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Introducción
La guanábana (Annona muricata L.) es uno de los cultivos con mayor importancia en algunas regiones tropicales del planeta (Mishra, Ahmad, Kumar & Sharma, 2013), caracterizada por su pulpa con alto contenido de azúcares y compuestos bioactivos promotores de la salud (Zorofchian et al., 2015). Actualmente, el estado de Nayarit es considerado como el principal productor de guanábana en México, al generar grandes expectativas de crecimiento dentro del sector agrícola (SIAP, 2019), sin embargo, la alta susceptibilidad a infecciones fúngicas ha sido una limitante para su comercialización a nivel nacional e internacional (Berumen-Varela, Hernández- Oñate, Tiznado-Hernández, 2019). Rhizopus stolonifer es un hongo filamentoso del orden de los Mucorales identificado como el principal agente causal del deterioro fúngico durante el periodo postcosecha del fruto de guanábana dentro del estado de Nayarit (Ramos-Guerrerro et al., 2018). Este tipo de enfermedades han sido relacionadas con una alta dependencia al uso de fungicidas químicos, representando un grave riesgo para la salud humana y el ambiente (Singh & Sharma, 2018). Debido a lo anterior, se ha buscado el desarrollo de alternativas no contaminantes que permitan el control de estos fitopatógenos y que sean seguras para el consumidor (González-Estrada et al., 2020; Jiménez-Zurita et al., 2017).
En la última década, el quitosano surgió como una opción potencial para la prevención y el tratamiento de algunas de las principales enfermedades fúngicas asociadas a frutos tropicales (Gutiérrez-Martínez et al., 2018). Este polisacárido alcalino con propiedades fungicidas, filmogénicas e inductoras (Romanazzi, Feliziani & Sivakumar, 2018), es obtenido a partir de la desacetilación parcial de la quitina presente en algunos hongos y exoesqueletos de crustáceos mediante extracción química o enzimática (Betchem, Nana & Wang, 2019).
Anteriormente, se reportó la aplicación del quitosano grado reactivo con diferentes pesos moleculares (1.74x104 - 3.07x104 Da) para la inhibición del crecimiento micelial de R. stolonifer (30-99 %), destacándose su elevado costo de aplicación y su limitada escalabilidad en campo (Hernández- Laurzado et al., 2008; Ramos-Guerrero et al., 2018). Aunque no existen suficientes estudios que comparen la actividad antifúngica entre distintos productos y grados de pureza del polímero (Feliziani et al., 2013; Zhang et al. , 2019), sin embargo, la aplicación del quitosano grado comercial ha demostrado ser una alternativa económica y efectiva para la protección de los productos agrícolas en postcosecha (Pagliarulo et al., 2015; Xing et al., 2018). De igual forma, la biocompatibilidad del quitosano con otros antifúngicos naturales, como podrían ser los compuestos bioactivos presentes en algunos extractos vegetales (Bajic et al., 2019; Siripatrawan & Harte, 2010), puede generar un mejor espectro de acción antifúngico mediante la mejora de las propiedades funcionales del polímero, así como una mayor estabilidad de los compuestos activos incorporados en su matriz polimérica (Nallamuthu, Devi & Khanum, 2015; Singh & Sharma, 2018; Woranuch, Yoksan & Akashi, 2014; Xie, Hu, Wang & Zeng, 2014). El aprovechamiento de los subproductos agrícolas como fuente de compuestos bioactivos con potencial antifúngico puede representar una alternativa sustentable para el control de las principales enfermedades fúngicas en frutos tropicales (Fiore & Cigic, 2019; Ribeiro-da Silva et al., 2014). En este sentido, se han reportado la presencia del ácido clorogénico, flavonoides, alcoholes y otros compuestos orgánicos derivados del metabolismo secundario en plantas y en los extractos acuosos del mesocarpio del coco (Cocos nucifera L.) (Aguilar-Méndez, Campos-Arias, Quiroz-Reyes & Ronquillo-de Jesús 2019; Cortés-Rivera, González-Estrada & Blancas-Benítez, 2019a; Dey, Chakraborty & Mitra, 2005). Estos compuestos bioactivos se han asociado ampliamente con la capacidad de inhibir el desarrollo y la proliferación de algunos patógenos fúngicos importantes como Botrytis cinerea, Penicillium expansum, P. digitatum y R. stolonifer (Corato, Salimbeni, De Pretis, Avella & Patruno, 2017; Lagrouh, Dakka & Bakri, 2017). En un estudio reciente, se reportó la reducción del desarrollo micelial de P. italicum en un 80 %, así como la disminución en la esporulación en un 98 % y la germinación de esporas en un 99 % mediante la aplicación del extracto acuoso del mesocarpio del coco in vitro (Cortés- Rivera, Blancas-Benítez, Romero-Islas, Gutiérrez-Martínez & González-Estrada, 2019b). El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto antifúngico del quitosano y los extractos acuosos del mesocarpio de C. nucifera aplicados individualmente y en combinación sobre el desarrollo in vitro de R. stolonifer.
Materiales y métodos
Materia prima
El mesocarpio del coco (Cocos nucifera L. var. Criollo) fue adquirido en la ciudad de San Blas, Nayarit, México (21°32′23″N 105°17′08″O) con productores locales; seleccionando muestras con madurez de consumo y sin presencia de daños durante la cosecha. Las muestras se procesaron en polvo fino de acuerdo con el procedimiento descrito por Cortés-Rivera et al. (2019a). Se usó quitosano comercial (PM = > 3.01 x 104 Da, cp = 200, 90 % de desacetilación, América Alimentos S.A. de C.V., Zapopan, Jalisco, México) para los ensayos.
Preparación del extracto acuoso y soluciones de quitosano
Las extracciones acuosas del mesocarpio se llevaron a cabo mediante el método propuesto por Cortés-Rivera et al., (2019a) con algunas modificaciones, 500 mg de mesocarpio en polvo se añadieron en 25 mL de agua destilada estéril y se mantuvo bajo agitación constante a 300 rpm durante 1 h, el extracto se centrifugó (Hermle Z326 K, EE. UU.) a 6,000 rpm, durante 10 minutos a 4 oC y se recuperaron los sobrenadantes.
Los extractos obtenidos se filtraron usando un filtro de jeringa estéril (Unidad de filtro Millex-HN; 0,45 µm de diámetro de poro) y las soluciones se almacenaron en tubos estériles a 4 ºC. Las soluciones de QC se prepararon en concentraciones de 0.5, 1.0 y 1.5 % (p/v) empleando una solución de vinagre blanco como disolvente y 7% de ácido acético (Member’s Mark, México) al 10 % (v/v), las soluciones se sometieron a agitación constante durante 24 h, y el pH se ajustó a 5.6 con una solución de NaOH 1 N, añadiendo 0.1 mL de Tween 80 (Sigma-Aldrich, MO, USA) como tensoactivo. Las interacciones consistieron en mezclas detalladas a continuación: QC 0.5 % + EAC 1 %, QC 1 % + EAC 5 % y QC 1.5 % + EAC 10 %, las soluciones se esterilizaron por separado en autoclave durante (15 min, a 121 oC, 15 PSI) posteriormente se mezclaron usando un vórtice (Vortex Genie 2, Scientific Industries, EE. UU.) hasta obtener una mezcla homogénea.
Reactivación de Rhizopus stolonifer
R. stolonifer fue aislado de los tejidos de la guanábana infectados e identificado por ensayo molecular mediante la amplificación de las regiones ARNr 18s y 28s (Ramos- Guerrero et al., 2018), posteriormente fue reactivado agregando 40 µL de una suspensión de esporas (1x106 esporas/ mL) en cajas Petri y en un medio enriquecido con guanábana, las cajas fueron incubadas a 25 ± 2 ºC durante 8 días, el medio de cultivo se preparó mezclando 24 g de agar bacteriológico (MCD LABMR) con 56 g de cáscara y pulpa de guanábana en madurez de consumo por litro (L) de agua destilada estéril.
Inhibición del crecimiento micelial
Para la realización de esta prueba se cortaron discos de 10 mm de diámetro de cultivos de R. stolonifer con 4 días de desarrollo y se depositaron en cajas de Petri que contenían los tratamientos con diferentes concentraciones de EAC (1, 5, 10 % v/v), QC (0.5, 1.0 y 1.5 % w/v) y las combinaciones (QC 0.5 % + EAC 1 %, QC 1 % + EAC 5 % y QC 1.5 % + EAC 10 %). Las cajas se incubaron a 25 ± 2 °C durante 2 días, las placas control (agar) consistieron solo en agar enriquecido con guanábana. Se empleó un control positivo utilizando un fungicida regional para el tratamiento de la guanábana, Tiabendazol a 300 ppm (MERTECT® 340 F, ADAMA Ltd., México) y un control negativo empleando vinagre al 10 % ajustado a un pH de 5.6 con NaOH 1N. Los resultados se reportaron como porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en comparación con el control (Agar).
Inhibición de la esporulación
El efecto de los tratamientos en el proceso de esporulación se evaluó usando las cajas de Petri como el medio en donde se midió el crecimiento del micelio, se añadieron 10 mL de agua destilada estéril, y se realizó una ruptura por frotación del micelio usando una varilla de vidrio estéril para liberar las esporas. La suspensión se filtró en una gasa estéril y la concentración de esporas se determinó mediante un recuento microscópico utilizando un hemocitómetro (Paul Marienfeld GmbH & Co., Alemania). Para cada tratamiento, se realizaron 100 observaciones utilizando un microscopio óptico (Motic Instruments Inc. BA300, Canadá). Los resultados se expresaron como número de esporas/mL.
Germinación de las esporas
La germinación de las esporas se evaluó depositando 100 µL de una suspensión con las esporas (1×105 esporas/ mL) en discos de medio de guanábana adicionados con los tratamientos. Las muestras se incubaron a 25 ± 2 °C durante 4 h y se observaron microscópicamente, se analizaron 100 esporas por disco. Las esporas se consideran germinadas cuando el tubo germinal tiene al menos el doble del diámetro de una espora (Ramos-Guerrero et al., 2018). Los resultados se expresaron en porcentajes.
Modelo de crecimiento
Se modeló el desarrollo radial de R. stolonifer sobre los diferentes tratamientos utilizando los rangos de temperatura reportados para el almacenamiento del fruto de guanábana. Se empleó el método descrito por Ochoa-Velasco, Navarro- Cruz, Vera-López, Palou & Avila-Sosa (2017) con algunas modificaciones utilizando cajas Petri en un medio de cultivo de guanábana adicionado con las diferentes concentraciones de los EAC, el QC y sus combinaciones. Las cajas Petri fueron inoculadas en el centro con 100 µL de la suspensión con esporas (1×105 esporas/mL) y se almacenaron a temperatura de almacenamiento (25 ºC) y de refrigeración a 15 ºC. Se tomaron fotografías del crecimiento radial en periodos de 2 horas y las capturas fueron binarizadas y fraccionadas en imágenes de círculos concéntricos de crecimiento progresivo hasta la colonización completa de la caja Petri. La cinética de crecimiento radial fue ajustada con el Software Find Graph (UNIPIZ Lab, 1.960, EE. UU.) ajustando las curvas a un modelo modificado de Gompertz mediante la siguiente ecuación:
Donde:
N t = Crecimiento en el tiempo (t).
N 0 =Crecimiento en el tiempo (0).
V máx = Tasa de crecimiento máxima específica.
A = Crecimiento máximo en la fase estacionaria.
ƛ = Duración de la fase de latencia.
Los parámetros del modelo se estimaron mediante un análisis de regresión utilizando el software Statistica 10.0 para Windows. El valor del error cuadrático medio (MSE) y el coeficiente de determinación (R2) se usaron para determinar la fiabilidad del ajuste del modelo.
Análisis estadístico
Se realizó un diseño unifactorial completamente al azar para determinar las diferencias significativas entre los tratamientos utilizados de EAC, QC y las combinaciones. Para las pruebas de inhibición del crecimiento micelial, modelado de crecimiento y esporulación se utilizaron cinco cajas de Petri y cinco discos de agar en las pruebas de germinación de las esporas. Los experimentos se repitieron dos veces de manera independiente. El ANOVA (análisis de varianza) de los datos se aplicó utilizando el software Statistica versión 10.0 para Windows. Las diferencias entre las medias de los datos se compararon mediante la prueba de Fisher LSD, las diferencias (p ≤ 0.05) se consideraron significativas.
Resultados y discusión
Inhibición del crecimiento micelial
El crecimiento micelial de R. stolonifer fue significativamente diferente (p ≤ 0.05) dependiendo del tipo de tratamiento utilizado después de 2 días de incubación (Tabla I). En comparación con el control (agar), todas las concentraciones de los EAC tuvieron un efecto en la reducción del desarrollo micelial de R. stolonifer (Figura 1). Se observó un mejor resultado a una concentración del 10 % (58.81 ± 6.48 % de inhibición). Estudios previos evaluaron la actividad antifúngica, de los extractos acuosos de diferentes subproductos agrícolas (hojas, tallos y semillas), sobre el crecimiento micelial de R. stolonifer, reportando una efectividad in vitro inferior al 10 % de inhibición (Bautista- Baños, Hernández-López, Díaz-Pérez & Cano-Ochoa, 2000; Medda, Hajra, Dey, Bose & Mondal, 2014), que podría estar relacionada a diferencias en el perfil fitoquímico de los tejidos utilizados para realizar la extracción (Aqil et al., 2010), sugiriéndose además una mayor susceptibilidad de R. stolonifer al interactuar con extractos ricos en compuestos fenólicos, flavonoides, terpenos, alcoholes y alcaloides (Bhagwat & Datar, 2014; Manenji, Mudyiwa, Midzi & Tsodzo, 2017; Shreya, Hajra, Dey, Bose & Mondal, 2014; Yang & Jiang, 2015). En este sentido, se reportó un alto contenido en ácidos hidroxicinámicos, ácido clorogénico, galocatequina y algunos alcoholes de cadena corta relacionados con la actividad antifúngica en los EAC (Aguilar-Méndez et al., 2019; Cortés-Rivera, 2019a; Dey et al., 2005). Aunque el mecanismo de acción de estas moléculas orgánicas no se encuentra totalmente esclarecido, el potencial antifúngico de estos metabolitos secundarios se ha relacionado con la presencia de anillos aromáticos y grupos reactivos capaces de interactuar con las moléculas polares presentes en la membrana fúngica, produciendo su rápida permeabilización y generando alteraciones a nivel intracelular relacionadas con la inactivación de las enzimas del metabolismo basal y disrupción de la membrana mitocondrial (Cerqueira, Barcellos, Machado, Aires & Dummer, 2015; Martínez et al., 2017; Mohamed, Saleh, Abdel-Farid & El-Naggar, 2016; Masih, Peter & Tripathi, 2014; Zaker, 2016).
Tabla I Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial, esporulación y germinación de las esporas de R. stolonifer expuesto a diferentes tratamientos por 2 días a 25 ± 2 oC.
| Tratamientos | Inhibición del crecimiento micelial (%) | Esporulación (esporas/mL) | Inhibición de la germinación (%) |
|---|---|---|---|
| Control | 0.0 ± 0.0a | 2.85x106 ± 0.53a | 0.0 ± 0.0a |
| Vinagre 10 % | 0.0 ± 0.0a | 2.73x106 ± 0.48a | 0.0 ± 0.0a |
| Tiabendazol 300 ppm | 100.0 ± 0.04b | 0.0 ± 0.0b | 100.0 ± 0.01b |
| EAC 1 % | 48.32 ± 6.77c | 1.4x105 ± 0.97c | 48.5 ± 6.53c |
| EAC 5 % | 51.13 ± 6.48c | 0.85x105 ± 0.81c | 66.33 ± 6.12d |
| EAC 10 % | 58.81 ± 6.48d | 0.55x105 ± 0.6d | 70.5 ± 2.16e |
| QC 0.5 % | 67.12 ± 7.45e | 0.45x105 ± 0.64d | 98.66 ± 1.75f |
| QC 1 % | 83.27 ±2.90f | 0.35x105 ± 0.41e | 99.33 ± 0.81f |
| QC 1.5 % | 87.77 ± 3.10g | 0.2x105 ± 0.25f | 99.66 ± 0.5f |
| QC 0.5 % + EAC 1 % | 79.44 ± 3.32f | 0.15x105 ± 0.23f | 99.66 ± 0.51f |
| QC 1 % + EAC 5 % | 91.10 ± 1.84g | 0.1x105 ± 0.21f | 99.83 ± 0.40f |
| QC 1.5 % +EAC 10 % | 94.68 ± 2.15h | 0.05x105 ± 0.15f | 99.83 ± 0.40f |
Los valores seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes con un riesgo del 5%. Promedio de diez réplicas ± desviación estándar.
Figura 1 Crecimiento micelial de R. stolonifer expuesto a diferentes tratamientos durante 2 días a 25 ± 2 ºC.
No se observaron diferencias significativas (p < 0.05) entre el control (Agar) y el control negativo (vinagre 10 %) descartando la actividad antifúngica del vinagre. El QC a concentraciones del 1.5 % mostró mayor inhibición (87.77 ± 3.10 %). Anteriormente, fue reportada la capacidad del quitosano para interactuar con las membranas fúngicas de R. stolonifer produciendo permeabilización y pérdida del contenido celular (proteínas y aminoácidos), causando graves alteraciones bioquímicas y morfológicas que dificultan el proceso de infección y desarrollo de las hifas expuestas (García-Rincón et al., 2010; Ghaouth, Arul, Asselin & Benhamou, 1992; González-Estrada et al., 2020; Gutiérrez- Martínez et al., 2018).
Previas investigaciones concluyen que la aplicación del quitosano de bajo peso molecular (< 2.5x104 Da) puede producir un mayor efecto inhibitorio sobre el desarrollo micelial de R. stolonifer (hasta 99%) a partir de concentraciones del 1.5 % (Hernández-Lauzardo et al., 2008; Ramos-Guerrero et al., 2018).
La efectividad del quitosano con base en el peso molecular se ha relacionado con el número de cargas positivas capaces de interactuar de manera electrostática con la pared del patógeno afianzando su actividad antifúngica (Romanazzi et al., 2018). El quitosano de alto peso molecular tiene una menor presencia de grupos amino disponibles en sus cadenas largas debido a posibles entrelazamientos que explican su menor efectividad in vitro (Feliziani et al., 2013; Niaounakis, 2014). Los EAC y el QC no demostraron ser completamente efectivos en aplicaciones individuales en comparación con el control positivo (100 ± 0.0 % de inhibición), sin embargo, la combinación del QC al 1.5 % con los EAC al 10 % resultó ser más efectiva (94.68 ± 2.15 %). Se ha reportado el efecto aditivo o sinérgico de las propiedades funcionales del quitosano al ser combinado con diferentes extractos vegetales (Duran et al., 2016; Khalifa, Barakat, El-Mansy & Soliman, 2017; Muzzalupo, Badolati, Chiappetta, Picci & Muzzalupo, 2020; Sabaghi, Maghsoudlou, Khomeiri & Ziaiifar, 2015). Las investigaciones realizadas mencionan una asociación estable del quitosano con algunos compuestos fenólicos mediante interacciones hidrofóbicas, apilamiento π-π, enlaces múltiples de hidrógeno o uniones covalentes entre los grupos reactivos del quitosano y los grupos polares de los compuestos fenólicos (Siripatrawan & Harte, 2010; Xie et al., 2014; Jiao et al., 2019).
La aplicación de tratamientos que reduzcan o inhiban el rápido desarrollo micelial de R. stolonifer puede ser una estrategia efectiva para el control de las pudriciones blandas en frutos; así como también la afectación de condiciones favorables para la captación de nutrientes se les relaciona con una disminución en la patogenicidad de este hongo (Petrasch et al., 2019).
Esporulación
La producción de esporas en R. stolonifer fue significativamente diferente entre los tratamientos (p ≤ 0.05) después de 2 días de incubación. En la Tabla I se muestra la concentración de esporas por tratamiento. No se encontró diferencia significativa (p > 0.05) entre el control (agar) y el control negativo (vinagre 10 %). Los tratamientos de EAC y QC aplicados individualmente demostraron ser efectivos con valores superiores al 90 % de inhibición. En estudios previos se observó que la aplicación de los extractos acuosos ricos en ácidos fenólicos puede tener un mayor efecto sobre los procesos de esporulación en R. stolonifer (Bautista-Baños et al., 2000; Bautista-Baños, Hernández-López & Bosquez- Molina, 2004). Esto puede deberse a un posible daño estructural en las membranas celulares, así como alteraciones en la actividad enzimática relacionada con los procesos de adaptación y diferenciación de las estructuras formadoras de esporas (Karim et al., 2015; Mohamed et al., 2016).
De igual forma, se observó una reducción similar en la capacidad de producción de las esporas de R. stolonifer (< 99 %) al entrar en contacto con el quitosano de alto peso molecular a partir de concentraciones de 0.5 % (García- Rincón et al., 2010). Esto puede ser por la capacidad del quitosano para producir desequilibrios en la homeostasis iónica del Ca2+ y K+ en la célula fúngica, produciendo el escape de los nucleótidos, fosfatos, sustratos de reacciones enzimáticas relacionados con la respiración, los procesos de diferenciación, así como a la producción de esporas (Bautista- Baños, Ventura-Aguilar, Correa-Pacheco & Corona-Rangel, 2017; Peña, Sánchez & Calahorra, 2013).
No se observaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre las combinacionesdelos EACconel QCdemostrandoserefectivas respecto al control positivo. La aplicación de tratamientos que permitan la inhibición de los procesos de esporulación en hongos filamentosos, es una estrategia importante en la ruptura del ciclo de infección de los patógenos fúngicos (Hee- Soo & Jae-Hyuk, 2012), en este sentido, la aplicación del QC y los EAC puede ayudar a reducir la virulencia de R. stolonifer sobre frutos susceptibles a su ataque.
Germinación de las esporas
El porcentaje de germinación de las esporas en R. stolonifer fue significativamente diferente entre las concentraciones de los EAC (p ≤ 0.05) después de 4 h de incubación (Tabla I) y la concentración del 10 % de EAC resulto ser más efectiva (70.5 ± 2.16 % de inhibición). El proceso de germinación de las esporas es un evento importante para la infección por hongos, los extractos acuosos ricos en compuestos fenólicos como el ácido clorogénico podrían inducir a una mayor inhibición de los mecanismos de germinación, al suprimir la transducción de señales relacionada con la actividad enzimática de las esporas (Karim et al., 2015; Mohamed et al., 2016).
Todos los tratamientos con QC fueron más efectivos para inhibir el proceso de germinación de las esporas (≥ 98.66 ± 1.75 % de inhibición). Se conoce un patrón entre el peso molecular del quitosano y su efecto sobre los procesos de germinación de las esporas en algunos hongos filamentosos, por consiguiente la aplicación del quitosano de alto peso molecular demostró mejores resultados contra R. stolonifer (García-Rincón et al., 2010; Ramos-Guerrero et al., 2018). Esta mayor inhibición se relaciona con la capacidad que tienen los grupos amino (-NH2)+ presentes en las moléculas del quitosano para interactuar con las cargas negativas de la membrana celular de la espora, causando cambios en su permeabilidad y alteraciones a nivel intracelular dificultando el proceso de germinación (González-Estrada et al., 2020). No se observaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre las combinaciones del extracto acuoso con el quitosano.
La germinación de las esporas es considerada como la etapa más importante en la infección y propagación de un patógeno fúngico (Cortés-Rivera et al., 2019b), la inhibición de este proceso puede representar un daño importante sobre los mecanismos y estrategias de proliferación de R. stolonifer.
Modelo de crecimiento
La ecuación modificada de Gompertz mostró un buen ajuste en la descripción del desarrollo micelial de R. stolonifer sobre los diferentes tratamientos, observándose un coeficiente de determinación promedio (R2) de 0.997 ± 0.005 para ambas temperaturas de almacenamiento (15 oC/25 oC). Debido a que R. stolonifer presenta un crecimiento lineal a partir de 40 µm de longitud del tubo germinal, este modelo matemático puede determinar de manera adecuada las principales variables involucradas en la cinética de desarrollo de este patógeno (Nikkhah, Hashemi, Habibi & Farhoosh, 2017; Pitt & Hocking, 2009). El análisis estadístico demostró diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre las variables de velocidad máxima (V máx ) y el periodo de latencia (ƛ) dependiendo del tipo de tratamiento aplicado (Tabla II). Las concentraciones más altas de los EAC (10 %) y el QC (1.5 %) produjeron un mayor aumento sobre la fase de latencia (ƛ) del patógeno, así como una mayor reducción en la tasa de crecimiento máximo (V máx :); sin embargo, los tratamientos combinados de los EAC con el QC demostraron ser más efectivos al reducir estos parámetros al mínimo en ambas temperaturas de almacenamiento.
Tabla II Parámetros modificados del modelo de Gompertz para curvas de crecimiento de R. stolonifer expuesto a diferentes tratamientos y temperaturas.
| Tratamientos | Parámetros de Gompertz | |||||
| Vmáx (mm/h) | ƛ (h) | Variabilidad (R2 adj.) | ||||
| 15 oC | 25 oC | 15 oC | 25 oC | 15 oC | 25 oC | |
| Control | 0.067 ± 0.02a | 0.266 ± 0.09a | 1.271 ± 0.42a | 0.022 ± 0.01a | 0.991 | 0.994 |
| QC 0.5 % | 0.060 ± 0.01b | 0.230 ± 0.05c | 2.620 ± 0.61b | 0.825 ± 0.06b | 0.997 | 0.986 |
| QC 1 % | 0.057 ± 0.01b | 0.218 ± 0.04d | 2.818 ± 0.74c | 1.025 ± 0.09c | 0.996 | 0.981 |
| QC 1.5 % | 0.056 ± 0.01c | 0.212 ± 0.02d | 3.002 ± 0.83c | 1.193 ± 0.14c | 0.997 | 0.984 |
| EAC 1 % | 0.063 ± 0.02b | 0.245 ± 0.07b | 2.069 ± 0.64b | 0.692 ± 0.11b | 0.995 | 0.991 |
| EAC 5 % | 0.062 ± 0.02c | 0.239 ± 0.06b | 2.525 ± 0.41b | 0.766 ± 0.21b | 0.996 | 0.990 |
| EAC 10 % | 0.060 ± 0.01c | 0.228 ± 0.05c | 2.546 ± 0.31b | 0.954 ± 0.18b | 0.988 | 0.988 |
| QC 0.5 % + EAC 1 % | 0.057 ± 0.02c | 0.226 ± 0.09c | 2.640 ± 0.38c | 1.401 ± 0.23c | 0.996 | 0.983 |
| QC 1 % + EAC 5 % | 0.056 ± 0.01d | 0.217 ± 0.04d | 2.916 ± 0.42c | 1.945 ± 0.28d | 0.996 | 0.986 |
| QC 1.5 % +EAC 10 % | 0.054 ± 0.01e | 0.202 ± 0.01e | 3.020 ± 0.78c | 2.272 ± 0.33d | 0.998 | 0.982 |
Los valores seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes con un riesgo del 5 %. Promedio de diez réplicas ± desviación estándar. V máx : tasa de crecimiento específica máxima, ƛ: duración de la fase de latencia.
Existen pocos informes que describan el efecto de los antifúngicos orgánicos mediante modelos matemáticos, pero se conoce que la aplicación de activos naturales de manera combinada produce un mayor rango de acción sobre R. stolonifer al modificar los principales parámetros cinéticos asociados con su desarrollo micelial (ƛ,V máx ) (Ochoa-Velasco et al., 2017). Aunque los mecanismos asociados con la adaptación y el desarrollo de R. stolonifer al interactuar con los compuestosfenólicosnoseencuentrantotalmenteesclarecidos, estos podrían implicar afecciones sobre los mecanismos de transporte y/o cambios en los mecanismos celulares que conducen a la incorporación de proteínas y polisacáridos en la zona de extensión de la hifa (Suwanamornler, Sangchote, Chinsirikul, Sane & Chonhenchob, 2018). De igual forma, se sabe de la capacidad del quitosano para afectar variables como la tasa de crecimiento máxima de R. stolonifer, así como prolongar la fase de latencia (ƛ), debido a modificaciones en el plasma celular y alteraciones graves en la membrana, que conducen a un aumento en los periodos de adaptación y diferenciación del patógeno (Hernández-Lauzardo et al., 2008; García-Rincón et al., 2010).
La temperatura influyó en mayor medida sobre la dinámica de crecimiento de R. stolonifer, sin embargo, todos los tratamientos aplazaron la curva de desarrollo del patógeno (Figura 2), esta adaptación a temperaturas bajas y presencia de compuestos antifúngicos se podría deber a características morfológicas y estructurales como la presencia de hifas cenocíticas carentes de septos, capaces de permitir una translocación rápida de organelos y una mayor absorción de nutrientes, permitiendo el desarrollo de R. stolonifer en condiciones de estrés (Pitt & Hocking, 2009; Sardella, Gatt & Valdramidis, 2018). Los parámetros de crecimiento determinan el valor de su utilidad al evaluar la actividad antifúngica del QC y los EAC sobre los procesos de infección de R. stolonifer en frutos de guanábana.
Conclusiones
La combinación de los EAC con el QC produce un mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de las esporas en R. stolonifer, así como una mayor modificación en los parámetros cinéticos de crecimiento Vmáx y ƛ. Todos los tratamientos producen un efecto fungistático sobre R. stolonifer y las combinaciones de los tratamientos muestran un comportamiento sinérgico de manera in vitro, que pueden utilizarse en futuras evaluaciones contra la pudrición suave en la guanábana (A. muricata) y como una alternativa ecológica para la reducción de la patogenicidad y la virulencia de R. stolonifer.
