiperitenol deshidrogenasa; CDP-ME, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol; MEcPP, 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato; IspF, MEcPP sintasa; HMB-PP, hidroximetilbutenil pirofosfato; IspG, HMB-PP sintasa; IspH, HMB-PP reductasa; dimetilalil pirofosfato; AtoB, acetoacetilCoA tiolasa; HMG-S, HMG-CoA sintasa; HMG-R, HMG-CoA reductasa; MK, mevalonato cinasa; MVA-5P, mevalonato 5-fosfato; PMK, fosfomevalonato cinasa; MVA-5PP, mevalonato 5-pirofosfato; PMD, fosfomevalonato descarboxilasa; IPP, isopentinil pirofosfato; FPP, farnesil pirofosfato; IspA, FPP sintasa; GPP, geranil pirofosfato. Modificada de (^{Li et al., 2020}). 

Por otra parte, debido a su naturaleza lipofílica, los terpenos son tóxicos para las células: el monoterpeno β-pineno incrementa la fluidez de la membrana mitocondrial, inhibe la respiración y en consecuencia la síntesis de ATP; además, inhibe el transporte de K⁺ e H⁺ a través de la membrana plasmática.

Algunos terpenos de importancia comercial

El limoneno es un monoterpeno cíclico producto de la degradación enzimática de la cáscara de naranja o limón. Este monoterpeno se ha explorado como combustible para aviones y como aditivo de combustibles para mejorar el rendimiento en climas fríos (^{Zhang & Zhao, 2015}); sin embargo, es tóxico para los microorganismos. La concentración mínima inhibitoria para el crecimiento de S. cerevisiae es de 0.44 mM, por lo que se ha propuesto el uso de un sistema de extracción por solventes para retirar al monoterpeno e incrementar la tolerancia de esta levadura y lograr una mayor producción (^{Brennan, Turner, Kromer & Nielsen, 2012}), un proceso que aumenta los costos de producción, pero que evita la inhibición de la producción de bioetanol y biogás (^{Pourbafrani, Forgacs, Horvath, Niklasson & Taherzadeh, 2010}). También es un agente quimioterapéutico, induce el incremento de los factores pro-apoptóticos y disminuye los anti-apoptóticos, inhibe la isoprenilación de las proteínas G pequeñas, a las ATPasas Na⁺/K⁺ e induce a los proto-oncogenes (^{Mukhtar, Adu-Frimpong, Xu & Yu, 2018}).

El farneseno (C15), al igual que el limoneno, requiere de una hidrogenación química para saturar sus dobles enlaces y producir combustibles alcanos. La forma reducida del farneseno es el farnesano, el cual se usa como biocombustible. El farneseno, un sesquiterpeno que deriva del FPP, lo produce la farneseno sintasa y comúnmente se usa como componente de fragancias y saborizantes (Figura 3). En la naturaleza es un atrayente para la polinización y una alarma de feromonas de insectos. Con la expresión de la vía del mevalonato en E. coli se ha alcanzado una producción de farneseno de 728 mg/L a las 72 h y por arriba de 1.1 g/L después de las 120 hr de incubación. En S. cerevisiae (PE-2), utilizando cepas modificadas, se ha alcanzado una producción de farneseno mayor al 50% del rendimiento de masa teórica (estimación de la producción máxima posible de un producto que puede obtenerse en una reacción química). El farnesano tiene un número de cetano (calidad de ignición) de 58, un punto de nube (temperatura de formación de cristales) de -78 ºC, el del diesel D2 es de -3 ºC. La densidad del farnesano es 0.77 g/mL, más baja que la del bisabolano (^{George et al. 2015}; ^{Gupta & Phulara 2015}). Estos valores se comparan con los del diesel, número de cetano 51 mínimo, índice de cetano 46 mínimo, densidad 820 Kg/m³ mínimo, punto de ignición > 55 ºC (https://www.chevron.com/-/media/chevron/operations/documents/diesel-fuel-tech-review.pdf).

La producción de bisabolano por E. coli y S. cerevisiae se ha realizado a través de la inserción de sintasas de bisaboleno provenientes de plantas. La bisaboleno sintasa de Abies grandis es la más prometedora, y junto con la ingeniería del flujo de FPP, se han producido hasta 900 mg/L del terpeno en ambos microorganismos. El bisabolano (D2 diesel) tiene un número de cetano de 52, un punto de nube de -25, una densidad de 850 Kg/m³ , y un punto de inflamabilidad de 60-80 ºC (^{George et al., 2015}). Los alcoholes de cadena corta (metanol, butanol, propanol, etanol) también pueden ser esterificados para obtener biocombustibles (^{Salis, Pinna, Monduzzi & Solinas, 2005}), ya sea por biocatálisis, utilizando lipasas, o por catálisis alcalina, ambos procesos costosos.

El farnesol es un alcohol sesquiterpenoide lineal derivado de la desfosforilación del FPP (Figura 3). Farmacéuticamente es relevante como antimicrobiano, precursor de fármacos anticáncer, biopesticida y biocombustible. En E. coli la desfosforilación del FPP se realiza por la fosfatasa endógena NudB, que tiene la capacidad de tomar al IPP/DMAPP y transformarlos en isopentenol. El farnesol se ha producido en S. cerevisiae en una cepa con la escualeno sintasa regulada a la baja, produciéndose 80 mg/L, mientras que con la sobreexpresión de la hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA R) se genera 145.7 mg/L. En E. coli se producen 135 mg/L. La ingeniería de una de las fosfatasas endógenas de E.coli podría aumentar la producción del farnesol (^{Gupta & Phulara, 2015}; ^{Zada et al., 2018}).

Levaduras productoras de biocombustible

En el campo de la producción de biocombustibles también se emplean otras levaduras como Yarrowia lipolytica y Rhodosporidium toruloides.

La levadura oleaginosa Y. lipolytica, es capaz de producir hasta el 80% de su peso seco en lípidos, los cuales pueden ser usados para la obtención de biocombustibles debido a su parecido con los aceites vegetales que, por medio de reacciones de transesterificación, se convierten en biodiesel del tipo D2, utilizado en camiones de carga, trenes, vehículos, entre otros (^{Xu, Qiao, Ahn & Stephanopoulos, 2016}). La transesterificación es el reemplazo del grupo alcohol de un éster por otro alcohol, como el etanol, metanol, propanol, butanol, isopropanol, ter-butanol y octanol. Esta reacción se lleva a cabo en la presencia de catalizadores básicos homogéneos como el NaOH o KOH, carbonatos u óxidos. El metanol genera ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMES) más volátiles, sin embargo, el metanol es más tóxico. Los ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE) son más viscosos, presentan puntos de nube y fluidez más bajos que los FAMES (^{Yusoff, Xu & Guo, 2014}).

Otro bio-producto derivado de los lípidos ricos en ácidos grasos insaturados es el ácido linoleico (omega-6), que se usa como suplemento alimenticio. Este ácido se produce en condiciones en donde la β-oxidación y la capacidad de almacenar triacilgliceroles (TAG) están suprimidas y el gen de la Δ12-desaturasa se sobreexpresa, produciendo 320 mg/L del ácido linoleico, que debido a su toxicidad debe de exportarse al medio extracelular. Las cepas incapaces de degradar lípidos vía β-oxidación o almacenarlos en forma de TAG son más sensibles a los ácidos grasos libres (^{Imatoukene et al., 2017}). Otros genes del metabolismo de los lípidos que se han modificado con gran éxito son: 1) la sobreexpresión del gen de la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD1) junto con la eliminación de su isoforma GUT2, en una cepa con la β-oxidación truncada, se duplica la producción de lípidos; 2) la sobreexpresión del gen de la acetil-CoA carboxilasa (ACC1) junto con la eliminación del gen de la diacilglicerol aciltransferasa (DGA1) o la sobreexpresión del gen de la DGA1 y la eliminación del gen del factor de la biogénesis peroxisomal 10 (pex10) y del gen de la hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa peroxisomal (mfe1), se aumenta la producción de lípidos hasta cinco veces comparada con la de la cepa silvestre (^{Gajdos, Ledesma-Amaro, Nicaud, Certik & Rossignol, 2016}; ^{Niehus, Crutz-Le Coq, Sandoval, Nicaud & Ledesma-Amaro, 2018}). En esta levadura también se produce el ácido ricinoleico, que se sintetiza en una cepa con la β-oxidación truncada y con la Δ12-hidroxilasa de ácidos grasos (RcFAH12) sobreexpresada, logrando un aumento en la producción de lípidos de hasta un 43% (^{Beopoulos et al., 2014}).

La cepa silvestre de Y. lipolytica es incapaz de incorporar la xilosa a su metabolismo, pero la cepa Y. lipolityca- Po1d, que expresa heterólogamente la xilosa reductasa y la xilitol deshidrogenasa, junto con la sobreexpresión de la xilulosa cinasa nativa, asimila la xilulosa de residuos de agave como única fuente de carbono y la dirige a la acumulación de lípidos (^{Niehus et al., 2018}). Esta levadura es una de las más estudiadas en cuanto a la producción de lípidos y sus diferentes aplicaciones, pero no es la única, existen otros microorganimos con características metabólicas prometedoras como el basidiomiceto Rhodosporidium toruloides, una levadura oleaginosa roja, perteneciente al subphylum Pucciniomycotina, que se aisló de la pulpa de madera, aunque también puede encontrarse en el suelo, el agua de mar y en aguas residuales así como en las hojas de las plantas. Es una levadura con la capacidad de acumular más del 76% de lípidos en relación a su peso seco. Las limitaciones de fosfato y sulfato favorecen la acumulación de lípidos en R. toruloides (^{Dinh et al., 2019}; ^{Zhao, Peng, Du, Liu & Liu, 2012}). Además, de manera natural produce carotenoides, los cuales se derivan del acetil-CoA y tienen un alto potencial como biodiesel. La capacidad de producir carotenoides es una característica valiosa para la biotecnología, debido a que no todas las levaduras son capaces de producirlos. Los carotenoides son moléculas que protegen contra la radiación ultravioleta y el estrés oxidativo (^{Liu et al., 2018}). Actualmente, R. toruloides es un modelo para la producción de monoterpenos con potencial uso como biocombustibles, principalmente el jet fuel, a través de la inserción en su genoma de diferentes monoterpeno sintasas provenientes de plantas y otros hongos. Es una levadura con amplia capacidad metabólica. Como fuente de carbono puede asimilar hexosas, pentosas, ácidos orgánicos (D-galacturónico), etanol, glicerol y generar grandes cantidades de biomasa (100 g/L masa en peso seco) (^{Wen, Zhang, Odoh, Jin & Zhao, 2020}; ^{Zhao et al., 2012}). Estas características son relevantes para la bioingeniería, que en los últimos años ha hecho un gran esfuerzo para producir biocombustibles económicos a partir de fuentes de carbono de fácil obtención y poco contaminantes, como el maíz o la lignocelulosa.

R. toruloides cultivada en cáscara de naranja, pera, mango papaya, coliflor o repollo, como fuente de carbono, produce un 49% en peso seco de lípidos saturados: mirístico, palmítico, esteárico, lignocérico y cerótico y 50% en peso seco de lípidos insaturados; oleico, margárico, linoleico (omega-6) y nonadecanoico. Estos ácidos grasos, por transesterificación ácida, se convierten en biodiesel con una tasa de conversión de hasta el 35.6% (^{Singh et al., 2018}).

La lignocelulosa, un componente de la pared celular de las plantas, está formada por celulosa, hemicelulosa y lignina. Se ha propuesto a la lignocelulosa como materia prima para la producción de los biocombustibles: gasolina, diesel, jet fuel y bioetanol. Aunque la lignocelulosa es una fuente de carbono de rápido acceso, lo cual la hace económicamente atractiva, tiene como desventaja que para poder ser utilizada es necesario un proceso de hidrólisis que libere a los azúcares fermentables: glucosa, xilosa, arabinosa, manosa y galactosa (^{de Paula et al., 2019}). Los procesos de hidrólisis pueden consistir en tratamientos con celulasas, hemicelulasas, reacciones de oxidación catalizadas por peroxidasas y lacasas, tratamientos alcalinos o por sistema de iones líquidos. La hidrólisis y la degradación de las pentosas de la lignocelulosa generan alcoholes, aldehídos (furfural) y la lignina, que tiene como principal componente al ácido p-cumárico (^{Rodriguez et al., 2019}). Estos compuestos son tóxicos para la mayoría de las levaduras, como S. cerevisiae y Y. lipolityca, mientras que R. toruloides parece tolerar algunos de estos subproductos: el crecimiento de la levadura se ve afectado por concentraciones de 6 g/L de ácido fórmico, mientras que con 2 g/L hay generación de biomasa siempre que los otros compuestos tóxicos estén a bajas concentraciones (^{Yaegashi et al., 2017}; ^{Zhao et al., 2012}). S. cerevisiae tolera < 5 g/L de ácido acético y un pH de 4.5 externo, R. toruloides tolera hasta 10 g/L del mismo ácido en presencia de glucosa y arabinosa, mientras que, si sólo está presente el ácido en el medio, la levadura solamente tolera hasta 5 g/L; en presencia de glucosa, xilosa y 1 g/L de furfural, la producción de biomasa disminuye 60%. La descomposición de la lignina genera fenoles de bajo peso molecular, como la vainillina, la cual inhibe el crecimiento a una concentración de 2 g/L. (^{Zhao et al., 2012}). El método de obtención del hidrolizado de lignocelulosa que genera menor concentración de compuestos inhibidores del crecimiento de microorganismos es el DMR-EH (del inglés, Deacetylation and Mechanical Refining and Enzymatic Hydrolysis), a través del cual se generan hasta 230 g/L de azúcares monoméricos (^{Chen et al., 2016}). El pulverizado de maíz genera una disponibilidad de lignina del 15%, mientras que el tratamiento DMR-EH produce un 60%, y disminuye el contenido de xilano en un 31% (^{Salvachúa et al., 2016}). El uso de la lignocelulosa como fuente de carbono para la obtención de biodiesel representa una ventaja sobre otras industrias que también utilizan lípidos como materia prima.

A pesar de la capacidad de R. toruloides de integrar xilosa a su metabolismo y de tener una alta estabilidad a la inserción de genes por recombinación no homóloga, características que incrementan el interés por esta levadura, la producción de metabolitos de interés (terpenos) depende de la composición de la biomasa, del sistema de hidrólisis y del sistema de fermentación: utilizando rastrojo de maíz hidrolizado con un sistema líquido iónico colina/ α-cetoglutarato, la cepa transformada con la bisaboleno sintasa produce 261 mg/mL de bisaboleno en un fermentador de banco (at bench scale), mientras que con un tratamiento alcalino la producción pasa a ser de 680 mg/L en un fermentador de banco alimentado por lotes de alta gravedad. Si se alimenta a la levadura únicamente con glucosa, ésta se consume en 24 h, alcanzando una producción de bisaboleno de aproximadamente 60 mg/L. Aunque hay reportes afirmando que la levadura es capaz de integrar a su metabolismo la xilosa, la asimilación de este azúcar por la levadura es pobre durante las primeras 24 h y se incrementa a lo largo del tiempo (72 h), pero no se ve reflejado el destino de los carbonos en la producción del bisaboleno, que es de 70 mg/L a las 72 h (^{Yaegashi et al., 2017}; ^{Zhuang et al., 2019}). Mientras que en presencia del ácido p-cumárico, la máxima producción es de 80 mg/L y el ácido se consume desde el inicio del cultivo, es decir, el ácido se integra al metabolismo más rápido que la xilosa, pero no tan rápido como la glucosa. Resulta interesante que al combinar las tres fuentes de carbono antes mencionadas, el consumo del ácido p-cumárico toma ventaja sobre la glucosa y la xilosa, alcanzando una producción entre 90-100 mg/L de bisaboleno en 4 días de cultivo (^{Yaegashi et al., 2017}). Otro factor a considerar en la producción de terpenos como el bisaboleno es el pH del medio. Aunque R. toruloides crece y produce los monoterpenos y ácidos orgánicos a pH de 3.4, el pH óptimo de producción es de 7.4 (^{Zhuang et al., 2019}).

Esta levadura es flexible y las condiciones de cultivo pueden adaptarse a los requerimientos. Por ejemplo, al cultivar a la levadura en un biorreactor de 20 L, utilizando hidrolizados de biomasa (lignocelulosa), se alcanza una producción de 2.2 g/L de bisaboleno ( ^{Zhao et al., 2012}).

La levadura R. toruloides tiene mayor relevancia como microorganismo productor de monoterpenos con aplicaciones biotecnológicas. Cuando se cultiva una cepa de R. toruloides que expresa a la bisaboleno sintasa en un medio sintético (2% glucosa p/v) se producen 294 mg/L de bisaboleno. Mientras que, la expresión de la misma enzima en S. cerevisiae y el cultivo de la cepa bajo las mismas condiciones generan 20 mg/L del bisaboleno. Sin embargo, aunque la diferencia en la producción es clara, es importante remarcar que R. toruloides es una cepa oleaginosa, mientras que S. cerevisiae no lo es, lo cual marca una diferencia metabólica. Por otra parte, el método de transformación ATMT (Agrobacterium Tumefaciens Mediated-Transformation) modifica el número de copias del gen de la bisaboleno sintasa en R. toruloides, que también se asocia con un aumento en la producción del bisaboleno, y aunque S. cerevisiae se transforme utilizando el mismo método, no se produce un aumento de su capacidad productora de los monoterpenos, lo que ha llevado a sugerir que R. toruloides es el mejor modelo para la producción de monoterpenos como el bisaboleno. El precursor de los terpenos es el isómero 3-isopentenil difosfato que deriva del acetil-CoA junto con el dimetilalil pirofosfato (DAPP). Del 3-isopentenil difosfato se producen el licopeno y el β-caroteno.

Otro terpeno producido por R. toruloides utilizando el método ATMT es el cineol o eucaliptol. La enzima encargada de producirlo es la cineol sintasa, codificada por el gen hyg3 del género de hongos ascomicetos Hypoxylon, que proliferan en la superficie de la madera muerta. La expresión de este gen en R. toruloides resulta en una producción de 15.81 mg/L del monoterpeno cuando se usa un medio rico y de 27.64 mg/L cuando se cultiva la levadura en rastrojo de maíz (^{Shaw et al., 2015}; ^{Zhuang et al., 2019}). El cineol es un monoterpeno que tiene una baja solubilidad y alta densidad de energía, su número de octano (RON) y número de octano de motor (MON) son de 99.2 y 91.0, respectivamente. Sin embargo, tiene la desventaja de tener un punto de congelación de 1 ºC, mientras que el del etanol es de -114 ºC (Zhuang et al., 2019). Respecto a la acumulación de lípidos, al igual que con Y. lipolytica, la inserción de genes relacionados con la síntesis de lípidos resulta en un aumento en la acumulación del 49% cuando la acetil-CoA carboxilasa y la diacilglicerol aciltransferasa se insertan al azar en el genoma de R. toruloides (IFO 0880). Otras enzimas que se han expresado y que incrementan la acumulación de lípidos son: ∆9-ácido graso desaturasa, ∆12 ácido graso desaturasa, generando una cepa con una capacidad de acumulación del 49% peso seco de ácido α-linolénico. La integración de varias copias de 3-cetoacil-CoA sintasa de diferentes plantas en R. toruloides CECT 13085, aumenta la producción de ácidos grasos de cadena muy larga: ácido erúcico (omega-9) y ácido nervónico (omega-9) (^{Pimienta et al., 2019}). La producción de monoterpenos no es el único objetivo en la ingeniería de R. toruloides y otras levaduras como S. cerevisiae (^{Callari, Meier, Ravasio & Heider, 2018}). También es de interés la producción de diterpenos como el ent-kaurene, que se sintetiza a partir del GGPP, vía el intermediario ent-copalil difosfato (CDP). Este diterperno da paso a la obtención de la giberelina, una fitohormona asociada con la tolerancia al estrés en plantas y que tiene una amplia aplicación en la agricultura. A partir del ent-kaurene también es posible la síntesis de compuestos con actividad anti-inflamatoria (ácido kaurenoico), anti-cáncer (limoneno y perillyl alcohol) y propiedades antimicrobianas (thymol) (^{Brennan et al., 2012}; ^{Geiselman et al., 2020}).